RP-HPLC同時(shí)測(cè)定維生素片中8種食用合成著色劑含量

汪明志 汪映宇 陳蓉 張超 張華鋒 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所 ，江蘇 蘇州 215104）

RP-HPLC同時(shí)測(cè)定維生素片中8種食用合成著色劑含量

汪明志 汪映宇 陳蓉 張超 張華鋒 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所 ，江蘇 蘇州 215104）

目的：建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定維生素片中8種合成著色劑的方法。方法：色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，7μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.02 mol/L乙酸銨，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果：8種著色劑在0.050～1.037μg/m L范圍內(nèi)峰面積和濃度線性關(guān)系良好（r＞0.999），平均回收率為94.09%～100.34%。結(jié)論：該方法穩(wěn)定，靈敏度高，方便，快速，可以作為檢測(cè)維生素片中合成著色劑的方法。

反相高效液相色譜；食用合成著色劑；維生素片；含量

維生素是維持機(jī)體正常代謝和身體健康必不可少的重要物質(zhì)，是構(gòu)成多種輔酶和激素的重要成分，缺乏時(shí)可導(dǎo)致代謝障礙，引發(fā)多種疾病。維生素片含有多種維生素，可以預(yù)防和治療維生素缺乏所引發(fā)的多種疾病。維生素片多為包衣片，包衣可以掩蓋片劑不良?xì)馕?、減少環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響、增加適用性、美化外觀等。隨著市場(chǎng)的激烈競(jìng)爭(zhēng)，為了吸引消費(fèi)者，生產(chǎn)商在包衣材料中加入各種不同顏色的著色劑。著色劑有天然著色劑和合成著色劑之分，由于天然著色劑價(jià)格高，性質(zhì)不穩(wěn)定，而合成著色劑性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)格低廉，所以市場(chǎng)中片劑包衣所用著色劑多為合成著色劑。然而，人工合成著色劑多以化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成，含有一定的有害物質(zhì)，影響人體正常新陳代謝、細(xì)胞活性、甚至引起癌變。所以，對(duì)維生素片包衣中合成著色劑進(jìn)行研究和分析，對(duì)保障人民健康具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）快速檢測(cè)維生素包衣片中常見8種食用合成著色劑含量，為控制和監(jiān)督維生素包衣片中合成著色劑使用提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，2996PDA檢測(cè)器，真空泵，G3垂熔漏斗，恒溫水浴鍋，pH計(jì)。

1.2 材料

檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)（純度分別為90.0%，87.0%，93.1%，70.0%，89.0%，88.0%，85.0%，91.0%，來源：Dr. Ehrenstorfer），聚酰胺粉（100目），甲醇（色譜純），檸檬酸，甲酸，乙醇，氨水，乙酸均為分析純，超純水。樣品：TCBJ多種維生素片、HJDD多種維生素片、FYD維生素片、KMS維生素片、ALD維生素片（均來自市場(chǎng)監(jiān)督抽樣）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，7μm），檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫：35℃，流速：1.0 m L/min，進(jìn)樣量：10μL，流動(dòng)相：甲醇（A）-0.02 mol/L乙酸銨（B），梯度洗脫，5 m in，A：5%，B：95%；5～10 m in，A：5%→15%，B：95%→85%；10～ 20 m in，A：15%→20%，B：85%→80%；20～ 25 m in，A：20%→65%，B：80%→35%；25～ 27 m in，A：65%，B：35%；27～ 32 m in，A：65%→95%，B：35%→5%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取按其純度折算成100%質(zhì)量的檸檬黃22.36 mg，日落黃23.77 mg，莧菜紅22.11 mg，胭脂紅29.37 mg，新紅23.03 mg，赤蘚紅22.90 mg，亮藍(lán)24.00 mg，靛藍(lán)22.80 mg，置20 m L容量瓶中，加pH值為 6的水到刻度，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液備用。

2.3 供試品溶液的制備

取維生素包衣片適量，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，放入 100 m L小燒杯中，用水反復(fù)洗滌色素，到試樣無色素為止，合并色素漂洗液為試樣溶液。試樣溶液加檸檬酸溶液調(diào)pH值到6，加熱至60℃，將1 g聚酰胺粉加少許水調(diào)成粥狀，倒入試液溶液中，攪拌片刻，以 G3垂熔漏斗抽濾，用60℃pH值為4的水洗滌3～ 5次，后用甲醇-甲酸混合溶液洗滌3～ 5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5m L，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，轉(zhuǎn)移至5 m L容量瓶中，定容至刻度，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)圖譜的制備

精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5 m L于100 m L量瓶中，加水定容至刻度，精密吸取10μL進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，得到色譜圖1。

圖1 8種合成著色劑的標(biāo)準(zhǔn)品RP-HPLC圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液 2 m L于100 m L量瓶中，加水稀釋定容至刻度，分別精密吸取 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0 m L于 100 m L量瓶中，用水定容至刻度，分別吸取 10μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，擬合回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，8種著色劑在0.050～ 1.037μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液 10μL進(jìn)入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測(cè)定5次，分別以檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)面積計(jì)算RSD分別為0.96%，0.45%，0.40%，0.37%，0.59%，2.48%，1.20%，0.42%。結(jié)果表明精密度良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別在0，2，4，12，24，48，72 h精密吸取“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別以檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)面積計(jì)算RSD分別為1.03%，0.75%，0.64%，0.71%，0.78%，2.78%，1.56%，0.72%。結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。

2.8 檢出限試驗(yàn)

精密吸取“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.05μL于100 m L量瓶?jī)?nèi)，加水定容至刻度，搖勻，精密吸取10μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算當(dāng)信噪比為3時(shí)，檢出濃度為檢出限。檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)的檢出限分別為 0.12，0.12，0.21，0.06，0.15，0.85，0.94，0.14 ng，本方法的最低檢出濃度分別為0.012，0.024，0.042，0.012，0.030，0.085，0.094，0.014 mg/kg。

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密吸取“2.4”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 60μL加入到陰性樣品漂洗液中，按供試品溶液制備方法，平行制備3份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，見表1。結(jié)果表明，本方法回收率在94.09% ～ 100.34%之間，能滿足分析要求的準(zhǔn)確性。

2.10 樣品測(cè)定

分別取5種保健食品維生素片，按“2.4”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中8種合成著色劑的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

通過二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，8種合成著色劑在不同的波長(zhǎng)下,吸收強(qiáng)度大小不同，綜合各種波長(zhǎng)下相應(yīng)結(jié)果，在254 nm波長(zhǎng)處8種合成著色劑均有較好的響應(yīng)值，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。由文獻(xiàn)[1-6]可知甲醇-乙酸銨為測(cè)定合成著色劑常用流動(dòng)相，通過改變甲醇-乙酸銨的比例來實(shí)現(xiàn)8種合成著色劑的分離度符合要求，最后選擇甲醇-0.02mol/L乙酸銨梯度洗脫，新紅保留時(shí)間為10.185m in，檸檬黃保留時(shí)間為11.352 min，莧菜紅保留時(shí)間為12.388 m in，靛藍(lán)保留時(shí)間為14.035 m in，胭脂紅保留時(shí)間為19.767 m in，日落黃保留時(shí)間為24.442m in，亮藍(lán)保留時(shí)間為27.015min，赤蘚紅保留時(shí)間為29.758 m in。各成分的分離度均大于1.5，符合分析要求。

3.2 提取方法的選擇

通過比較直接用水浸泡和粉碎后用水洗滌，發(fā)現(xiàn)粉碎后用水洗滌提取比較完全，因此選擇將維生素片粉碎后直接用水洗滌。為減少雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)成分的干擾，參考有關(guān)文獻(xiàn)，選擇用聚酰胺吸附色素，用甲醇-甲酸混合溶液除去天然色素干擾，再用乙醇-氨水-水混合溶液解吸目標(biāo)成分。

3.3 合成著色劑對(duì)人體的危害

合成著色劑采用人工化學(xué)合成的方法，主要通過從煤焦油中分離得到的苯胺燃料等作為原料，通過一系列化學(xué)反應(yīng)生成具有各種顏色的化學(xué)物質(zhì)，其中大多是偶氮類型化合物，多數(shù)偶氮類化合物可以在人體內(nèi)代謝生成具有毒副作用的物質(zhì)，過量食用將對(duì)人體健康造成一定危害。因此國(guó)家對(duì)合成著色劑的添加和食用制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，從安全角度來說，只要在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)許可范圍內(nèi)，就不會(huì)對(duì)健康造成危害，然而經(jīng)常食用添加著色劑的保健食品維生素片也會(huì)造成合成著色劑攝入過量。因此，廣大消費(fèi)者在購(gòu)買和使用保健食品維生素片時(shí)一定要注意其中是否添加合成著色劑，盡量選擇沒有添加合成著色劑的產(chǎn)品，從而減少合成著色劑的攝入。

3.4 結(jié)論

本文建立了RP-HPLC同時(shí)測(cè)定保健食品維生素片中8種合成著色劑的含量，該方法精密度、穩(wěn)定性良好，檢出限低，重現(xiàn)性好，能夠較好地應(yīng)用于維生素片中合成著色劑的測(cè)定，為維生素片的市場(chǎng)監(jiān)管和質(zhì)量控制提供了一定的技術(shù)支持，同時(shí)提醒消費(fèi)者對(duì)合成著色劑的關(guān)注。

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Simultaneous Determ ination of 8 Edible Synthetic Colorants in Vitam in Tablets by RP-HPLC

Wang M ingzhi，Wang Yingyu，Chen Rong，Zhang Chao，Zhang Huafeng，Gu Bingren（Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China）

Objective:To establish a method for simultaneous determ ination of 8 synthetic colorants in vitam in tablets by RP-HPLC.Methods:Chromatographic column C18（250 mm ×4.6 mm，7μm）was used and the mobile phase wasmethanol-0.02 mol/L ammonium acetate with gradient elution.The detection wavelength was at 254 nm.Results:There was a good linearity between the peak area and concentrations of 8 synthetic colorants w ithin the range of 0.050～1.037μg/m L（r＞ 0.999）,and the average recoveries were 94.09%～100.34%.Conclusion:The method is stable,sensitive,convenient and fast,and can be used as a method for the determ ination of synthetic colorants in vitam in tablets.

RP-HPLC；Edible Synthetic Colorant；Vitam in Tablet；Content

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.07.003

2015-03-10）

汪明志，男，中藥師。研究方向：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：2279792632@qq.com