補(bǔ)肝健腰方對腰椎間盤退變大鼠髓核組織TNF-α、IL-1β干預(yù)作用的研究

仇湘中，蔣盛昶，張信成，嚴(yán) 敏，唐 皓，蔣益蘭*，王 威

（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

補(bǔ)肝健腰方對腰椎間盤退變大鼠髓核組織TNF-α、IL-1β干預(yù)作用的研究

仇湘中，蔣盛昶，張信成，嚴(yán) 敏，唐 皓，蔣益蘭*，王 威

（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

目的觀察補(bǔ)肝健腰方對腰椎間盤退變大鼠髓核組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)表達(dá)的干預(yù)作用，探討補(bǔ)肝健腰方防治腰椎間盤退變的療效機(jī)制。方法40只10月齡SD大鼠隨機(jī)分為造模組30只、假手術(shù)組10只；采用纖維環(huán)穿刺法建立椎間盤退變模型，造模組造模成功后隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)肝健腰方組、布洛芬組，每組各8只。造模成功給藥6周后檢測大鼠髓核組織TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平。結(jié)果模型組腰椎間盤髓核組織TNF-α、IL-1β表達(dá)較假手術(shù)組增高，差異均有非常顯著性意義（P＜0.01）；補(bǔ)肝健腰方組腰椎間盤髓核組織TNF-α、IL-1β的含量均低于模型組，差異均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；布洛芬組腰椎間盤髓核組織IL-1β的含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論補(bǔ)肝健腰方可能是通過抑制大鼠退變腰椎間盤髓核組織中致炎因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)來減輕腰椎間盤的退行性改變。

腰椎間盤退變；補(bǔ)肝健腰方；腫瘤壞死因子-α；白介素-1β；大鼠

補(bǔ)肝健腰方是我院骨傷科臨床用于治療腰椎間盤突出癥及椎間盤源性腰痛的有效經(jīng)驗(yàn)方[1-2]，為探明其機(jī)制，本文基于大鼠腰椎間盤退變模型，探討補(bǔ)肝健腰方對退變腰椎間盤組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)的干預(yù)作用，現(xiàn)將方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD大鼠40只，雌雄兼用，體質(zhì)量250～300 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(湘)2012-0027。

1.1.2 藥物 補(bǔ)肝健腰方處方來源于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院骨傷科，藥物組成：炒棗仁20 g，當(dāng)歸10 g，川芎12 g，延胡索20 g，白芍20 g，熟地黃20 g，木瓜20 g，杜仲20 g，蜈蚣4 g，全蝎6 g，甘草6 g，藥物均購于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，常規(guī)煎煮，冰箱內(nèi)冷藏48 h，將冷藏液離心，上清液濾過，得混懸藥液濃度為含生藥21.6 g/ 10 mL，5℃保存?zhèn)溆?。陽性對照藥物布洛芬，由中美史克公司生產(chǎn)，規(guī)格為每粒0.3 g，配制成含生藥10.7 mg/10 mL混懸液，批號：20110901，國藥準(zhǔn)字H10900089。

1.1.3 主要試劑 青霉素鈉注射劑：80萬U/支，華北制藥股份有限公司，批號：F2503426。0.9%氯化鈉注射液：國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號：1207301-031。滅菌注射用水：國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號：1204514-B11。

1.1.4 主要儀器 HM335E型切片機(jī)，德國MICROM公司；AP280-123型包埋機(jī)，德國MICROM公司；Eclipse.E2OO型光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司；透射電子顯微鏡JEM-1230型，日本電子公司；微型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器設(shè)備廠；Multiskan MK3型酶標(biāo)檢測儀，芬蘭雷勃公司；解剖顯微鏡：K-400L麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)中國有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為造模組30只、假手術(shù)組10只。

1.2.2 造模方法 采用纖維環(huán)針刺法[3]復(fù)制動物模型。10%水合氯醛(3 mL/kg）腹膜內(nèi)麻醉，剪毛、左側(cè)臥位固定大鼠、消毒、鋪無菌巾。取右腹后外側(cè)正中切口長約2 cm，腹外斜肌與背肌之間剪開，腹膜外入路到達(dá)椎體右側(cè)方，依據(jù)髂嵴定位(平L6椎體)，暴露L3-4、L4-5、L 5-6椎間隙，用16 G穿刺針頭，由椎間盤纖維環(huán)前外側(cè)方平行終板，與脊柱矢狀面呈約450角方向刺入L4-5，深度控制在2.3 mm,行全層針刺，維持10 s后拔針,術(shù)畢逐層縫合創(chuàng)口。假手術(shù)對照組：僅切開皮膚后縫合。并連續(xù)3 d各組大鼠均腹腔注射青霉素鈉鹽20萬 U/kg，每天1次，以預(yù)防切口感染。術(shù)后各組大鼠在23～25℃環(huán)境中，同等正常條件下單籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)6周。

1.2.3 給藥方法 造模成功單籠常規(guī)飼養(yǎng)6周后，開始灌胃給藥，中西藥服藥劑量按成人體質(zhì)量70 kg等劑量計(jì)算大鼠用藥劑量。補(bǔ)肝健腰方組：灌胃體積10 mL/kg，給藥劑量為3.9 g/（kg·d），連續(xù)6周；布洛芬組：灌胃體積10 mL/kg，給藥劑量為0.1 g/（kg·d），連續(xù)6周；模型組及假手術(shù)組則每日灌予同等量飲用水，連續(xù)6周。兩種藥物的總量均分早、晚兩次灌服。

1.2.4 標(biāo)本收集 給藥6周，末次給藥后12 h，所有大鼠均采用腹腔注射過量10%水合氯醛麻醉處死大鼠，沿上、下軟骨終板與椎體的交界面完整切取大鼠L4-5椎間盤，置于-80℃冰箱保存待測。

1.2.5 檢測指標(biāo)及方法 造模手術(shù)6周后，造模組和假手術(shù)對照組各隨機(jī)抽取2只大鼠進(jìn)行光鏡下椎間盤的組織形態(tài)學(xué)觀察，再各隨機(jī)抽取2只大鼠進(jìn)行電鏡下椎間盤的超微結(jié)構(gòu)觀察；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA)進(jìn)行TNF-α、IL-1β含量的測定，標(biāo)本送長沙維爾生物科技有限公司檢測。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用“±s”表示，方差齊采用單因素方差分析，若方差不齊采用Tamhane＇s T2，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模過程中大鼠死亡情況

造模期間死亡大鼠3只，其中假手術(shù)組1只，模型組2只。再采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模組造模成功大鼠24只分為模型組、補(bǔ)肝健腰方組、布洛芬組，每組各8只。

2.2 各組大鼠椎間盤超微結(jié)構(gòu)光鏡下觀察結(jié)果

假手術(shù)組（封三彩圖圖1-A）見椎間盤髓核結(jié)構(gòu)完整，纖維板菲薄，軟骨細(xì)胞規(guī)則增生，髓核處見軟骨細(xì)胞增生，依稀可辨髓核結(jié)構(gòu)，大鼠經(jīng)6周喂養(yǎng)，為16月齡大鼠，其椎間盤開始出現(xiàn)正常的輕度退變；模型組（封三彩圖圖1-B）纖維板基本被軟骨成分取代，排列不規(guī)則，還可見骨小梁形成,髓核結(jié)構(gòu)消失;布洛芬組（封三彩圖圖1-C）可見纖維板斷裂髓核部分水腫,周邊有軟骨細(xì)胞反應(yīng)性增生;補(bǔ)肝健腰方組（封三彩圖圖1-D）可見殘存的纖維板結(jié)構(gòu)，纖維板局灶性不規(guī)則軟骨增生,髓核結(jié)構(gòu)模糊可見。

2.3 各組大鼠椎間盤超微結(jié)構(gòu)電鏡下觀察結(jié)果

2.3.1 假手術(shù)組 可見正常的軟骨樣細(xì)胞,其細(xì)胞膜完整、光滑,細(xì)胞器正常；膠原原纖維平行排列、整齊、規(guī)則、縱橫交錯、大小及方向一致,可見明暗相同的周期性橫紋,著色均勻。膠原纖維未見交織在一起，無團(tuán)塊樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。未見到高電子密度細(xì)顆粒的鈣化點(diǎn)。見圖2-A。

2.3.2 模型組 細(xì)胞數(shù)量稀少，多數(shù)呈現(xiàn)不同程度的退變或死亡，較多膠原原纖維變性、交織在一起，扭結(jié)呈毛線團(tuán)或髓鞘狀，亦可見呈指紋狀結(jié)構(gòu)或堆聚成片塊狀，內(nèi)部含較高電子密度的細(xì)顆粒的鈣化點(diǎn)，邊緣變粗糙模糊，橫紋消失，內(nèi)部結(jié)構(gòu)亦模糊不清。見圖2-B。

2.3.3 布洛芬組 細(xì)胞數(shù)量較少，可找到存活的軟骨樣細(xì)胞，其細(xì)胞膜尚完整，細(xì)胞器基本正常，膠原原纖維排列較致密，方向欠規(guī)則，粗細(xì)不均，可見周期性橫紋，內(nèi)部少見含較高電子密度的細(xì)顆粒的類似鈣化點(diǎn)。見圖2-C。

2.3.4 補(bǔ)肝健腰方組 髓核細(xì)胞退變較輕，死亡細(xì)胞較少，可見基本正常的軟骨樣細(xì)胞及少量形態(tài)異常的軟骨樣細(xì)胞，存活的軟骨樣細(xì)胞甚至有增生現(xiàn)象，其細(xì)胞膜完整，細(xì)胞器基本正常；膠原原纖維有明顯、規(guī)則的橫紋，變性輕。見圖2-D。

圖2 各組大鼠椎間盤超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察結(jié)果圖（×5000）

2.4 各組大鼠腰椎間盤髓核組織中TNF-α、IL-1β含量比較

補(bǔ)肝健腰方組、布洛芬組、模型組腰椎間盤髓核組織TNF-α、IL-1β的含量均高于假手術(shù)組，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；補(bǔ)肝健腰方組腰椎間盤髓核組織TNF-α、IL-1β的含量均低于模型組，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；布洛芬組腰椎間盤髓核組織IL-1β的含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。補(bǔ)肝健腰方腰椎間盤髓核組織TNF-α、IL-1β的含量與布洛芬組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)6周后大鼠腰椎間盤髓核組織中TNF-α、IL-1β含量比較 （±s，ng/L）

表1 實(shí)驗(yàn)6周后大鼠腰椎間盤髓核組織中TNF-α、IL-1β含量比較 （±s，ng/L）

注：與假手術(shù)組組比較＃＃P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組補(bǔ)肝健腰方組布洛芬組n 5 8 8 8 TNF-α 3.24±1.67 12.13±2.39＃＃9.16±2.49＃?！鳌?0.87±2.56＃＃IL-1β 2.36±0.41 9.53±1.22＃＃7.63±1.51＃?！鳌?.02±1.37＃?！?/p>

3 討論

近年來中醫(yī)中藥辨證已廣泛應(yīng)用于椎間盤退變的治療[4]。椎間盤退變的病機(jī)不外虛實(shí)兩端，虛實(shí)夾雜，以虛為主。虛乃臟腑虛損，尤其肝虛是主要原因；實(shí)以風(fēng)、寒、濕外邪入侵、勞傷以及痰、瘀等病理產(chǎn)物為主。肝主筋，筋附骨，中年以上肝腎漸衰，肝虛則筋失滋榮，久則骨失所養(yǎng)，加之外傷及風(fēng)寒濕邪侵襲及外傷瘀血留著不去，經(jīng)絡(luò)不通、氣血痹阻，臟腑失養(yǎng)，久則骨質(zhì)變形，節(jié)攣筋縮而發(fā)病。根據(jù)中醫(yī)藥理論和多年臨床經(jīng)驗(yàn)，本課題組首次提出了“椎間盤源性腰痛從肝虛瘀阻論治”的觀點(diǎn)，組方補(bǔ)肝健腰方開展臨床研究，取得良好的效果[1-2]。方中炒棗仁“補(bǔ)中益肝，堅(jiān)筋骨，助陰氣”，有養(yǎng)肝、寧心之效，為君藥；熟地黃滋陰養(yǎng)血，杜仲甘溫補(bǔ)益，平補(bǔ)肝腎，潤肝燥，強(qiáng)腰脊，共為臣藥；當(dāng)歸補(bǔ)血養(yǎng)肝，白芍養(yǎng)血柔肝和營，川芎活血行氣，調(diào)暢氣血，蜈蚣辛溫走竄，通經(jīng)逐邪，有調(diào)達(dá)肝經(jīng)、通絡(luò)止痛之功，全蝎味辛，與蜈蚣配伍則通絡(luò)止痛之效倍增；延胡索活血、理氣、止痛，木瓜舒筋活絡(luò)共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用具補(bǔ)肝養(yǎng)血、活血通絡(luò)之效?，F(xiàn)代藥理研究也已證實(shí)，上述諸藥有抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)作用，可降低毛細(xì)血管通透性，改善微循環(huán)，消除神經(jīng)水腫及肌肉痙攣，增強(qiáng)人體抵抗力，緩解對神經(jīng)根的化學(xué)及自然免疫刺激等作用。

椎間盤退變是一個動態(tài)的復(fù)雜過程，引起退變的確切原因尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)椎間盤中的細(xì)胞因子在椎間盤退行性變的病理過程中發(fā)揮重要的作用，目前，已知的細(xì)胞因子有100多種，其中，IL-1、IL-6、TNF-α、NO等被公認(rèn)為是參與椎間盤退變的最重要的細(xì)胞因子[5]。研究顯示：TNF-α、IL-1與椎間盤退變關(guān)系密切[6]，有足夠的證據(jù)表明它們均參與椎間盤退變的過程[7]，且兩者參與椎間盤的退變過程有相同的增高趨勢[8]。大量研究表明：IL-1β通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，從而降解蛋白多糖；通過刺激分泌一氧化氮(NO)，抑制前列腺素(PG)的合成，而參與椎間盤退變所致神經(jīng)根痛的病理過程[9]；TNF-α可促使血管生成誘導(dǎo)因子如血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3、MMP-7及血漿酶的產(chǎn)生，從而使蛋白多糖減少，椎間盤組織被吸收[10]。

本研究通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)肝健腰方能抑制腰椎間盤髓核組織中TNF-α、IL-1β的表達(dá)，說明補(bǔ)肝健腰方對于機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子有調(diào)節(jié)作用，可抑制炎性物質(zhì)的釋放，也初步提示，補(bǔ)肝健腰方極有可能是通過抑制IL-1β、TNF-α的合成和分泌發(fā)揮其延緩椎間盤退變的作用。

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（本文編輯 匡靜之）

Study of the Intervention of Bugan Jianyao Decoction on TNF-αand IL-1β of the Nucleus Pulposus in Rats w ith Lumbar Disc Degeneration

QIU Xiangzhong，JIANG Shengchang,ZHANG Xincheng,YAN Min,TANG Hao,JIANG Yilan*,WANG Wei
（Affiliated Hospital of Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410006,China）

ObjectiveThe preventive effects of Bugan Jianyao decoction on TNF-αand IL-1βexpressions in rats with lumbar spine degeneration were observed.The efficacy mechanization of the Bugan Jianyao decoction in treatment of lumbar disc degeneration was explored.Methods40 10-month-old SD rats were random ly divided into model group and the sham-operation group,with 30 and 10 respectively.The lumbar spine degeneration models were established by annulus puncture.After the successful modeling,the rats were random ly divided into model group,Bugan Jianyao decoction group and ibuprofen group,with 8 in each group.The expression levels of TNF-α,IL-1βin nucleus pulposus of lumbar disc tissue were detected after six-month administration.ResultsThe expression of TNF-α,IL-1βin nucleus pulposus of lumbar disc in the model group was increased compared with sham-operation group,and the differences were very significant(P<0.01);the expression of TNF-α,IL-1βin nucleus pulposus of the lumbar disc in Bugan Jianyao decoction group were lower than the model group,and the differences were statistically significant(P<0.01);The level of IL-1βin the ibuprofen group was lower than the model group,and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionBugan Jianyao decoction can reduce degenerative changes in the lumbar intervertebral disc by inhibition TNF-αand IL-1βin nucleus pulposus of the lumbar disc of rats.

lumbar disc degeneration；Bugan Jianyao decoction;TNF-α;IL-1β;rats

R285；R681.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.005

2014－10－26

湖南省科技廳科研基金（2014SK3049）；湖南省教育廳科研基金（14C0865）；湖南省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金（2010055）。

仇湘中，主任醫(yī)師，教授，第五批全國名老中醫(yī)學(xué)術(shù)思想繼承指導(dǎo)老師，第三批湖南省名中醫(yī)，主要從事中醫(yī)骨傷科臨床、科研、教學(xué)工作。

*蔣益蘭，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：2267811679@qq.com。