RNA干擾Fbxw8基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

馮金發(fā) 戴 猛 張浩梁 金龍 楊 勇 楊澤利 孫 侃

黑龍江省醫(yī)院普外科，黑龍江哈爾濱150000

RNA干擾Fbxw8基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

馮金發(fā) 戴 猛 張浩梁 金龍 楊 勇 楊澤利 孫 侃▲

黑龍江省醫(yī)院普外科，黑龍江哈爾濱150000

目的探討靶向抑制Fbxw8基因?qū)Y(jié)腸癌SW 480細(xì)胞增殖的影響。方法RNA干擾（RNAi）方法下調(diào)SW 480細(xì)胞中Fbxw8的表達(dá)。通過Real-time PCR、western blotting方法分別檢測(cè)Fbxw8mRNA和蛋白表達(dá)變化；CCK-8、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及BrdU摻入法檢測(cè)下調(diào)Fbxw8對(duì)SW 480細(xì)胞的增殖、DNA合成能力的影響。Western blotting檢測(cè)下調(diào)Fbxw8對(duì)SW480細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果Fbxw8 siRNAs顯著降低SW480細(xì)胞Fbxw8 mRNA和蛋白的表達(dá)，CCK-8結(jié)果顯示：與對(duì)照組（0.78±0.11）相比，兩對(duì)Fbxw8 siRNAs均可顯著抑制細(xì)胞的生長（0.46±0.07、0.49±0.03，P＜0.05）；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比，F(xiàn)bxw8 siRNAs組細(xì)胞的克隆形成數(shù)目及大小顯著降低。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組（0.83±0.12）相比，F(xiàn)bxw8 siRNAs均能顯著下調(diào)DNA的合成能力（0.47±0.06、0.56±0.09，P＜0.05）；同時(shí)伴隨著細(xì)胞周期蛋白cyclin E的下調(diào)而p27的表達(dá)升高。結(jié)論Fbxw8 siR NA可以通過下調(diào)cyclin E、上調(diào)p27的表達(dá)而有效抑制SW480細(xì)胞增殖，為結(jié)腸癌的基因治療提供新的候選靶點(diǎn)。

結(jié)腸癌；SW 480；Fbxw8；細(xì)胞增殖；Cyclin E；p27

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，每年在世界范圍內(nèi)占新發(fā)腫瘤的第3位[1]。近年來，我國的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。大多數(shù)結(jié)腸癌患者就診時(shí)已有轉(zhuǎn)移病灶，術(shù)后必須輔以化療。但迄今為止，由于結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，而使大多數(shù)化療藥物的療效有限。因此臨床上急需尋找結(jié)腸癌基因治療的靶點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖在癌癥進(jìn)程過程中具有重要作用，而結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性增殖機(jī)制目前尚不完全明確[3]。Fbxw8作為F-box蛋白，可與Skp1、Cullin7及ROC1形成CUL7/Fbxw8 E3連接酶，特異性識(shí)別并降解胰島素受體底物-1（IRS-1），從而成為調(diào)控生長的重要分子[4-7]。研究表明，下調(diào)Fbxw8表達(dá)可顯著抑制絨癌細(xì)胞JEG-3及胰腺癌細(xì)胞的增殖功能，但Fbxw8對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖功能的影響未見報(bào)道[8]。本研究將以結(jié)腸癌細(xì)胞SW480為研究對(duì)象，通過靶向抑制此細(xì)胞中Fbxw8的表達(dá)，觀察Fbxw8對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響，闡明Fbxw8對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW 480細(xì)胞增殖的影響之一是通過調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)分子cyclin E和p27基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購自ATCC，RPMI1640液體培養(yǎng)基及胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品，Cell Counting Kit-8為日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；BrdUrd試劑盒購自Roche公司，F(xiàn)bxw8 siRNA，lipofectamineTM2000，Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄、real-time PCR反應(yīng)系統(tǒng)、SYBY熒光定量試劑盒購于TakaRa公司，基因引物為上海生工生物工程有限公司提供，F(xiàn)bxw8抗體為Abcam公司產(chǎn)品、cyclin E抗體、p27抗體、β-actin抗體購自Santa Cruz公司，羊抗兔、羊抗鼠IgG/HRP及western blotting相關(guān)試劑購于普利萊公司。Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成為2對(duì)由25個(gè)堿基組成的Fbxw8 StealthTM siRNA序列：Fbxw8 siRNA1：5′-CCGAAACUGGUUCAGUACCUUGAAA-3′；Fbxw8 siRNA2：5′-CAGUAGCAGCUUAUGAGGAUGGGUU-3′。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液，其中含有10%胎牛血清、青霉素100μg/mL、鏈霉素100μg/mL。細(xì)胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于35mm或60 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24 h，細(xì)胞匯合度達(dá)到30%～50%時(shí)，應(yīng)用無血清RPMI1640培養(yǎng)液配制終濃度為50 nM的Fbxw8 siRNA，按照Lipo fectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染6 h后棄去轉(zhuǎn)染液換為正常培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分三組：陰性對(duì)照組（CTL），F(xiàn)bxw8 siRNA1組，F(xiàn)bxw8 siRNA2組。

1.2.2 Rea l-t ime PCR檢測(cè)Fbxw8 mRNA表達(dá)水平細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，應(yīng)用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA后進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。檢測(cè)Fbxw8的引物序列為：5′-GGATCCAGTAGATGCGTATGG-3′（Forword），5′-CAGGAGTGTCTGGAATTGTC-3′（Reverse）；β-actin的引物序列為：5′-TACCTCATGAAGATCCTCACC-3′（Forword），5′-TTT CGTGGATGCCACAGGAC-3′（Reverse）。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s，然后95℃5 s，60℃30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過CT值法（2-△△CT）進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.3 Wes t e r n b l o t檢測(cè)Fbxw8蛋白表達(dá)水平細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72 h，RIPA細(xì)胞裂解液抽提各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量。12%SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗Fbxw8（1∶500）、cyclinE（1∶1 000）、P27（1∶1 000）和β-actin（1∶2000），4℃反應(yīng)過夜，TBST充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，1∶2000稀釋。室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入發(fā)光底物ECL，在暗室內(nèi)曝光顯影固定。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活能力對(duì)數(shù)生長期SW480細(xì)胞以1×103個(gè)/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板，37℃，5%的CO2中培養(yǎng)過夜，然后分別轉(zhuǎn)染CTL或Fbxw8 siRNAs。轉(zhuǎn)染后48 h每孔分別加入10μLCCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm光波檢測(cè)每孔吸光度。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)數(shù)生長期SW480細(xì)胞1×103接種于96孔板中，按前述方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，消化細(xì)胞，分別接種于6孔板中（100個(gè)/孔），使細(xì)胞分散均勻，將6孔板移到培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)2周，直到孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。應(yīng)用甲醇溶液固定細(xì)胞，結(jié)晶紫溶液染色，將6孔板放在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6 Br dU比色法檢測(cè)細(xì)胞DNA合成能力對(duì)數(shù)生長期SW480細(xì)胞1×103接種于96孔板中，按前述方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后72 h用BrdUrd標(biāo)記，37℃孵育3 h；應(yīng)用試劑盒帶有的緩沖液沖洗3遍；應(yīng)用抗BrdUrd的抗體在25℃孵育1.5 h；加入substrate solution作用0.5 h；加入封閉溶液（1M硫酸）；應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的OD450 nm可吸收光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Fbxw8 siRNAs顯著降低SW480細(xì)胞Fbxw8mRNA和蛋白的表達(dá)，CCK-8結(jié)果顯示：與對(duì)照組（0.78± 0.11）相比，兩對(duì)Fbxw8 siRNAs均可顯著抑制細(xì)胞的生長（0.46±0.07、0.49±0.03，t=2.532，t=2.643，P＜0.05）；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：與對(duì)照組相比，F(xiàn)bxw8 siRNAs組細(xì)胞的克隆形成數(shù)目及大小顯著降低。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示：與對(duì)照組（0.83±0.12）相比，F(xiàn)bxw8 siRNAs均能顯著下調(diào)DNA的合成能力（0.47±0.06、0.56±0.09，t=2.632，t=2.236，P＜0.05）；同時(shí)伴隨著細(xì)胞周期蛋白cyclin E的下調(diào)而p27的表達(dá)升高。

2.1 SW 480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Fbxw8 siRNAs后Fbxw8的mRNA和蛋白的表達(dá)

Fbxw8 siRNA 1，2分別轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞。Realtime PCR和western blotting結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（CTL）siRNA細(xì)胞相比，兩對(duì)Fbxw8 siRNAs都可顯著抑制SW 480細(xì)胞中Fbxw8 mRNA及蛋白表達(dá)水平（圖1 A、B和C）。

圖1 Real-time PCR和western blotting法檢測(cè)轉(zhuǎn)染Fbxw8siRNAs對(duì)Fbxw8 m RNA和蛋白表達(dá)的影響

2.2 靶向抑制Fbxw8表達(dá)對(duì)SW 480細(xì)胞生存活力的影響

我們利用CCK-8法檢測(cè)下調(diào)Fbxw8的表達(dá)對(duì)SW 480細(xì)胞生存活力的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，兩對(duì)Fbxw8 siRNAs均可顯著抑制SW480細(xì)胞的存活能力（圖2）。

圖2 靶向Fbxw8基因siRNAs對(duì)SW 480細(xì)胞生存活力的影響

2.3 靶向抑制Fbxw8表達(dá)對(duì)SW 480細(xì)胞克隆形成能力的影響

我們利用克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)下調(diào)Fbxw8表達(dá)對(duì)SW 480細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)bxw8 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞集落顯著減少，而且集落相對(duì)較小（圖3）。

圖3 靶向Fbxw8基因siRNAs對(duì)SW 480細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.4 靶向抑制Fbxw8表達(dá)對(duì)SW 480細(xì)胞DNA合成能力的影響

為了進(jìn)一步探討Fbxw8對(duì)細(xì)胞增殖的影響，我們利用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)Fbxw8的表達(dá)對(duì)SW 480細(xì)胞DNA合成能力的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，兩對(duì)Fbxw8 siRNAs均可顯著抑制SW 480細(xì)胞的DNA的合成，從而降低細(xì)胞的增殖能力（圖4）。

圖4 靶向Fbxw8基因siRNAs對(duì)SW 480細(xì)胞DNA合成能力的影響

2.5 靶向抑制Fbxw8表達(dá)對(duì)SW 480細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

我們利用western blotting方法檢測(cè)下調(diào)Fbxw8表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞cyclinE和p27表達(dá)的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，兩對(duì)Fbxw8 siRNAs均可降低cyclinE的表達(dá)，而p27的表達(dá)明顯升高（圖5）。

3 討論

結(jié)腸癌作為癌癥相關(guān)疾病死亡的主要疾病之一，近年來，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖在腫瘤進(jìn)展中具有重要作用，從分子水平探尋癌細(xì)胞生長的機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。

圖5 靶向Fbxw8基因siRNAs對(duì)SW 480細(xì)胞cyc linE及p27蛋白表達(dá)的影響

Fbxw8是SCF-like泛素E3連接酶（SCF Skp1-Cul7-Fbxw8）的重要組分，其可識(shí)別并將底物蛋白泛素化，進(jìn)而泛素化蛋白質(zhì)在蛋白酶體中降解[9]?；蚯贸鼺bxw8小鼠表現(xiàn)為胎盤異常及生長受限，提示其與生長相關(guān)[6，10]。研究表明，靶向抑制絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞Fbxw8表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞的增殖能力，MiR-218也可通過靶向調(diào)控Fbxw8的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)絨毛膜癌細(xì)胞的生長[11]。本實(shí)驗(yàn)選擇結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)Fbxw8表達(dá)，利用CCK-8法、BrdU摻入法及細(xì)胞克隆形成能力試驗(yàn)表明靶向抑制Fbxw8的表達(dá)可抑制SW480細(xì)胞的增殖。研究表明，p27是與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的蛋白，作為細(xì)胞周期依賴性激酶的抑制蛋白（cyclin-dependent kinase inhibitors，CDIs），可與細(xì)胞周期蛋白/細(xì)胞周期蛋白激酶（CDK）復(fù)合體結(jié)合，從而抑制復(fù)合體活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[12，13]。在許多腫瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)p27的表達(dá)下調(diào)，且此種改變與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖密切相關(guān)[14，15]。為了明確靶向抑制Fbxw8下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞的機(jī)制，我們?cè)贔bxw8表達(dá)下調(diào)的SW480細(xì)胞中檢測(cè)p27的表達(dá)，結(jié)果顯示p27的表達(dá)明顯升高。研究表明，p27蛋白是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的。E3連接酶Skp2可識(shí)別并泛素化降解p27[16]。本研究顯示，在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞中，下調(diào)Fbxw8表達(dá)可增加p27蛋白的表達(dá)，那么作為E3連接酶，F(xiàn)bxw8下調(diào)p27是否為蛋白酶體依賴，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

[1]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2015[J]. CA：ACancer Journal For Clinicians，2015，65：5-29.

[2]王寧，孫婷婷，鄭榮壽，等.中國2009年結(jié)直腸癌發(fā)病和死亡資料分析[J].中國腫瘤，2013，22（7）：515-520.

[3]Liu K，Zhao H，Yao H，et al.MicroRNA-124 regulates the proliferation of colorectal cancer cellsby targeting iASPP[J]. Bio Med Research International，2013.

[4]Xu X，Sarikas A，Dias-Santagata DC，et al.The CUL7 E3 ubiquitin ligase targets insulin receptor substrate 1 for ubiquitin-dependent degradation[J].Mol Cell，2008，30：403-414.

[5]Ponyeam W，Hagen T.Characterization of the Cullin7 E3 ubiquitin ligase-heterodimerization of cullin substrate receptors as a novelmechanism to regulate cullin E3 ligase activity[J].Cell Signal，2012，24：290-295.

[6]Tsunematsu R，Nishiyama M，Kotoshiba S，et al.Fbxw8 is essential for Cul1-Cul7 complex formation and for placentaldevelopment[J].Molecularand CellularBiology，2006，26（16）：6157-6169.

[7]Jin J，Cardozo T，Lovering RC，et al.Systematic analysis and nomenclature ofmammalian F-box proteins[J].Genes Dev，2004，18：2573-2580.

[8]Lin P，F(xiàn)u J，Zhao B，et al.Fbxw8 is involved in the proliferation of human choriocarcinoma JEG-3 cells[J].Molecular Biology Reports，2011，38（3）：1741-1747.

[9]Okabe H，Lee SH，Phuchareon J，et al.A critical role for FBXW8 and MAPK in cyclin D1 degradation and cancer cell proliferation[J].Plo SOne，2006，1（1）：e128.

[10]Tsutsumi T，Kuwabara H，Arai T，et al.Disruption of the Fbxw8 gene results in pre-and postnatal growth retardation in mice[J].Molecular and Cellular Biology，2008，28（2）：743-751.

[11]Shi D，Tan Z，Lu R，et al.Micro RNA-218 inhibits the proliferation of human choriocarcinoma JEG-3 cell line by targeting Fbxw8[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，450：1241-1246.

[12]Cai K，Dynlacht BD.Activity and nature of p21（WAF1）complexes during the cell cycle[J].Proc Natl Acad Sci U SA，1998，95：12254-12259.

[13]Ogryzko VV，Wong P，Howard BH.WAF1 retards S-phase progression primarily by inhibition of cyclin-dependent kinases[J].Mol Cell Biol，1997，17：4877-4882.

[14]EgilmezR，Elagoz S，Kanik EA.Cdk1/P34Cdc2 and P21waf expression in colorectal adenomas and carcinomas[J].J Exp Clin Cancer Res 20：549-552，2001.

[15]Stein JP，Ginsberg DA，Grossfeld GD，et al：Effect of p21WAF1/CIP1 expression on tumor progression in bladder cancer[J].JNatl Cancer Inst，1998，90：1072-1079.

[16]Carrano AC，Eytan E，Hershko A，et al.SKP2 is required for ubiquitin-mediated degradation of the CDK inhibitor p27[J].Nature Cell Biology，1999，1（4）：193-199.

Effect of siRNA targeted against Fbxw8 on cell proliferation of colon cancer cells

FENG Jinfa DAIMeng ZHANG Hao LIANG Jinlong YANG Yong YANG Zeli SUN Kan
Department of General Surgery,Heilongjiang Hospital,Haerbin 150000,China

ObjectiveTo study the effect of siRNA targeted against Fbxw8 on cell proliferation of colon cancer SW480 cells.M ethodssiRNAs targeting Fbxw8 were transfected into SW 480 cells by lipofectaminemethod.The expression of Fbxw8mRNA and protein were detected by real-time PCR and western blotting respectively.Changes in cell proliferation and DNA synthesisweremeasured by CCK-8 and clone formation assay，bromodeoxyuridine（BrdU）incorporation. In addition，changes in expression of proliferation associated genes were studied by western blotting.ResultsTwo Fbxw8 siRNAs decreased the expression of Fbxw8 mRNA and protein level，compared with the control group(0.78± 0.11),knockdown of Fbxw8 caused inhibation of cell proliferation（0.46±0.07，0.49±0.03，P＜0.05）.Fbxw8 knockdown cells generated less numbers of colonies and formed significantly smaller colonies than the control group.BrdU test showed that compared the control group(0.83±0.12),Fbxw8 siRNAs downregulated the DNA synthesis（0.47±0.06，0.56±0.09，P＜0.05）.Westren blotting showed that cyclin E was down-regulating and p27 was up-regulating.ConclusionKnockdown of Fbxw8 can reduce proliferation of SW 480 cells through down-regulation of cyclin E and up-regulation of p27 protein，F(xiàn)bxw8 hasa potential value in gene therapy of colon cancer.

Colon cancer；SW480；Fbxw8；Cell proliferation；Cyclin E；p27

R735.3+5

A

1673-9701（2015）36-0025-04

2015-11-13）

黑龍江省留學(xué)歸國科學(xué)基金（LC2012C30）；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題（2012-374）

▲通訊作者