克霉唑栓微生物限度檢查方法的驗證

張亞茹，陳莉莉，曹佳茜，趙肖肖

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克霉唑栓微生物限度檢查方法的驗證

張亞茹，陳莉莉，曹佳茜，趙肖肖

目的 探討克霉唑栓微生物限度方法學(xué)驗證。方法采用45 ℃ 1%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制備供試液，采用薄膜過濾法。結(jié)果各菌的回收率達到70%以上。結(jié)論該方法適合不同基質(zhì)的克霉唑栓微生物限度方法檢查。

克霉唑；微生物限度檢查；方法驗證

0 引言

克霉唑為廣譜抗真菌藥，對多種真菌，尤其是白色念珠菌有較強的抗菌作用。其作用機制是抑制真菌細胞膜的合成，以及影響其代謝過程。而克霉唑栓由于劑型特點，及其基質(zhì)的影響，更使其抑菌活性成分很難去除，回收率很難達到要求。故從供試液的制備、取樣量、沖洗液的體積、濾膜的選用等方面進行了考察。以適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ苿┲锌刮⑸镂镔|(zhì)的活性后，才能進行其微生物限度的檢查。本文對克霉唑栓微生物限度檢查方法進行試驗研究，以確定該藥物所用微生物限度檢查方法的有效可行。

1 儀器與材料

1.1 樣品名稱及來源 克霉唑栓(批號：131004，上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司)；克霉唑栓(批號：140401，武漢中聯(lián)藥業(yè)集團四藥藥業(yè)有限公司)；克霉唑栓(批號：130403，馬應(yīng)龍藥業(yè)集團有限公司)；克霉唑栓(批號：20140402，哈爾濱歐替藥業(yè)有限公司)。

1.2 實驗用品

1.2.1 驗證用菌種 枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]，以上菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2.2 培養(yǎng)基 膽鹽乳糖培養(yǎng)基，批號：130902；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，批號：121122；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號：1309272；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨溶液，批號：1211262；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號：1312182；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號：121218；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號：1302252；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號：1309022；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號：1107112；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，批號：110928。以上培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

1.2.3 儀器設(shè)備 32 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9272型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；25 ℃霉菌培養(yǎng)箱：MJP-150型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HQM.C型立式滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；電子天平：PL2002型梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，江蘇省金壇市宏華儀器廠；數(shù)顯恒溫水?。篐H-6型，常州國華電器有限公司。

1.2.4 微孔濾膜 A.材質(zhì)：尼龍，尺寸：直徑50 mm，性狀：親水性，孔徑：0.45 μm，廠家：杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司。B.材質(zhì)：混合纖維素酯，尺寸：直徑47 mm，性狀：親水性，孔徑：0.45 μm，廠家：杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司。C.進口CAT.NO:HVWP047S6 LOT.NO:F2PA66030 QTY:150PK，10元/膜。

2 驗證方法

2.1 驗證依據(jù) 《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ J微生物限度檢查法[1]。

2.2 菌液制備

2.2.1 取經(jīng)32 ℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物適量，加入到0.9%無菌氯化鈉溶液中，與標準比濁液濁度相當(dāng)，作為原液；取原液倍量稀釋至細菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，備用。

2.2.2 取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物適量，加入到0.9%無菌氯化鈉溶液中，與標準比濁液濁度相當(dāng)，作為原液；取原液倍量稀釋至酵母菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，備用。

2.2.3 取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加5 mL含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，取出霉菌孢子懸液倍量稀釋至霉菌數(shù)約為50～100 cfu/mL，備用。

2.3 供試液制備 稱取供試品10g，加45 ℃1%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，置恒溫振蕩器中震蕩使溶解，稍放置，取清液(無渣)作為1∶10的供試液，備用。

2.4 菌落計數(shù)方法[2]

2.4.1 常規(guī)法 取1∶10供試液清液1 mL和50～100 cfu試驗菌，分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基。按平皿法測定其菌落數(shù)。

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法 取1∶10供試液清液1 mL分別注入10個平皿中，同時加入50～100 cfu試驗菌，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基。按平皿法測定其菌落數(shù)。

2.4.3 薄膜過濾法 細菌計數(shù)：取1∶10供試液的清液1 mL，采用薄膜過濾法，沖洗量500 mL/膜，沖洗液為45 ℃ 1%吐溫80的0.1%蛋白胨水溶液，最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗菌。霉菌酵母菌計數(shù)：取1∶10供試液的清液1、0.5 mL，采用薄膜過濾法，沖洗量1 000 mL/膜，沖洗液為45 ℃ 1%吐溫80的0.1%蛋白胨水溶液，最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗菌。

2.5 回收率測定 試驗組：分別按上述菌落計數(shù)方法進行試驗組的菌落計數(shù)。計算供試液的平均菌落數(shù)。菌液組：測定每一株菌的試驗菌數(shù)。供試液對照組：取供試液1 mL，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。稀釋劑對照組：取稀釋劑1 mL和50～100 cfu試驗菌，按試驗組菌數(shù)測定方法測定其菌數(shù)。

2.6 控制菌檢查方法的驗證[3-4]

2.6.1 白色念珠菌(薄膜過濾法)試驗組：取1∶10供試液的清液10、5、2 mL，采用薄膜過濾法，沖洗量1 000 mL/膜，沖洗液為45 ℃ 1%吐溫80的0.1%蛋白胨水溶液，取膜放入100 mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，加入10～100 cfu試驗菌，25 ℃培養(yǎng)48～72 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48 h，必要時可延長至72 h。結(jié)果：按上述方法，10、5 mL未檢出試驗菌，2 mL檢出試驗菌，故此方法供試液取樣量2 mL可行。

2.6.2 金黃色葡萄球菌(薄膜過濾法)試驗組：取1∶10供試液的清液10 mL，采用薄膜過濾法，沖洗量500 mL/膜，沖洗液為45 ℃ 1%吐溫80的0.1%蛋白胨水溶液，取膜放入100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，再加入10～100 cfu試驗菌，32 ℃培養(yǎng)18～24 h，必要時可延長至48 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～72 h。結(jié)果：按上述方法，檢出試驗菌，方法可行。

2.6.3 銅綠假單胞菌(培養(yǎng)基稀釋法)試驗組：取1∶10供試液的清液10 mL和10～100 cfu試驗菌，加入到200 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)18～24 h，取培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24 h。結(jié)果：按上述方法，檢出試驗菌，方法可行。

3 結(jié)果

3.1 菌落計數(shù)及回收率測定 結(jié)果表明，在三次獨立的平行試驗中，常規(guī)法及培養(yǎng)基稀釋法回收率達不到要求，見表1、表2。采用薄膜過濾法，取樣量1 mL時，白色念珠菌的回收率<70%，而取樣量減小到0.5 mL時，白色念珠菌的回收率高于70%，見表3、表4。故細菌、霉菌、酵母菌菌落計數(shù)采用薄膜過濾法，但霉菌、酵母菌計數(shù)時、取樣量減小到0.5 mL進行。

表1 常規(guī)法菌落計數(shù)及回收率測定結(jié)果(cfu)

表2 培養(yǎng)基稀釋法菌落計數(shù)及回收率測定結(jié)果(cfu)

3.2 控制菌檢查 結(jié)果表明，采用薄膜過濾法和培養(yǎng)基稀釋法進行驗證，白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌陽性對照菌檢出。見表5。

3.3 根據(jù)驗證試驗結(jié)果確定克霉唑栓微生物限度檢查法

3.3.1 菌落計數(shù) 細菌計數(shù)可采用薄膜過濾法(1 mL供試液，500 mL沖洗液/膜)檢驗；霉菌及酵母菌計數(shù)可采用薄膜過濾法(0.5 mL供試液，1 000 mL沖洗液/膜)檢驗。

3.3.2 控制菌檢查 白色念珠菌采用薄膜過濾法(2 mL供試液，1 000 mL沖洗液/膜)；金黃色葡萄球菌采用薄膜過濾法(10 mL供試液，500 mL沖洗液/膜)；銅綠假單胞菌(培養(yǎng)基稀釋法培養(yǎng)基用量200 mL)檢驗。

表3 薄膜過濾法(取樣量1 mL)菌落計數(shù)及回收率測定結(jié)果(cfu)

表4 薄膜過濾法(取樣量0.5 mL)回收率測定結(jié)果(cfu)

表5 控制菌檢查結(jié)果

4 討論

4.1 供試液的制備 供試液制備完成后，如果取混懸狀態(tài)的供試液，白色念珠菌的回收率和控制菌的檢驗都達不到要求；制備完成后，稍放置，取中間的清液就能達到要求。

4.2 取樣量和沖洗液的量的選擇 細菌計數(shù)取1 mL，沖洗量500 mL/膜回收率就能達到要求；白色念珠菌取樣量0.5 mL，沖洗量1 000 mL/膜時，實驗菌的回收率才能達到要求。而控制菌只有銅綠假單胞菌可以用培養(yǎng)基稀釋法檢出陽性菌，白色念珠菌和金黃色葡萄球菌用薄膜過濾法，取樣量和沖洗液的量也做了考察，最后確定白色念珠菌取樣量2 mL供試液，1 000 mL沖洗液/膜；金黃色葡萄球菌取樣量10 mL，500 mL沖洗液/膜。

4.3 微孔濾膜的選擇 濾膜的過濾速度A

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄107.

[2] 繆玉萍.離心沉淀-培養(yǎng)基稀釋法檢查克霉唑陰道片微生物限度(細菌)[J].心理醫(yī)生(下半月版),2012,5:29-30.

[3] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:351.

[4] 周劍,王剛林.克霉唑陰道片微生物檢查方法學(xué)研究[J].中國藥業(yè),2013,22(22):57-59.

Verification of microbial limit examination for clotrimazole suppositories

ZHANG Ya-ru,CHEN Li-li,CAO Jia-xi,ZHAO Xiao-xiao

(Fuxin Institute for Food and Drug Control,Fuxin 123000,China)

Objective To establish the method of microbial limit examination for clotrimazole suppositories.MethodspH 7.0 sterile buffered sodium chloride-peptone solution with 1% tween-80 at 45 ℃ was used to make test solution.Filtration membrane method was used for the examination.ResultsThe recovery rate was more than 70%.ConclusionThis method is effective and feasible,it could be applied to the microbial limit examination for various matrix of clotrimazole suppositories.

Clotrimazole suppositories; Micro limit examination; Validation of the method

2014-12-02

阜新市藥品檢驗所，遼寧 阜新123000

10.14053/j.cnki.ppcr.201505023