舟形藻在假單胞菌菌膜上的附著及對(duì)316L不銹鋼腐蝕的影響

管 方，翟曉凡，段繼周，張 杰，侯保榮

（1.中國科學(xué)院海洋研究所 海洋環(huán)境腐蝕與生物污損重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島266071；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

海洋生物污損是伴隨著人類的海洋開發(fā)活動(dòng)而對(duì)人造海洋設(shè)施產(chǎn)生的一類生態(tài)危害，例如造成管線堵塞，船舶航行阻力增加，海洋平臺(tái)載荷增加，并可能增加腐蝕風(fēng)險(xiǎn)，生物污損會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1］。附著于材料表面的微生物膜是誘導(dǎo)生物污損進(jìn)一步發(fā)展的重要原因，它也是材料腐蝕發(fā)生的重要因素［2］。鋼鐵構(gòu)筑物等設(shè)施浸入海水環(huán)境后其表面幾分鐘內(nèi)便形成一層富含有機(jī)質(zhì)的調(diào)控膜，隨后細(xì)菌、硅藻等微生物相繼附著進(jìn)而形成生物膜［3-5］，影響這一過程的因素包括材料表面形貌［6］、表面電荷［7］和表面潤(rùn)濕度［8］等。細(xì)菌膜作為生物膜的重要組成之一，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)很大程度上決定了后續(xù)大型生物的附著，并影響整個(gè)生物污損過程。已有研究表明，菌膜既可以促進(jìn)也能抑制其他微生物的附著［9-10］。Gawne等［11］研究了細(xì)菌對(duì)硅藻附著的影響，發(fā)現(xiàn)硅藻的附著隨基體材料的表面電荷和材料質(zhì)地不同而不同，菌膜可以通過分泌多聚糖來改變基體材料的表面電荷和質(zhì)地從而影響硅藻的附著。Joint等［12］在研究浮游孢子在菌膜的附著時(shí)也得到了相似的結(jié)論。

海洋微藻是重要的污損生物之一，其在水下基體的附著是誘發(fā)其他污損生物附著的重要因素，并影響隨后污損生物群落的發(fā)展。舟形藻屬（Navicula）隸屬于硅藻門，在金屬表面的附著是一個(gè)逐級(jí)有序的過程，包括到達(dá)表面后著陸、初始附著、滑行及永久附著四個(gè)步驟［13］。舟形藻通過初期附著選擇最優(yōu)的生存環(huán)境，初期附著可以是暫時(shí)的也可以是永久的［14］。進(jìn)入新環(huán)境后，處于懸浮狀態(tài)的舟形藻細(xì)胞在重力、水流作用下到達(dá)固體表面，通過與固體表面的靜電引力或與附著在固體表面有機(jī)質(zhì)間的相互作用同固體表面結(jié)合。此外，菌膜的形成是海洋生物污損過程中一種常見的現(xiàn)象，然而海洋微藻在細(xì)菌膜上的附著規(guī)律及其對(duì)金屬腐蝕的影響尚未得到足夠的重視。因此，本工作采用銅綠假單胞菌（Pseudomons aeruginosa PAO1）形成菌膜，對(duì)比舟形藻在無菌膜的不銹鋼試片表面的附著力及電化學(xué)腐蝕行為，就菌膜對(duì)舟形藻附著的影響及其對(duì)316L不銹鋼腐蝕的影響進(jìn)行了初步研究。

1 試驗(yàn)

1.1 試樣

試驗(yàn)采用316L不銹鋼試片，其化學(xué)成分（質(zhì)量分?jǐn)?shù)／%）為：C 0.022，Mn 0.97，P 0.028，Si 0.69，S 0.003，Ni 10.03，Cr 6.28，Mo 2.16，N 0.015，余量為鐵。試驗(yàn)采用2種典型的污損微生物：銅綠假單胞 菌（Pseudomons aeruginosa PAO1）和 舟 形 藻（Navicula）。

試樣尺寸為10mm×10mm×2mm，試驗(yàn)前試片用水砂紙逐級(jí)打磨至2000號(hào)，最后用0.3μm的Al2O3拋光粉拋光，無水乙醇擦洗，放入無水乙醇中超聲清洗10min。取出晾干，在紫外照射條件下30min滅菌。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與生長(zhǎng)曲線測(cè)定

配制LB培養(yǎng)基（10.0g·L-1NaCl；10.0g·L-1胰蛋白胨；5.0g·L-1酵母提取物），調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃滅菌30min，接種銅綠假單胞菌（P.aeruginosa PAO1）微生物菌株，置于37℃的振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)22h，取60μL于200mL LB培養(yǎng)液作為試驗(yàn)中用到的培養(yǎng)基，綠銅假單胞菌濃度大約104個(gè)／mL。

在盛有200mL LB培養(yǎng)基的250mL廣口瓶中接種菌株銅綠假單胞菌使初始濃度為104個(gè)／mL。在33℃中培養(yǎng)，用平板計(jì)數(shù)法連續(xù)13d進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，得到生長(zhǎng)曲線。

1.3 舟形藻生長(zhǎng)周期

在盛有200mL f／2培 養(yǎng) 液（NaNO37.48×10-2g·L-1；NaH2PO44.4×10-3g·L-1；Na2SiO3·9H2O 8.4×10-3～16.7×10-3g·L-1；ZnSO4·4H2O 2.3×10-5g·L-1；MnCl2·4H2O 1.78×10-4g·L-1；CuSO4·5H2O 1.0×10-5g·L-1；FeC6H5O7·5H2O 3.9×10-6g·L-1；Na2MoO4·2H2O 7.3×10-6g·L-1；CoCl26·H2O 1.2×10-5g·L-1；Na2EDTA 4.35×10-6g·L-1；維生素B12 5×10-8g·L-1；維生素B1 1×10-4g·L-1；維生素H 5×10-8g·L-1）的250mL廣口瓶中接種舟形藻，使體系中舟形藻的初始濃度為130個(gè)／mL，在體系中懸掛20mm×20mm×2mm載用玻璃試片，每天取出在血小板計(jì)數(shù)器上于顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算單位面積上的舟形藻數(shù)目。

1.4 原子力顯微鏡（AFM）附著力試驗(yàn)

將經(jīng)打磨拋光的316L試片放入P.aeruginosa PAO1濃度為104個(gè)／mL的菌液中培養(yǎng)，分別于不同采樣時(shí)間（1d、4d、11d）取出試片，100mmol／L PBS（磷酸緩沖液）沖洗三次以除去未粘附細(xì)胞，用原子力顯微鏡（日本精工，SPA400）觀察。

將上述在菌液中浸沒處理過的試片放在舟形藻溶液中培養(yǎng)，分別于不同時(shí)間（1d、10d）取出試片，用原子力顯微鏡觀察。潔凈的試片在舟形藻溶液中培養(yǎng)，分別于不同采樣時(shí)間（1d、10d）取出試片，用原子力顯微鏡觀察。

1.5 電化學(xué)試驗(yàn)

試驗(yàn)所用電極為316L不銹鋼電極，尺寸為10mm×10mm×2mm，長(zhǎng)約15cm的銅導(dǎo)線連接，用環(huán)氧樹脂將電極密封，只保留10mm×10mm的工作面。將制作好的316L不銹鋼工作電極用水砂紙逐級(jí)打磨至2000號(hào)，無水乙醇沖洗，放入無水乙醇中超聲清洗10min。

電化學(xué)試驗(yàn)采用三電極體系，316L不銹鋼電極為工作電極，2mm×2mm鉑電極作為對(duì)電極，飽和甘汞電極（SCE）作為參比電極。文中電位若無特指，均相對(duì)于SCE。電化學(xué)阻抗譜掃描頻率范圍為10mHz～100kHz，電壓振幅為10mV。應(yīng)用ZSimpWin Version3.21電化學(xué)分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 銅綠假單胞菌（Pseudomons aeruginosa PAO1）的生長(zhǎng)周期

銅綠假單胞菌（P.aeruginosa PAO1）的生長(zhǎng)曲線見圖1?？梢钥闯?，P.aeruginosa PAO1在5h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該期間細(xì)菌以二次分裂的方式快速繁殖，菌含量最高達(dá)1010～1011個(gè)／mL。48h后隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少和代謝廢物的增多，環(huán)境不再利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，死亡的細(xì)菌個(gè)數(shù)超過新生的細(xì)菌個(gè)數(shù)，細(xì)菌總數(shù)開始下降。

圖1 銅綠假單胞菌PAO1的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Pseudomons aeruginosa PAO1

2.2 舟形藻生長(zhǎng)周期

由圖2可以看出，約5d后，舟形藻在試片表面附著，開始呈指數(shù)生長(zhǎng)。隨著環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝廢物的增多，舟形藻的附著量減少，同時(shí)脫附量漸漸增多，最終達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。

圖2 舟形藻生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of Navicula

2.3 銅綠假單胞菌在316L不銹鋼表面的附著力的變化過程

原子力顯微鏡觀察附著力試驗(yàn)結(jié)果表明，不同時(shí)間內(nèi)P.aeruginosa PAO1菌株在316L不銹鋼表面的附著力不同。由表1可見，附著力先增大后減小，最后又增大到最大值。這可能與P.aeruginosa PAO1的活性變化及其分泌物有關(guān)，結(jié)合P.aeruginosa PAO1的生長(zhǎng)周期可以看出，在24h內(nèi)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，繁殖迅速，細(xì)菌在試片表面附著形成菌落，故而在四種試片表面第一天時(shí)的附著力相對(duì)于其空白試樣附著力都會(huì)增加，這表明了P.aeruginosa PAO1在試片表面的有效附著。隨后，細(xì)菌活性下降，對(duì)試片表面的附著減弱。但是在11d的AFM附著力增大到最大值，說明PAO1細(xì)菌在316L不銹鋼表面已經(jīng)形成穩(wěn)定的生物膜。

表1 PAO1細(xì)菌在1，4，11d時(shí)在不銹鋼試片表面的附著力（nN）Tab.1 The adhesion force（nN）of PAO1on 316Lstainless steel after 1d，4d，11d

鑒于細(xì)菌在316L不銹鋼表面的附著力在11d達(dá)到最大，且已經(jīng)形成穩(wěn)定的生物膜，因此選擇菌膜形成11d時(shí)的試樣與無菌膜的試樣作對(duì)比，進(jìn)行舟形藻在試片表面的附著試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 舟形藻在316L表面的平均附著力Tab.2 The average adhesive force of Navicula on 316Lstainless steel

由表2可知，浸泡初期（1d），有菌膜不銹鋼表面的附著力低于在無菌膜不銹鋼，且顯著低于未浸入藻液時(shí)，這可能是因?yàn)榫け砻嫖镔|(zhì)與舟形藻間的相互作用或進(jìn)入新環(huán)境后菌膜的脫落造成了附著力的降低。而浸泡后期（10d），有菌膜不銹鋼表面的附著力顯著高于無菌膜不銹鋼，相較于初始狀態(tài)也有一定升高，可見PAO1菌膜的存在顯著促進(jìn)了舟形藻的附著。

2.4 微生物附著的電化學(xué)分析結(jié)果

2.4.1 開路電位

如圖3所示，無藻無菌膜和有藻無菌膜體系的開路電位初始值一致且明顯正于有藻有菌膜的體系。試驗(yàn)期間，無藻無菌體系的開路電位基本穩(wěn)定，僅在初始浸泡階段有很小的波動(dòng)，初始浸泡階段2d內(nèi)，開路電位發(fā)生了正移，由浸泡前的-0.228 75V升高到-0.180 67V，正移了48.08mV，可能是由于不銹鋼表面鈍化膜的形成造成的。隨后（浸泡2～6d），電極的開路電位又逐漸負(fù)移，第6天電極的開路電位達(dá)到-0.308 78V，負(fù)移128.11mV，最后開路電位穩(wěn)定在-0.31V附近。

圖3 不同條件存在下的開路電位值Fig.3 The open circuit potential of 316LSS under different conditions

有藻無菌膜體系的開路電位呈現(xiàn)出較大的波動(dòng)，光滑的316L不銹鋼電極在有舟形藻溶液的開路電位明顯比其在無舟形藻溶液中時(shí)更正，說明316L不銹鋼在舟形藻溶液中有更大的腐蝕傾向。在有藻有菌膜的體系中，由于菌膜-硅藻-電極間復(fù)雜的相互作用［15］，使得開路電位極不穩(wěn)定。在有舟形藻的體系中，無論電極表面形成菌膜與否，其開路電位變化趨勢(shì)一致（如圖3所示）：在剛浸沒入培養(yǎng)液一周內(nèi)，舟形藻的新陳代謝處于增長(zhǎng)期，在電極表面的大量附著使316L不銹鋼電極開路電位處于波動(dòng)狀態(tài)；一周后舟形藻的新陳代謝最高峰結(jié)束，舟形藻對(duì)電極開路電位的影響減弱，開路電位趨于穩(wěn)定。

可以看出，不同體系中316L不銹鋼電極的開路電位變化不同，但在浸泡大約5～8d后都趨于穩(wěn)定。穩(wěn)定后，各體系間開路電位大小關(guān)系為無藻無菌膜體系＞有藻有菌膜體系＞有藻無菌膜體系。這說明，舟形藻的存在會(huì)增加316L不銹鋼的腐蝕敏感性，菌膜的形成則一定程度上降低了316L不銹鋼在舟形藻Navicula溶液中的腐蝕敏感性。

2.4.2 電化學(xué)阻抗譜

圖4為光滑的316L不銹鋼在f／2培養(yǎng)液中不同條件下的Nyquist圖。在無藻無菌膜、有藻無菌膜和有藻有菌膜三個(gè)體系中，316L不銹鋼的容抗弧半徑在經(jīng)歷了5～7d的迅速增大后趨于穩(wěn)定。這與其開路電位5～8d后趨于穩(wěn)定的變化特點(diǎn)相吻合。

圖4 光滑的316L在無舟形藻的f／2培養(yǎng)液中不同條件下的電化學(xué)阻抗譜Fig.4 EIS of 316LSS immersed in f／2in different conditions for different times（a） without navicula and biofilm （b） with navicula but no biofilm （c） with navicula and biofilm

圖5 為316L不銹鋼在f／2培養(yǎng)液中不同條件下的電化學(xué)阻抗譜等效電路擬合。圖中，Rs表示溶液電阻，Cp表示腐蝕產(chǎn)物膜電容，Rp表示腐蝕產(chǎn)物膜電阻，Cdl表示界面雙電層電容，Rct表示電荷傳遞電阻。相關(guān)電化學(xué)參數(shù)擬合結(jié)果見表3～表5。

由表3可知，在無藻無菌膜體系，對(duì)電阻起決定作用的是電荷傳遞電阻。在有藻有菌膜和有藻無菌膜體系中，出現(xiàn)了膜電阻。在剛開始浸泡1～2d內(nèi)，有藻有菌膜的膜電阻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于有藻無菌膜的膜電阻，這是因?yàn)樵谟性逵芯んw系的電極表面附著有穩(wěn)定的菌膜。隨后，有藻有菌膜體系中的伴隨著菌膜的脫落，而舟形藻尚未大量附著造成膜電阻的迅速降低。有藻無菌膜體系中由于舟形藻在電極表面的大量附著，膜電阻迅速增大并趨于穩(wěn)定。一周后有藻有菌膜體系中，舟形藻的大量附著使其膜電阻增大并趨于穩(wěn)定。這時(shí)兩個(gè)體系中的膜電阻基本相同。10～11d時(shí)，由于培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，附著的微藻開始大量脫落，膜電阻都急劇下降。這與AFM結(jié)果是相一致的。

2.4.3 動(dòng)電位極化曲線

圖6為不同條件下的316L不銹鋼在f／2培養(yǎng)液中的動(dòng)電位極化曲線?？梢钥闯觯?16L不銹鋼在含舟形藻培養(yǎng)液中的極化曲線陽極區(qū)斜率發(fā)生了明顯變化，說明舟形藻的存在改變了陽極表面的腐蝕過程。表6為三種體系的動(dòng)電位極化參數(shù)。

圖5 316L不銹鋼在f／2培養(yǎng)液中不同條件下的Nyquist圖的等效電路擬合Fig.5 Equivalent circuit to model the Nyquist patterns of 316LSS immersed in f／2in different conditions for different times（a） without navicula and biofilm（b） with navicula but no biofilm（c） with navicula and biofilm

表3 無藻無菌膜體系的模擬電路的數(shù)據(jù)R｛C［R（CR）］｝Tab.3 Electrochemical parameters of 316LSS without biofilm and Navicula

由表6可見，在無藻無菌膜體系下隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，腐蝕電位Ecorr逐漸減小，腐蝕電流密度Jcorr先增大后減?。辉谟性鍩o菌膜體系下隨著時(shí)間增長(zhǎng)，腐蝕電位Ecorr逐漸減小；腐蝕電流密度Jcorr逐漸增大。相較于無藻無菌膜體系，浸泡時(shí)間相同時(shí)，Ecorr更負(fù)，Jcorr更大。說明舟形藻存在，促進(jìn)了316LSS在f／2培養(yǎng)液中的腐蝕。

表4 有藻無菌膜體系的模擬電路的數(shù)據(jù)R（CR）（CR）Tab.4 Electrochemical parameters of 316LSS with Navicula but no biofilm

表5 有藻有菌膜體系的模擬電路的數(shù)據(jù)R［C｛R（CR）｝］Tab.5 Electrochemical parameters of 316LSS with Navicula and biofilm

與前兩個(gè)體系不同，在有藻有菌膜體系下隨著浸泡時(shí)間增加，Ecorr和Jcorr都呈現(xiàn)出較大的波動(dòng)，且Ecorr越負(fù)，相應(yīng)的Jcorr越大。試驗(yàn)后期，該體系的Jcorr小于有藻無菌膜體系，表明菌膜的存在，一定程度上抑制了舟形藻對(duì)316L不銹鋼的腐蝕。

3 結(jié)論

（1）原子力顯微鏡的附著力試驗(yàn)結(jié)果表明，菌膜的存在促進(jìn)了舟形藻的附著。舟形藻在固體表面的附著與其生長(zhǎng)周期呈現(xiàn)出一致性，說明舟形藻的附著過程與舟形藻的新陳代謝密切相關(guān)。

（2）舟形藻的存在增加了316L不銹鋼的腐蝕傾向，而菌膜的存在一定程度上抑制了舟形藻對(duì)316L不銹鋼的腐蝕。

圖6 不同菌膜體系下的動(dòng)電位極化曲線Fig.6 Polarization curves of the 316LSS immersed in f／2culture solutionsc（a） without navicula and biofilm （b） with navicula but no biofilm （c） with navicula and biofilm

表6 不同菌膜條件下316L不銹鋼在f／2培養(yǎng)液中的動(dòng)電位極化參數(shù)Tab.6 Fitting results of polarization curves for 316LSS in f／2culture solution under different conditions

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