常用類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型研究概況及展望

李艷玲，祁 芳，許 明，艾 坤，楊茜蕓*，劉 梨，張 泓

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

常用類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型研究概況及展望

李艷玲1，祁 芳1，許 明1，艾 坤1，楊茜蕓1*，劉 梨2，張 泓1

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，構(gòu)建和應(yīng)用合適的動(dòng)物模型是研究該疾病發(fā)病機(jī)制及治療的基礎(chǔ)，構(gòu)建復(fù)制接近人RA疾病特征的動(dòng)物模型尤為重要。近年來建立了不少RA動(dòng)物模型，主要有單純疾病動(dòng)物模型和病證結(jié)合動(dòng)物模型，但均存在各自的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，本文對(duì)近幾年常用的幾種RA動(dòng)物模型進(jìn)行研究，從制備方法、模型特點(diǎn)、發(fā)病機(jī)制、使用情況等方面對(duì)比其優(yōu)缺點(diǎn)，以期為今后研究更接近人RA疾病特征的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁﹨⒖肌?/p>

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；動(dòng)物模型；優(yōu)劣勢(shì)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因病機(jī)尚未完全清楚的慢性、炎性、多系統(tǒng)性自身免疫性疾病。其臨床特點(diǎn)為對(duì)稱性，多個(gè)關(guān)節(jié)慢性炎性持續(xù)反復(fù)發(fā)作，主要病理變化包括滑膜組織增生、血管翳形成及韌帶、骨和軟骨的結(jié)構(gòu)性損傷，最終引起整個(gè)關(guān)節(jié)僵硬導(dǎo)致功能喪失[1]。RA是常見的高致殘率疑難雜病之一，我國(guó)RA的患病率為0.32%～0.36%，女性患者約3倍于男性[2]。RA是全世界研究的熱點(diǎn)之一，作為科學(xué)的科研實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立有效的動(dòng)物模型是其關(guān)鍵[3]，許多專家學(xué)者在RA動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的過程中已建立多種動(dòng)物模型，但都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。本文現(xiàn)從近5年常用的幾種RA動(dòng)物模型的造模方法、特點(diǎn)、發(fā)病機(jī)制、使用情況等方面進(jìn)行研究，對(duì)比其優(yōu)缺點(diǎn)，以期為今后探索更接近人RA疾病特征的動(dòng)物模型提供參考。

1 單純疾病動(dòng)物模型

1.1 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis， CIA)動(dòng)物模型

CIA模型是Trentham等1977年最先創(chuàng)建的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎模型，并且發(fā)現(xiàn)約50%的RA患者血液中存在抗Ⅱ型膠原的自身抗體，提示Ⅱ型膠原可能誘導(dǎo)RA的產(chǎn)生，此后國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者采用該模型針對(duì)RA的病因機(jī)制、藥物篩選及治療等方面進(jìn)行了大量研究。目前已建立大鼠、小鼠CIA模型。

1.1.1 大鼠CIA模型 制備方法：將Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的冰醋酸中，制成2 g/L濃度，然后與完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑二者等體積混合制成乳化劑，使終質(zhì)量濃度為1 g/L。將乳化后的液體滴在水中后不擴(kuò)散且成形，視為乳化完全。于大鼠背部與尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射膠原乳化劑皮內(nèi)注射0.2 mL（含200μgⅡ型膠原）乳劑，7 d后加強(qiáng)免疫相等劑量乳劑1次，建立CIA模型[4-5]。

模型特點(diǎn)：初次致敏后，因炎癥作用，尾根注射部形成小潰瘍?cè)?，可?周內(nèi)自行結(jié)痂愈合。隨后大鼠前后足可出現(xiàn)不同程度的紅斑，再次加強(qiáng)免疫后關(guān)節(jié)紅腫進(jìn)一步加重，21 d左右足爪腫脹達(dá)高峰，后期大鼠表現(xiàn)為難以負(fù)重、活動(dòng)受限，部分大鼠出現(xiàn)足趾變形，并隨著關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)病大鼠毛色開始失去光澤，伴輕微脫毛，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，活動(dòng)減少[6-8]。

發(fā)病機(jī)制：CIA的產(chǎn)生和發(fā)展依賴于自身T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活，去除B細(xì)胞或T細(xì)胞，動(dòng)物都不能用Ⅱ型膠原免疫誘發(fā)關(guān)節(jié)炎病變[9]。研究表明，在CⅡ（CIA小鼠膠原）免疫的動(dòng)物中，T細(xì)胞可被自身和異種CⅡ特異性免疫反應(yīng)激活，從而介導(dǎo)遲發(fā)性超敏反應(yīng)，繼而激活B細(xì)胞，分泌炎性細(xì)胞因子。膠原抗體可形成的免疫復(fù)合物與補(bǔ)體相互作用，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。CD4+T細(xì)胞是CIA的主要調(diào)節(jié)因素，分泌細(xì)胞因子白介素17（IL-17），產(chǎn)生中性粒細(xì)胞及其他促炎因子，與CIA產(chǎn)生關(guān)系密切[10]。另外有研究表明，促炎介質(zhì)腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-1β在誘導(dǎo)CIA大鼠中起重要作用，并隨著CIA大鼠病程進(jìn)展血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平持續(xù)升高[11-12]。

1.1.2 小鼠CIA模型 制備方法：將CⅡ 4 mg/mL溶于0.05 mol/L冰醋酸中，與完全弗氏佐劑CFA等體積完全混合乳化，使終質(zhì)量濃度為1 g/L，小鼠尾根部皮內(nèi)注射50μL混合溶液，首次免疫后3周行第2次免疫，方法同第1次(佐劑換為弗氏不完全佐劑)，于小鼠尾根部皮下注射50μL混合溶液，進(jìn)行加強(qiáng)免疫[13-14]。

模型特點(diǎn)：開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹是在致敏后第29～32天，兩后足最先受累，進(jìn)而逐漸累及前足和尾部，第36～45天足腫脹達(dá)最高峰，然后逐漸減輕。小鼠毛色、精神狀態(tài)、糞便和體質(zhì)量等在21 d前無顯著變化，21 d后小鼠毛色開始失去光澤，輕微脫毛，體質(zhì)量增長(zhǎng)減慢甚至減輕，部分小鼠足趾關(guān)節(jié)、尾部出現(xiàn)化膿潰爛，但鼻、耳腫脹不明顯[15-17]。

發(fā)病機(jī)制：CIA小鼠病理進(jìn)程中，B淋巴細(xì)胞和作為軟骨組成成分的Ⅱ型膠原是CIA發(fā)生的關(guān)鍵，說明CIA是免疫性炎癥。T淋巴細(xì)胞促進(jìn)膠原特異性B淋巴細(xì)胞活化，誘導(dǎo)免疫的發(fā)生[18-19]，特異性膠原抗體與膠原蛋白結(jié)合，在關(guān)節(jié)部位形成復(fù)合物，激活補(bǔ)體。另外粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞募集到關(guān)節(jié)部位，導(dǎo)致免疫反應(yīng)進(jìn)一步激發(fā)，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-32介導(dǎo)免疫介質(zhì)，破壞骨和軟骨[20-22]。

1.2 佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）動(dòng)物模型

AA模型又稱弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎，是由細(xì)菌學(xué)家Freund創(chuàng)立，是RA動(dòng)物模型創(chuàng)建的基本方法。

造模方法：將熱滅活的結(jié)核分枝桿菌與礦物油研磨混勻，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配制成所需濃度，一次性經(jīng)尾根部皮下注射或足跖皮下注射CFA 0.1 mL致炎如果腫脹不明顯，可考慮加強(qiáng)免疫1次[23-24］。

模型特點(diǎn)：于致炎后9～12 d左右開始出現(xiàn)足趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度的紅腫，21 d左右達(dá)到高峰，表現(xiàn)為前后足腫脹，且進(jìn)行性加重，行動(dòng)不便，足趾皮膚發(fā)紅發(fā)亮，炎癥高峰期持續(xù)3～5 d，隨后有自愈傾向，發(fā)病過程中部分大鼠趾關(guān)節(jié)有化膿潰爛情況，耳和尾部出現(xiàn)“關(guān)節(jié)炎”小結(jié)，體溫身高，進(jìn)食減少，體質(zhì)量下降[25-26]。

發(fā)病機(jī)制：AA的發(fā)病原理主要是分子模擬理論。BCG來源的結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65（HSP65），與關(guān)節(jié)滑膜上自身抗原HSP60結(jié)構(gòu)相似，有高度相似的保守序列，同一株T細(xì)胞克隆可識(shí)別兩者。從而在結(jié)核分枝桿菌不斷刺激下，引起機(jī)體自身的免疫反應(yīng)[27-28]。

1.3 CIA與AA動(dòng)物模型的使用情況

通過對(duì)CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)的查詢，近五年使用CIA造模約521篇，逐年有增長(zhǎng)趨勢(shì)，但幅度不大；而AA近五年有534篇，每年使用情況相差不大。見表1。

表1 近5年CIA與AA動(dòng)物模型使用文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)（篇）

同時(shí)，還有許多其他單純型RA動(dòng)物模型，如軟骨低聚體基質(zhì)蛋白、卵蛋白、佐劑角叉菜膠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎等。但是這些模型一般用于特定的研究，因此每年使用情況不多，與CIA、AA比較差距很大?？梢钥闯鯟IA與AA目前仍然是最重要且發(fā)展較成熟的兩種RA動(dòng)物模型復(fù)制方法。

1.4 CIA與AA的優(yōu)缺點(diǎn)

1.4.1 CIA的優(yōu)缺點(diǎn) CIA的關(guān)節(jié)炎發(fā)病率比AA高，且CIA模型臨床癥狀、病理學(xué)更接近人RA[29]。不僅具有R A的急性病變外，還有一定的慢性病變特征，且操作方便簡(jiǎn)單，是目前國(guó)際上公認(rèn)的RA相關(guān)研究的最佳動(dòng)物模型[30]。然而它也有自身限制，不能描述病情的加重與緩解。目前大小鼠CIA模型制作沒有一個(gè)規(guī)范統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，如免疫劑量、免疫部位，是否加強(qiáng)免疫，何時(shí)加強(qiáng)免疫等都沒有統(tǒng)一規(guī)定，大多都是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要選擇。另外，國(guó)外進(jìn)口CⅡ價(jià)格昂貴，而國(guó)內(nèi)尚無批量生產(chǎn)。這些都說明CIA模型的局限性。

1.4.2 AA的優(yōu)缺點(diǎn) 此方法建立較早，簡(jiǎn)單易行、耗費(fèi)少，其病理表現(xiàn)也類似于人RA，是目前最經(jīng)典應(yīng)用最廣泛的RA模型復(fù)制方法。但該模型發(fā)病快、病程單一，缺乏慢性病理過程且在免疫學(xué)特征及病理生理學(xué)方面與人類RA存在一定的差異，病變具有一定自限性。另外，AA存在發(fā)病程度不均勻、模型復(fù)制率偏低等問題，影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。

2 病證結(jié)合動(dòng)物模型

在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域，近年來，根據(jù)RA臨床特征，許多學(xué)者在CIA、AA基礎(chǔ)上，結(jié)合西醫(yī)的病和中醫(yī)的證，創(chuàng)建了病證結(jié)合的RA模型。目前，常見的有風(fēng)寒濕痹癥模型、風(fēng)濕熱痹癥模型和腎虛痹癥模型。

2.1 AA、CIA模型基礎(chǔ)上的風(fēng)寒濕刺激模型

姜輝等[31]在SD大鼠右后足趾皮內(nèi)注射CFA 0.1 mL，并在造模當(dāng)天，將大鼠置于深為2 cm，溫度為5～7℃的冷水中，同時(shí)伴以4級(jí)風(fēng)力，每天1次，每次20 min，連續(xù)14 d。鎮(zhèn)蘭芳等[32]從大鼠首次注射CⅡ開始，每天在人工氣候箱內(nèi)[溫度：（6±2）℃，相對(duì)濕度：（90±4）%，風(fēng)力3級(jí)]，接受風(fēng)寒濕刺激1次，每次持續(xù)刺激4 h，連續(xù)30 d。

模型特點(diǎn)：本模型的制備，是在CIA、AA制備的基礎(chǔ)上，通過中醫(yī)風(fēng)寒濕的外因刺激而建立。體現(xiàn)了中醫(yī)風(fēng)寒濕痹證的發(fā)病病因及病理特點(diǎn)。但是目前在外界氣候環(huán)境、刺激時(shí)間及頻率等條件上尚無統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)病機(jī)制：風(fēng)、寒、濕可加重局部炎癥浸潤(rùn)的程度，它們能嚴(yán)重影響ESR、IL-17、CD44、AHR、Fas、FasL等的表達(dá)，并能加重滑膜細(xì)胞的增生。提示中醫(yī)痹證病因?qū)W說包含氣候條件和感染因素等。

2.2 AA、CIA模型基礎(chǔ)上的風(fēng)濕熱刺激模型

高慧琴等[33]以Wistar大鼠為對(duì)象建立AA模型，并將大鼠置于深為2 cm，溫度36～38℃熱水中，同時(shí)在37℃水浴恒溫?zé)嵴羝麠l件下熏蒸，伴以3檔風(fēng)力，每天1次，每次20 min，連續(xù)14 d。上述鎮(zhèn)蘭芳等[32]在接受首次CIA免疫的當(dāng)天開始，每天在人工氣候箱內(nèi) [相對(duì)濕度：（90±4）%，溫度：（33± 2）℃，風(fēng)力3級(jí)]接受風(fēng)濕熱刺激1次，且持續(xù)刺激4 h，連續(xù)30 d。

模型特點(diǎn)：本模型在AA或CIA的基礎(chǔ)上，采用中醫(yī)風(fēng)濕熱的外因刺激誘導(dǎo)模型，比單純AA或CIA模型有炎癥周期長(zhǎng)、模型穩(wěn)定的特點(diǎn)，但單純的風(fēng)濕熱外界刺激因素結(jié)合CIA、AA建立的模型，不能完全體現(xiàn)臨床風(fēng)濕熱痹癥多為風(fēng)寒濕證日久轉(zhuǎn)化而來的特點(diǎn)。

發(fā)病機(jī)制：持續(xù)高溫一方面可使血管擴(kuò)張、血管滲透性增大，導(dǎo)致膠體滲出增多；另一方面引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，致使免疫系統(tǒng)的變化。另外有研究表明，風(fēng)熱濕等外邪能加重CD44的表達(dá)，提示CD44可能參與了CIA的發(fā)生[32]。

2.3 腎虛痹證模型

根據(jù)臨床中醫(yī)認(rèn)為腎虛為RA發(fā)生的根本原因；同時(shí)結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為男性雄激素下降而雌激素升高，女性雌激素減少或者卵巢功能低下皆為腎虛的表現(xiàn)建立腎虛CIA模型。方法1[34-35]：摘除大鼠雙側(cè)卵巢或睪丸及其附近的脂肪組織，28 d后于尾根部皮下注射200μg經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原，此后第7天再次尾根部同法注射100μg CⅡ作為加強(qiáng)免疫；方法2：予羥基脲375 mg/(kg·d)連續(xù)灌胃17 d后，依上述方法建立CIA模型，最終復(fù)制成腎虛CIA模型。

模型特點(diǎn)：此模型是在中醫(yī)痹證發(fā)病的內(nèi)因?qū)W說基礎(chǔ)上建立，與單純的CIA模型相比，關(guān)節(jié)腫脹程度高，滑膜組織炎癥加重，軟骨損傷及骨的破壞均更為嚴(yán)重。此模型血清雌二醇水平下調(diào)，而血清Ca和TNF-α的含量則顯著增加。

發(fā)病機(jī)制：腎虛使類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率提高，不同的腎虛模型主要通過免疫系統(tǒng) (包括體液和細(xì)胞免疫)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(如性腺激素、腎上腺素)、骨代謝(如血清Ca等)來共同影響RA的病理變化。2.4 病證結(jié)合動(dòng)物模型的使用情況

通過對(duì)CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)的查詢，在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域，近五年風(fēng)濕熱、風(fēng)寒濕、腎虛痹癥動(dòng)物模型使用情況逐年增加，另外，還有一些其他病癥結(jié)合RA動(dòng)物模型，如脾虛痹證模型、氣虛血瘀模型等，但是這些模型一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究需要采用，因此每年使用情況不多。在中醫(yī)藥科研工作中，病癥結(jié)合模型是關(guān)鍵，是廣大科研工作者值得深思和探索的問題之一。

3 問題與展望

單純疾病RA動(dòng)物模型，特別是AA與CIA模型建立比較早，發(fā)展比較成熟，在臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和病理機(jī)制上，可通過具體數(shù)據(jù)、檢測(cè)指標(biāo)、切片等體現(xiàn)，且在臨床表現(xiàn)、病理、免疫上與人RA在有著相似或相近的特點(diǎn)，客觀性較強(qiáng)，是最常用的經(jīng)典模型，也是RA實(shí)驗(yàn)研究的重要手段，但依然不能完全反應(yīng)所有人RA的所有臨床特點(diǎn)，且其模型制備方法和條件缺乏相對(duì)統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)，存在一些缺陷。另外，在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域，這種模型復(fù)制方法無明顯的臨床病因?qū)W基礎(chǔ)，完全偏離了傳統(tǒng)的臨床辨證方式，未能反映出中醫(yī)辨證論治的特色。所以，探索一種經(jīng)濟(jì)方便、科學(xué)全面，與人RA特點(diǎn)更接近的動(dòng)物模型仍是今后自身免疫性關(guān)節(jié)炎模型研究的方向所在。

病證結(jié)合動(dòng)物模型，是在單純疾病動(dòng)物模型過程中融入中醫(yī)病因因素，建立所需的模型，運(yùn)用了中醫(yī)病因?qū)W說，也符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)RA病理特點(diǎn)，體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的特色，但此類模型存在的問題是，西醫(yī)的“病”與中醫(yī)“病”是兩個(gè)截然不同的概念。另外，人為施加的干預(yù)因素可能改變?cè)械膭?dòng)物模型，此類模型的穩(wěn)定性、可靠性值得質(zhì)疑。目前病因造模缺乏明確的判定標(biāo)準(zhǔn)，都是在多種干預(yù)因素之間沒有邏輯關(guān)系的情況下，強(qiáng)行疊加到一起，即“病+證”的“1+1”的模式，不滿足辨證論治是中醫(yī)對(duì)疾病的診斷和分類的這一基本原則，偏離了客觀性、科學(xué)性。為了獲得更好的能模擬臨床RA病人的病證結(jié)合動(dòng)物模型，需要充分考慮中醫(yī)病因?qū)W說，注重中醫(yī)臨床癥狀學(xué)和辨證論治，還需動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)證候?qū)傩?，來探尋一種具有中醫(yī)臨床辨證特點(diǎn)的RA病證結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

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（本文編輯 匡靜之）

General Situation and Prospect of the Commonly Used Rheumatoid Arthritis Animal M odels

LI Yanling1,QI Fang1,XU Ming1,AI Kun1,YANG Qianyun1*,LIU Li2,ZHANG Hong1
（1.College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

In the field of rheumatoid arthritis(RA)research，establishing and applying appropriate animal models are the study foundation of the pathogenesis and treatment for this disease.Moreover,constructing an RA animal model that similar to the human disease characteristics is particularly important.In recent years,numerous RA animal models including single disease models and integrated disease and syndrome models were built,all of them show advantages and disadvantages. This paper reviews these RA animal models on its advantages and disadvantages with the preparation methods,model features, pathogenesis and applying,and provides a reference for future exploration of RA animal model with more similar to human disease characteristics.

rheumatoid arthritis;animal models;advantages and disadvantages

R684.3；R24

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.020

2014－11－14

國(guó)家自然科學(xué)青年基金(81303048)；湖南省科技廳科技計(jì)劃一般項(xiàng)目(2014SK3046)；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(14C0854)。

李艷玲，女，在讀碩士研究生，研究方向：經(jīng)脈與臟腑相關(guān)規(guī)律及機(jī)制研究。

*楊茜蕓，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：5787162@qq.com。