同位素示蹤RRL腫瘤新生血管顯像的應用

王榮福

（北京大學 第 一醫(yī)院，北京 100034）

惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，中國新增307萬腫瘤患者，其中約220萬人死亡，分別占全球總量的21.9%和26.8%。流行病調查資料發(fā)現，在未來的20～30年，我國腫瘤死亡率將繼續(xù)上升。因此，篩查、預警和腫瘤早期診斷及個性化治療將成為腫瘤防治中的關鍵問題。近年來，國家對腫瘤、心腦血管等重大疾病防治高度重視，并投入大量科研基金深入開展腫瘤防治基礎與臨床研究。

惡性腫瘤組織生物靶向分子功能成像是指以腫瘤實質細胞、腫瘤新生血管內皮細胞膜表面及其內部，細胞外基質選擇性表達，正常組織細胞不表達或呈低表達的標記分子為靶點，通過各種不同的示蹤方法，標記對靶點有特異選擇性親合作用的配體，應用各有所長的顯像技術，達到靶向顯示腫瘤組織不同生物學特性的目的。目前，分子功能成像技術以其靶向示蹤分子生物學過程的優(yōu)勢已經成為影像技術領域研究的熱點。靶向分子功能成像技術的關鍵是能夠找到靶向性好的體內顯像配體［1］。

近年來，腫瘤新生血管顯像藥物的研究從低選擇性向高選擇性方向發(fā)展，典型的例子就是從最初的放射性核素標記大分子蛋白（如單克隆抗體）演變?yōu)槎嚯摹⑼芷に兀╞ombesin）、小分子化合物等具有生物活性的小分子配體。小分子標記配體更容易穿透腫瘤組織，因此具有較高的靶器官／非靶器官放射性攝取比和更快的血液清除率，也更具有生物專一性。作為放射性配體，約50個氨基酸以下多肽組成的小分子配體與大分子蛋白相比的優(yōu)點還表現在：（1）小分子多肽容易通過化學方法合成；（2）能承受修飾或放射性標記過程中苛刻的化學條件；（3）具有更小的免疫原性；（4）可以通過化學方法調控優(yōu)化多肽與特定結合位點親和力，并展示較好的特異性分布；（5）大多數情況下具有較好的藥動學特征，其中可被靶組織迅速攝取的特點在腫瘤顯像中尤其重要。這與單克隆抗體在腫瘤組織較慢甚至較差攝取特點正好相反。因此，經過特定修飾的多肽類似物可克服傳統抗體及其片段的不利藥動學特點及顯像性質，應用前景廣闊［2］。

正電子核素標記放射性藥物用于PET／CT分子功能顯像在臨床診療疾病過程中發(fā)揮重要作用［3］，而小分子多肽探針在腫瘤新生血管顯像研究中具有很好的應用前景［4］。小分子多肽結構簡單，便于進行化學結構修飾，從而優(yōu)化其物理化學特性、藥效學和藥代動力學性能，并提高顯像的特異性和靈敏度［5］。另外，由于多肽的相對分子質量一般較小，易與靶點相結合，顯像速度快，多肽合成方法簡單成熟［6－7］。

目前，靶向多肽分子探針發(fā)展最為成熟和迅速，其中研究最多的多肽分子是能夠靶向結合于整合素αVβ3受體的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序 列 （Ar g-Gly-Asp，RGD）多 肽 分 子 探針［8－9］。由于整合素αVβ3受體在惡性腫瘤新生血管內皮細胞中顯著高表達，且與腫瘤的惡性程度及侵襲性密切相關，因此定量示蹤整合素αvβ3受體的表達對于惡性腫瘤的早期診斷、抗腫瘤新藥的研發(fā)及抗癌治療效果的監(jiān)測有著重要作用［10－12］。目前，放射性核素18F［13］、68Ga［14］、99mTc［15］、177Lu［16］和64Cu［17］等標記的 RGD 多肽核素單光子發(fā)射計算機斷層顯像（single photon emission computed tomography，SPECT）及正電子發(fā)射斷層顯像（positron emission to mography，PET）已經成為腫瘤新生血管分子功能顯像的熱點之一［18－19］。但是RGD在肝臟及腎臟的攝取相對較高，并且臨床前期實驗發(fā)現，多肽RGD的結構穩(wěn)定性欠佳，靈敏度不高［19］。因此，理想的小分子多肽探針的探索和研發(fā)十分必要［20］。

1 小分子多肽RRL

2000年，Brown 等［21］應用自行研發(fā)的Fli Trx大腸桿菌肽展示文庫尋找與腫瘤同源的內皮細胞（t u mor derived endot helial cell，TDEC）特異性表面標志物結合的多肽序列，對所得的5條特異性多肽序列進行了TDEC及成纖維細胞的體外結合實驗，將成纖維細胞作為陰性對照組，除多聚賴氨酸序列，其余多肽序列均顯示出相同的背景結合。異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）標記的精氨酸-精氨酸－亮氨酸（Ar g-Ar g-Leu，RRL）序列在光學成像實驗中顯示出最強熒光信號，提示多肽RRL與TDEC結合的量最多，特異性最強。2005年，Weller等［22］將小分子多肽 RRL連接于氣體分子微泡（molecular bubble，MB），分別與TDEC和人冠狀動脈內皮細胞相結合，人冠狀動脈內皮細胞作為正常內皮細胞進行對照，結果發(fā)現 MB-RRL在TDEC中的結合量是對照細胞的3～6倍。同時熒光標記的RRL通過尾靜脈注射入荷PC3或Clone C腫瘤的裸鼠體內，5 h后處死小鼠，沖洗其血管，取腫瘤組織冷凍切片，行熒光定位觀察。在Clone C腫瘤中，可見血管豐富，熒光信號通過RRL定位于內皮層及更深層區(qū)域。PC3腫瘤血管相對較少，熒光標記的RRL大多位于內皮層。對 照 肽 （Tyr-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys，GGG）在任何一種荷瘤動物模型腫瘤病灶無聚集信號。11只荷瘤裸鼠通過尾靜脈注射 MB-RRL及 MB-GGG（GGG為對照肽），進行時控超聲顯像，標記多肽RRL氣體分子微泡與腫瘤新生血管來源內皮細胞結合量明顯超過正常細胞結合量，在體內靶向超聲顯像過程中，腫瘤組織周圍富含血管的區(qū)域可以看見明顯的分子微泡信號，說明分子氣體微泡通過多肽RRL的靶向結合作用聚集于腫瘤組織富含血管區(qū)域，證實了靶向氣體分子微泡RRL顯像腫瘤新生血管的可行性［22］。該研究為腫瘤新生血管的近紅外線熒光成像和正電子核素示蹤PET顯像的多模態(tài)分子探針開發(fā)研究奠定了實驗基礎［23］，具有重要的科學意義。

2 同位素示蹤RRL

2.1 131I標記RRL

2009年，北京大學第一醫(yī)院王榮福教授研究團隊［24－25］開始重新設計合成了小分子多肽RRL的結構，使其能夠用于放射性核素碘的標記，于明明博士在原有RRL結構的氨基端添加一個酪氨酸，設計合成的RRL結構變?yōu)門yr-Cys-Gly-Gly-Arg-Ar g-Leu-Gly-Gly-Cys 而 能夠被放射性核素碘標記，此結構已申請專利［26］，RRL合成純度大于99%。將131I利用氯胺-T法標記于RRL，在20℃、p H＝7.4條件下標記率大于60%，其放化純度大于95%。核素標記的RRL在體內外穩(wěn)定性良好，在37℃血漿中放置24 h后其放化純度仍然大于90%。動物荷瘤模型實驗組尾靜脈注射131I-RRL和對照組注射131I-GGG，在注射后24 h分別進行SPECT動物顯像，可見腫瘤組織和膀胱區(qū)域放射性明顯聚集，而對照肽只有膀胱區(qū)域出現放射性濃聚。實驗結果證實131I-RRL對前列腺癌模型鼠有明確的靶向診斷效果，不失為一種理想的腫瘤新生血管顯像劑［27］。RRL與腫瘤血管內皮細胞結合的機制目前尚不明確，盧霞等［28］實驗研究發(fā)現 VEGFR-2是多肽 RRL靶向結合于腫瘤來源血管內皮細胞的可能靶點，體內外實驗證實，VEGFR-2不是多肽RRL與腫瘤內皮細胞結合的唯一靶點，熒光標記RRL不僅在VEGFR-2表達量大的腫瘤細胞內聚集，還可以在表達VEGFR-2較少的腫瘤細胞內聚集，即多肽RRL不僅與腫瘤血管靶向結合，還可以與腫瘤實質細胞結合［29］，與現在研究相對成熟的多肽RGD相比優(yōu)勢明顯，其作用機制仍然需要進一步研究［30－31］。同位素標記分子探針的生物安全性主要取決于探針的生物毒性及輻射劑量。實驗研究已證明了RRL本身不具有細胞毒性，Zhao等［32］探討腫瘤靶向新生血管的分子探針131I-RRL在人體主要器官內照射吸收劑量及其在日本大耳白兔體內的藥代動力學特征，經估算，人體內照射吸收的有效劑量為0.029 3 mSv／MBq。腫瘤SPECT顯像清晰，靶／非靶組織放射性攝取比較高。兔藥代動力學結果表明，131I-RRL能夠多而快且較長時間地結合于靶組織，具有良好的藥代動力學特征，是一種有望應用治療的藥物。131I-RRL是一種安全的、有應用價值和潛力的腫瘤放射性內照射靶向治療探針。

2.2 99 mTc標記RRL

盡管131I標記多肽RRL研究取得了成功，然而放射性核素131I并不是SPECT顯像的理想核素，其射線能量較高（364 ke V），物理半衰期較長（8.03 d）。放射性核素99mTc是目前臨床應用最為廣泛的發(fā)射純光子的單光子核素，其獲取簡單、物理半衰期短（6 h）、能量（140 ke V）適合SPECT顯像，比131I更有臨床應用價值［33］。趙倩等［34］成功設計并合成99mTc標記探針，其標記條件相對簡單，產物體外穩(wěn)定性好。新標記探針99mTc-RRL在肝癌動物模型SPECT顯像中獲得了良好的顯像效果，腫瘤組織顯像清晰且對比度好，結果表明，99mTc-RRL在原發(fā)腫瘤有巨大應用潛力。為了進一步驗證其在轉移瘤的應用前景，姚寧等［35］建立了三種肺轉移瘤動物模型（B16、Hep G2和Hela腫瘤細胞），新型分子探針99mTc-RRL在三種肺轉移瘤裸鼠體內生物分布數據顯示出良好的腫瘤靶向性，且腫瘤靶／非靶組織攝取比較高；同時三種肺轉移瘤裸鼠模型的SPECT獲得了良好的顯像效果，腫瘤病灶影像清晰，且對比度好。研究結果揭示了新型腫瘤新生血管分子探針99mTc-RRL在腫瘤轉移灶的顯像中有應用潛力，為99mTc-RRL由實驗基礎研究向臨床應用轉化提供了科學依據［36］。

3 應用展望

新型示蹤劑 RRL（Tyr-Cys-Gly-Gly-Ar g－Arg-Leu-Gly-Gly-Cys）能夠靶向結合腫瘤來源的內皮細胞，顯像腫瘤新生血管。近年來隨著腫瘤學研究的深入，逐漸認識到腫瘤血管生成在維持腫瘤組織生長、增加其侵襲性及遠處轉移能力中發(fā)揮的重要作用。目前，針對腫瘤血管生成及轉移的相關蛋白的研究成為腫瘤研究領域的重要突破點［36］。靶向腫瘤血管診斷、治療腫瘤的優(yōu)勢在于血管內皮細胞的基因組較為穩(wěn)定，很少發(fā)生突變，而腫瘤細胞本身是不穩(wěn)定的，因此無論是診斷還是治療腫瘤，靶向腫瘤血管內皮細胞相對要容易得多。并且一個內皮細胞要飼養(yǎng)數百個腫瘤細胞，針對血管內皮細胞比直接針對腫瘤細胞更為有效。在目前有關腫瘤血管的研究方法中，放射性核素示蹤方法在體內應用中具有最高的靈敏性和特異性，而且放射性核素示蹤方法簡單，便于操作，易于臨床應用［37］。目前研究較多的靶向腫瘤新生血管的顯像劑有血管內皮生長因子受體顯像［38］、整合素αvβ3小分子肽顯像［39］及其他腫瘤血管內皮細胞上標志分子顯像［40］。

小分子多肽RRL是通過大腸桿菌肽展示文庫篩選而來，國內外研究學者通過采用不同的示蹤劑標記RRL，證明了RRL能夠特異性結合于腫瘤新生血管內皮細胞，其能夠應用于放射性核素示蹤技術、超聲、光學分子功能成像技術，是一種具有良好應用前景的靶向示蹤分子。王榮福教授研究團隊在前期研究中，研制了多種同位素標記的RRL，并成功證實其在荷瘤裸鼠［27，32，34］及 荷 肺 轉 移 瘤 裸 鼠［35］活 體 的 顯像效果。姚寧等研究表明，［42］99mTc-RRL的藥代動力學符合權重為1／c2的三室模型，組織分布特點理想、無急性毒性作用、無熱原，是一種比較理想用于人體的腫瘤分子顯像劑。前期研究平臺為探針99mTc-RRL，由基礎向臨床轉化提供了大量的實驗基礎?；谀壳癙ET顯像設備的快速發(fā)展以及PET／CT融合成像相較于其他單一成像的優(yōu)勢，利用正電子核素18F標記多肽RRL研制PET分子探針成為發(fā)展的必然。將醫(yī)學生物學基礎科研成果快速且有效地轉化為可在臨床實際應用的理論、技術、方法和藥物是轉化醫(yī)學的核心［43－44］，必將使腫瘤患者真正的從基礎科研工作中獲益［45］。王榮福教授研究團隊目前正致力于利用18F標記RRL的科研工作，以期待找到合適的放射性核素標記的多肽RRL，實現理論研究向實際臨床應用的轉化。

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