miRNA與膽道閉鎖肝纖維化

衛(wèi)園園，詹江華

綜述

miRNA與膽道閉鎖肝纖維化

衛(wèi)園園1，詹江華2△

膽道閉鎖（BA）是嬰兒期引起梗阻性黃疸的主要病因之一，以肝內外膽管進行性炎癥和纖維性梗阻為主要特征，導致膽汁淤積和肝纖維化及肝硬化。肝纖維化中最重要的是肝星狀細胞（HSC）的活化，這一過程受到多種機制的調節(jié)，其中miRNA家族成員可通過調控靶基因的表達，進而作用于多種信號通路促進HSC的活化，在細胞外基質（ECM）的合成和降解中發(fā)揮調節(jié)作用。大量文獻表明PI3K/Akt信號通路與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關，參與了活化HSC增殖、凋亡的調控，miRNA通過各種靶基因激活PI3K/Akt信號通路，進而激活HSC，促進肝纖維化的發(fā)展。本文就膽道閉鎖肝纖維化相關的miRNA綜述如下。

微RNAs；膽道閉鎖；肝硬化；星形細胞；綜述

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是新生兒及嬰幼兒期阻塞性黃疸的主要病因之一，亦是嬰幼兒最嚴重的一種肝膽疾病。在病理上，BA表現為肝內、外膽管進行性炎癥和纖維性梗阻，導致肝內膽汁淤積，并發(fā)展為進行性的肝纖維化和肝硬化［1-3］。肝纖維化發(fā)病機制中起到關鍵作用的是肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）。HSC的活化受多種信號轉導通路的調節(jié)，包括轉化生長因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）/Smad通路和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinosi?tol 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）通路等，都在肝臟細胞外基質（extracellular matrix，ECM）產生和降解中起到重要作用［4-5］。研究表明，微小RNA（MircoRNA，miRNA）在肝臟既參與調節(jié)炎癥反應，也在纖維化的形成中發(fā)揮重要作用［6-8］。在膽道閉鎖肝臟纖維化進程中，miRNA發(fā)揮的調控效應也得到了越來越多的關注。

1 miRNA的合成和功能機制

miRNA是一類內源性單鏈非編碼的核糖核酸，長度約21～25個核苷酸，廣泛分布于各種生命體，其作為RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）的核心功能要素之一，主要通過與其靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)（un?translated region，UTR）互補結合，抑制mRNA的翻譯或誘導mRNA降解，在轉錄后水平調節(jié)基因表達，發(fā)揮RNA介導的轉錄后基因沉默效應，是機體內各種生理及病理活動的關鍵調節(jié)因子［6］。MiRNA在生物起源、進化上是高度保守的，其基因在核內由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，通過加帽聚合成初級轉錄物Pri-miRNA，初級轉錄物再由Drosha核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）切開，產生大約70個堿基的莖環(huán)結構前體PremiRNA，后轉移至細胞質，被Dicer核酸酶切開形成成熟的miRNA。成熟的miRNA能夠負調控目標基因表達，通過結

合mRNA的3′-UTR，誘導目標mRNA降解或抑制翻譯，在生物體的發(fā)育、增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮重要的生理作用［6-7］。一種miRNA能夠作用于數個不同的目標mRNA，而一種mRNA也接受不同miRNA的調節(jié)作用。多項研究證實，miRNA可協同TGF-β、血小板衍生生長因子（PDGF）、核因子（NF）-κB、腫瘤壞死因子（TNF）等多種細胞因子調控HSC的生物學行為，從而形成復雜的纖維化“網絡”信號途徑，提示miRNA可能參與調控HSC的活化增殖或凋亡，從而影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程［6-8］。

2 miRNA與膽道閉鎖肝纖維化

BA患兒肝臟的病理改變有特征性，可見肝內膽汁淤積及膽栓形成，門管區(qū)纖維化，膽管增生反應，門管區(qū)炎細胞浸潤，嚴重者可見肝硬化改變［4］。肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中，HSC、肝細胞、庫普弗細胞、內皮細胞等均發(fā)揮著重要作用，HSC在其中起到關鍵作用。在受到致病因素刺激后，正常肝臟中數目很少的HSC激活轉化為肌成纖維樣細胞和成纖維細胞，形態(tài)學上發(fā)生失去維生素A和出現細胞骨架α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）等改變，進而分泌大量的ECM。ECM過度增生、異常沉積以及降解減少，導致肝臟纖維化［9-10］。肝纖維化是一個多步驟并涉及多種因素參與的、受眾多調控因子調節(jié)的復雜過程。HSC的活化作為肝纖維化形成和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，可受到多條信號通路及細胞因子的影響，如TGF-β/Smad通路、NF-κB通路、PI3K/ Akt通路、MAPK通路、Wnt/β-catenin通路等。再者，肝細胞、膽道上皮細胞通過上皮間質轉化（epithelial to mesenchy?mal transition，EMT）轉變?yōu)榧〕衫w維細胞，在膽道閉鎖肝纖維化過程中的作用也越來越被重視［11］。膽道閉鎖中HSC的活化受到miRNA調控的機制目前也得到了廣泛研究。

在心、肺、肝、腎等多種器官的纖維化調節(jié)中都有miRNA家族成員的廣泛參與［12-13］。研究者近年來通過生物信息學方法、基因芯片、實時定量PCR、核酸原位雜交及miRNA體外過表達等技術檢測出一系列膽道閉鎖相關的miRNA［14-16］。MiRNA在血漿和血清中非常穩(wěn)定，不受RNA裂解酶影響。Zahm等［15］發(fā)現miR-200b/429在BA患者中表達顯著上調。Bessho等［14］通過整合基因組學，研究BA小鼠模型中發(fā)病相關miRNA，發(fā)現14種miRNA表達被抑制，其中miR-30b/c、-133a/b，-195 c，-200a，-320和-365與靶基因之間的調節(jié)在BA小鼠的發(fā)病機制中存在時空特異性?，F就BA肝纖維化相關的miRNA在發(fā)病機制中發(fā)揮的重要作用分別進行描述。

2.1 miR-21MiR-21是研究最為充分、功能最為明確的miRNA之一，廣泛高表達于多種惡性腫瘤中。人類的miR-21編碼基因位于17號染色體，通過抑制抑癌基因PTEN、PDCD4、TIMP3、TMP-1、RECK、p53等表達而促進腫瘤的轉化、生長和遷移。研究表明，miR-21在成纖維細胞中高表達，參與多種器官纖維化進程［12-13］。Shen等［17］研究發(fā)現，相比于正常對照組，BA患者肝組織中miR-21的表達明顯升高，提示其在疾病過程中可能發(fā)揮特異性作用，同時應用miRNA靶基因預測軟件TargentScan等預測的靶基因磷酸酶及張力蛋白同源物基因（phosphatase and tension homologue deleted from chromosome，PTEN）表達降低，HSC活化標志α-SMA表達升高。PTEN基因位于人10q23.3，被證實是miRNA-21的靶基因，編碼一種具有蛋白和脂類雙重作用的磷酸酯酶，其主要作用是把三磷酸酯酰肌醇（IP3）轉變?yōu)槎姿狨ヵ＜〈迹↖P2）。PTEN不僅是miR-21的直接目標，還是Akt的負性調控因子，通過抑制Akt的激活，抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡［18-19］。MiR-21作用于PTEN使其表達下調，PTEN的失活使p-Akt表達升高，激活HSC轉變?yōu)榧〕衫w維細胞，進而影響ECM重構、間質纖維化，由此提示miR-21/PTEN/Akt信號軸在BA肝纖維化過程中可能發(fā)揮作用。體外細胞培養(yǎng)實驗證實了miR-21對HSC細胞的這一激活作用［18］。PDGF是目前已知HSC的最強絲裂原，是體內主要的促纖維化因子。人肝星狀細胞株LX-2系經PDGF-BB處理后發(fā)現miR-21表達增加，基質金屬蛋白酶（MMP）-2表達上調，提示miR-21參與HSC的激活。miR-21的過表達也能刺激人肝星狀細胞株LX-2細胞的活化和α-SMA表達上調。轉染pre-miR-21于LX-2細胞發(fā)生類似活化作用。而當antimiR-21轉染下調miR-21時細胞纖維化標志α-SMA、α1（1）-collagen等降低。

Davis等［20］研究發(fā)現miR-21與TGF-β/Smad信號通路的相互作用在肝纖維化過程中發(fā)揮作用，TGF-β/Smad信號通路是TGF-β發(fā)揮生物學作用的主要通路，是多種臟器纖維化疾病的病理過程中的關鍵調節(jié)通路，對于肝纖維化的啟動以及HSC的激活和轉化起著至關重要的作用。TGF-β能增加pre-miR-21及成熟miR-21的表達，這一作用是在轉錄后水平通過促進Drosha酶的加工步驟實現。Marquez等［21］認為，miR-21通過抑制TGF-β信號通路中的負調節(jié)子Smad7，在肝纖維化過程中形成一個正反饋調節(jié)機制。Wen等［12］在肺纖維化小鼠模型中發(fā)現成纖維細胞高表達miR-21，下調肺纖維化負性調控因子Smad7的表達，進而促進肺纖維化。這一作用是否存在于膽道閉鎖肝纖維化過程中有待進一步研究。探討miR-21對纖維細胞增殖和膠原合成的影響，闡明其涉及的TGF-β/Smad通路機制，可能會為尋求阻斷BA肝臟纖維化進程的新途徑提供依據。

2.2 miR-200MiR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，該家族在促進或抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中通過調控某些靶點和通路發(fā)揮作用［22］。Muraka?mi等［23］研究顯示，miR-200a在肝纖維化中表達上調，并且與人肝纖維化進展呈正相關，這不僅提示miR-200a參與了肝臟纖維化過程，可作為一個潛在的治療靶點，還提供了其成為評估纖維化病變程度的新指標的可能性。Zahm等［15］發(fā)現miR-200b/429在BA患者中表達顯著上調，并且miR-429的診斷靈敏度為70.8%。此外，研究人員通過細胞劃痕實驗、遷移實驗等證實，miR-200b轉染可增加LX-2細胞的增生和遷移，并且顯著減少它的靶標GATA結合蛋白2（friend of GATA，FOG2）的表達，而miR-200b抑制物可以顯著抑制TGF-β誘導的HSC的活化［24］。進一步研究發(fā)現將BA患者根據肝臟纖維化程度進行分組比較miR-200b表達差異，發(fā)現其隨纖維化進程表達增加。FOG2是一種能與GATA相互

作用并調控其轉錄活性的鋅指蛋白，廣泛存在于成人的心、腦、肝、肺、骨骼肌等組織中，通過直接結合PI3K的調節(jié)亞基p85來抑制PI3K/Akt通路的激活［25］。FOG2是PI3K/Akt途徑的抑制劑，故miR-200b通過調節(jié)AKT信號通路進而激活HSC引起纖維化，提示miRNA-200b可作為減輕纖維化的治療靶點。此外，在膽汁淤積性疾病中，Xiao等［26］發(fā)現miR-200可與miR124協同作用，通過抑制白細胞介素（IL）-6/信號轉導子及轉錄激活子3（signal transducer and activator of tran?scription3，STAT3）通路促進膽管增生。

EMT是纖維化的一個重要步驟。目前已有充分證據證實BA病程中發(fā)生了膽道EMT，并且EMT與纖維化均密切相關［27］。TGF在EMT發(fā)生過程中通過Smad通路起主要誘導作用。多種miRNA參與EMT調節(jié)，miRNA-200家族在多種腫瘤細胞中能調控EMT，通過靶向調節(jié)眾多鋅指轉錄因子，特別是ZEB1，從而阻止其對E-cadherin的抑制而誘導EMT［28］。在多種腫瘤中已證實miR-200c能夠對抗并逆轉TGF-β1誘導出現的EMT［29］。MiR-200b也被發(fā)現可顯著抑制BA膽管上皮細胞中TGF-β1依賴性的EMT和纖維化的發(fā)生和發(fā)展，提示miR-200b可能通過抑制EMT減輕纖維化進程［27］。

MiR-200家族對肝臟纖維化作用的差異可能與表達的細胞類型不同、上游激活因子種類不同以及下游效應因子、肝纖維化所處的階段有關，miR-200可能基于不同類型細胞和不同時期對BA肝纖維化的調節(jié)存在雙向作用，這些正向或負向作用的平衡決定了其對肝纖維化的進程是促進還是抑制。

2.3 miR-221/222MiR-221/222基因定位于X染色體p11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內，為成簇分布的miRNA，兩者呈前后排列，在表達變化和特異性靶標上具有相似性，是定性較為明確的原癌基因簇，在多種腫瘤如肝細胞肝癌、甲狀腺癌、前列腺癌、惡性神經膠質瘤等不同類型的惡性腫瘤中均明顯表達異常［30］。MiRNA-221/222可能調控的靶基因約300余個，其能夠與多個抑癌基因的3′-UTR結合從而直接或者間接地通過調控下游靶基因影響PI3K/Akt信號通路的活性。

Ogawa等［31］研究發(fā)現miR-222可以引起HSC的活化，在肝纖維化中發(fā)揮重要作用，HSC調節(jié)肝纖維化并表達miR-221/222。MiR-221/222可能是HSC激活和肝纖維化進展中的一個新的標志物。Shen等［32］首先通過注射輪狀病毒制作小鼠BA模型，發(fā)現相比對照組，實驗組小鼠肝組織中miR-222表達顯著上調、蛋白磷酸酶2A調節(jié)亞基（PPP2R2A）表達減少、p-Akt增加，提示miRNA可能是以PPP2R2A為靶目標調控下游Akt信號通路，促進纖維化發(fā)生的。研究發(fā)現，PPP2R2A是蛋白磷酸酶2A（PP2A）的調節(jié)亞基，作為一種蛋白磷酸酶，可以拮抗多種蛋白激酶的活性，也是控制Akt活性中最基礎的，形成miR222和Akt信號通路之間調控的連接［33］。Akt充分激活需要蘇氨酸-308和絲氨酸-473的磷酸化作用。PPP2R2A通過Akt的蘇氨酸-308脫磷酸化作用負調控Akt的活動。MiR-222作用于PPP2R2A的mRNA的3′-UTR，miR-222表達水平提高，導致PPP2R2A表達水平降低，激活Akt信號通路，p-Akt表達增高。蛋白激酶信號通路可以抑制HSC的凋亡，同時刺激HSC的增殖，miR-222水平增加，進一步激活蛋白激酶途徑并促進HSC活化，在肝纖維化進程中發(fā)揮著重要的作用。體內研究發(fā)現miR-222在BA患者的肝樣本中表達明顯升高，并且miR-222抑制物可抑制LX-2細胞的增殖，間接支持了miR-222參與了Akt的激活［34］。這些研究均提示了miR-222在BA肝纖維化中起重要的作用。

2.4 其他Roderburg等［35］通過對CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型組織中miRNAs表達譜的檢測發(fā)現31種表達變化的miRNAs中miR-29家族表達減少，且miR-29b下降最為顯著，人類中重度肝纖維化組織中也發(fā)現miR-29家族表達下調。余曉波等［36］發(fā)現膽總管結扎術BA小鼠模型肝臟和外周血中miR-29家族的表達較對照組顯著下降。在對輪狀病毒感染小鼠BA模型的研究中，Hand等［16］發(fā)現miR-29可能通過在膽管上皮細胞中作用于目的基因Igf1和II1RAP發(fā)揮調節(jié)作用。Sekiya等［37］研究發(fā)現，高表達的miR-29可能通過對激活HSC活化的某些信號通路起作用，使HSC保持在靜止狀態(tài)。Roderburg等［35］通過動物實驗證實miR-29具有抑制TGF-β1，下調Ⅰ型膠原蛋白，減輕肝纖維化的作用。生物信息學實驗證實TGF-β1R是miR-29b的靶基因，miR-29b可負向調控HSC中TGF-β1R基因的表達。因此，下調TGF-β1R的表達很可能是miR-29b抗肝纖維化的機制之一［38］。MiR-29被認為是一種腫瘤抑制性miRNA，其在多種腫瘤組織中表達下調，而其在BA中的作用機制有待進一步研究。

MiR-30也在肝臟纖維化中發(fā)揮作用。實驗證明miR-30可通過靶向Snaill的3′-UTR來抑制TGF-β誘導的肝細胞EMT［39］。大鼠體外活化HSCs中TGF-β的表達可通過轉染miR-30被特異性抑制，HSCs中α-SMA、Ⅰ型膠原、MMP-2、組織金屬蛋白酶抑制因子-l（tissue inhibitors of metallopro?teinases-1，TIMP-1）的表達也在轉染后出現下調。但就miR-30與BA肝纖維化的關系還少有相關研究。

3 展望

目前關于BA肝臟纖維化發(fā)病機制的研究中，miRNA如何與其他因素如TGF-β/Smad通路等相互作用參與BA進程的機制尚不明確，并且miRNA在炎癥與纖維化之間的橋梁作用還有待探尋。不同時期miRNA表達水平的差異還不清楚，其在疾病進程中的具體作用有待進一步研究。相信隨著對miRNA在BA肝纖維化中的作用更深入的探討，將為BA的治療提供新的靶點，可通過上調或下調miRNA表達水平達到調控疾病關鍵蛋白的表達，從而控制纖維化進程的目的，為控制BA纖維化過程提供新思路并帶來新的治療希望，使患兒在不需肝移植的情況下得以延長生命或甚至根治疾病。對miRNA的深入認識不僅有助于BA發(fā)病機制的探討，還提供了應用于診斷的可能性。伴隨著檢測方法的進步，相信miRNA可以在將來為BA的診斷和治療提供更優(yōu)化的方案。但是，要想通過檢測血清中的某些與肝纖維化密切相關的miRNA變化來判斷肝纖維化病情，還需系統(tǒng)地分析不同發(fā)病時期中miRNA的變化，才有可能篩選出特異性

高的分子生物學標志物。目前最緊迫的問題是了解miRNA生物功能的細節(jié)，比如調控miRNA表達的轉錄因子有哪些？MiRNA表達的具體位點及確切時間是什么？不同環(huán)境下的miRNA作用靶點的變化是什么？想要完全了解其在BA病理狀態(tài)中的作用及作用機制，尚有待研究者們進行更深入的探索。

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（2015-03-26收稿 2015-06-16修回）

（本文編輯 魏杰）

MicroRNA and hepatic fibrosis of biliary atresia

WEI Yuanyuan1，ZHAN Jianghua2△
1 Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Surgery，Tianjin Children’s Hospital△Reviser and Corresponding AuthorE-mail:zhanjianghuatj@163.com

Biliary atresia（BA），an inflammatory sclerosing cholangiopathy，is the leading cause of cholestasis in infants. Pathologic features of BA include progressive inflammation and intrahepatic and extrahepatic bile duct fibrosis.BA is charac?terized by rapid liver fibrosis.The activation of hepatic stellate cell（HSC）is most important in liver fibrosis.Many mecha?nisms are involved in this process.miRNA can promote the activation of HSC through a variety of signaling pathways by regu?lating the expression of target gene，then playing a regulatory role in the synthesis and degradation of extracellular matrix（ECM）.A lot of literatures show that PI3K/Akt is closely related to the occurrence and development of hepatic fibrosis.PI3K/ Akt signaling pathway is involved in the activation of HSC proliferation and apoptosis.MiRNA activates PI3K/Akt signaling pathway through various target genes，and then activates HSC to promote the development of liver fibrosis.In this paper，the miRNA related to biliary atresia of liver fibrosis is summarized.

microRNAs；biliary atresia；liver cirrhosis；astrocytes；review

R657.4+4

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.030

天津市衛(wèi)生行業(yè)重點攻關項目（14KG129）

1天津醫(yī)科大學研究生院（郵編300070）；2天津市兒童醫(yī)院外科

衛(wèi)園園（1992），女，碩士在讀，主要從事膽道閉鎖方面研究

△通訊作者及審校者zhanjianghuatj@163.com