制何首烏致肝損傷毒性的研究進(jìn)展

潘雪梅，房德敏

(天津市天津醫(yī)院，天津 300211)

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制何首烏致肝損傷毒性的研究進(jìn)展

潘雪梅，房德敏*

(天津市天津醫(yī)院，天津 300211)

目的：探討制何首烏的毒性機(jī)制及毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)參考。方法：檢索國(guó)內(nèi)外近十年有關(guān)制何首烏致肝損傷的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，綜述毒性物質(zhì)基礎(chǔ)、毒性機(jī)制及炮制減毒等方面的研究進(jìn)展。結(jié)果：毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面，主要以含量相對(duì)較高或易獲得的某些主要成分進(jìn)行篩選驗(yàn)證研究；毒性機(jī)制研究方面，主要從體內(nèi)代謝、細(xì)胞凋亡的某個(gè)特定通路層面探討肝損傷的可能機(jī)制；炮制減毒研究方面，主要考查不同炮制方法、時(shí)間等因素對(duì)肝毒性的影響。結(jié)論：制何首烏的肝毒性客觀存在，生熟混用、炮制不充分可能是引發(fā)肝毒性的主要因素。諸多學(xué)者從中毒機(jī)制、毒性物質(zhì)基礎(chǔ)方面深入研究，雖已取得了一定成果，但尚無定論。

制何首烏，肝損傷，毒性機(jī)制，毒性成分，炮制

何首烏為蓼科植物何首烏(Thunb)的干燥塊根，是一種常用的補(bǔ)益良藥，始載于《開寶本草》，在醫(yī)療和保健中使用廣泛，不但暢銷國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，還遠(yuǎn)銷國(guó)際市場(chǎng)。但自20世紀(jì)末，何首烏的不良反應(yīng)報(bào)道日漸增多，尤其以肝損傷為多[1]，國(guó)內(nèi)外高度重視。加拿大、英國(guó)和澳大利亞等國(guó)家的藥品監(jiān)督管理部門相繼出臺(tái)了相關(guān)的監(jiān)管政策。2014年7月，我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布第61期《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》，提示關(guān)注口服何首烏及其成方制劑可能有引起肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)。何首烏生瀉熟補(bǔ)，臨床多以制何首烏入藥。臨床報(bào)道的肝損傷病例絕大部分生熟不明，注明的幾例病例中，炮制品的發(fā)生率明顯低于生品。本文檢索相關(guān)文獻(xiàn)，從主要成分的毒性研究、制何首烏的毒理研究及炮制工藝對(duì)肝損傷作用的影響等方面，闡述制何首烏致肝損傷毒性的研究進(jìn)展。

1 制何首烏活性成分的致肝損傷毒性研究

何首烏主要成分為二苯乙烯苷類、蒽醌類、鞣質(zhì)類及聚合原花青素等，此外還含有大量的磷脂類化合物及多種微量元素。目前，毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究，主要以含量相對(duì)較高或易獲得的某些主要成分進(jìn)行篩選驗(yàn)證研究，主要集中在蒽醌類、鞣質(zhì)類及二苯乙烯苷類化合物。

1.1 蒽醌類 蒽醌類成分是何首烏致肝損傷毒性成分研究的熱點(diǎn)。蒽醌類主要包括大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、大黃酸及大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷等。大黃中化學(xué)成分與肝腎性相關(guān)性研究顯示[2]，游離及結(jié)合態(tài)蒽醌類成分都可能具有肝腎毒性，游離蒽醌類的毒性順序?yàn)椋禾J薈大黃素>大黃素甲醚>大黃酸>大黃素>大黃酚；結(jié)合態(tài)蒽醌的毒性順序?yàn)椋航Y(jié)合蘆薈大黃素>結(jié)合大黃素甲醚>結(jié)合大黃酚>結(jié)合大黃素>結(jié)合大黃酸。大黃酸濃度在15、30和60 μmol/L時(shí)均會(huì)引發(fā)HepG2細(xì)胞的乳酸脫氫酶(LDH)釋放率顯著增加，大黃素濃度在15、60和120 μmol/L也會(huì)引發(fā)HepG2細(xì)胞的LDH釋放率顯著增加，同時(shí)大黃素及大黃酸還會(huì)導(dǎo)致HepG2細(xì)胞空泡化，線粒體膜電位降低，并促進(jìn)HepG2的細(xì)胞凋亡，但對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期并無明顯影響。大黃酸對(duì)大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞也表現(xiàn)出了明顯的毒性，約25 μmol/L的大黃酸即可引起半數(shù)原代肝細(xì)胞的死亡，這種毒性與其對(duì)氧化還原循環(huán)、細(xì)胞內(nèi)巰基的氧化及游離鈣的增加相關(guān)[3]。蒽醌類成分對(duì)肝HepG2細(xì)胞的毒性順序?yàn)榇簏S酸(IC50=67.71 μmol/L)>大黃素(IC50=125.30 μmol/L)>蘆薈大黃素(抑制率未達(dá)50%)>大黃酚和大黃素甲醚(均無明顯抑制作用)[4]。在制何首烏不同大黃蒽醌類成分致肝損傷研究[5]中，將制何首烏大黃蒽醌類成分給大鼠連續(xù)灌胃3個(gè)月，各給藥組大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)均有不同程度的升高，與空白組比較，其中的大黃酚組大鼠血清(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)升高具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外研究[6]發(fā)現(xiàn)，大黃酚可顯著提高大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量(P<0.05)，而大黃素、大黃酸無顯著影響。

馬致潔[7]考查何首烏及大黃素、大黃酸、沒食子酸三個(gè)單體對(duì)體外培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞系L02細(xì)胞毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥24 h后，何首烏、大黃素、大黃酸、沒食子酸及三個(gè)單體聯(lián)合給藥組均出現(xiàn)胱酰肽酶Caspase-3和Bax表達(dá)量的提高，與對(duì)照組相比，大黃素對(duì)Caspase-3和Bax表達(dá)量具有顯著的促進(jìn)作用，沒食子酸作用最小；大黃酸組Caspase-9蛋白表達(dá)提高，其他實(shí)驗(yàn)組則出現(xiàn)表達(dá)下降的結(jié)果，其中大黃素對(duì)Caspase-9蛋白表達(dá)的下調(diào)作用最大，沒食子酸和何首烏對(duì)Caspase-9的作用次之；何首烏組Bcl-2表達(dá)量下降，其他各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2表達(dá)量均提高，大黃酸對(duì)Bcl-2的促進(jìn)表達(dá)作用最強(qiáng)，大黃素較弱。表明何首烏及其主要成分與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路Caspase通路有關(guān)，能調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax兩個(gè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步表明何首烏及其主要成分有可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)L02細(xì)胞產(chǎn)生毒性的，而何首烏中大黃素和大黃酸有可能是引起肝細(xì)胞損傷的主要成分。

1.2 二苯乙烯苷類 二苯乙烯苷為制何首烏的主要活性成分，但其致肝損傷作用的研究不多。胡錫琴等[8]分別按150、300、600 mg/kg劑量給大鼠灌胃，連續(xù)90 d后停藥，恢復(fù)15 d，分別于第60、90和105日時(shí)，觀察何首烏中2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(二苯乙烯苷)對(duì)于大鼠肝臟酶及蛋白等生化指標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，給藥第60日，各劑量組球蛋白(GLB)顯著升高，白蛋白和球蛋白比(A/G)顯著降低；給藥第90日，中劑量與大劑量組的ALT和AST顯著升高，中劑量組白蛋白(ALB)顯著降低；停藥第15日，LDH顯著降低，其他指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明二苯乙烯苷大劑量長(zhǎng)期使用時(shí)，會(huì)對(duì)肝臟造成一定的損傷，停藥后可恢復(fù)肝功正常。

1.3 鞣質(zhì)類 鞣質(zhì)毒性的研究已有50年歷史，早在第二次世界大戰(zhàn)期間已懷疑其肝毒性。鞣酸能引起放牧動(dòng)物的肝損害，是過去隱源性肝損傷的主要原因。鞣質(zhì)分為縮合鞣質(zhì)和可水解鞣質(zhì)，縮合鞣質(zhì)對(duì)肝臟無毒，可水解鞣質(zhì)的毒性較高，對(duì)肝臟有嚴(yán)重的損害作用。何首烏中的鞣質(zhì)量高達(dá)15.7%[9]。研究顯示，何首烏中鞣質(zhì)對(duì)大鼠肝臟具有一定損傷作用[10]。胡錫琴等[11]研究何首烏中提取物鞣質(zhì)對(duì)大鼠肝臟生化指標(biāo)的影響。結(jié)果：①與對(duì)照組相比，給藥60 d時(shí)，大劑量組(相當(dāng)于成人用量的100倍)大鼠血清中ALT顯著升高(P<0.01)，中劑量組(相當(dāng)于成人用量的50倍)升高(P<0.05)；堿性磷酸酶(ALP)中、小劑量組(相當(dāng)于成人用量的25倍)有所降低(P<0.05)；甘油三酯(TG)大劑量組升高(P<0.05)；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)大、小劑量組升高(P<0.05)；總膽紅素(TBIL)大、中、小劑量組均顯著性降低(P<0.01)。②給藥90 d后，大劑量組大鼠血清ALT、GGT均升高(P<0.05)。③恢復(fù)15 d后，各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組均無顯著差異。表明何首烏提取物鞣質(zhì)長(zhǎng)期大劑量灌胃對(duì)大鼠肝臟有損害，中劑量短期內(nèi)對(duì)肝臟有所損害，小劑量無明顯肝損害，但其對(duì)肝臟的損害在停藥后均可以恢復(fù)。

另外胡錫琴等[12]研究發(fā)現(xiàn)，何首烏提取物鞣質(zhì)與二苯乙烯苷不同配比可致不同程度的大鼠肝臟損傷。結(jié)果顯示，二苯乙烯苷對(duì)鞣質(zhì)的肝臟損傷作用有一定的協(xié)同作用。在肝損傷方面，二苯乙烯苷能夠使鞣質(zhì)的作用不可逆，但可以減輕鞣質(zhì)造成的肝臟內(nèi)三酰甘油聚集。鞣質(zhì)與二苯乙烯苷1∶1配比組，對(duì)肝臟的損傷作用在恢復(fù)期后仍然存在。實(shí)驗(yàn)顯示，AST、ALT、膽堿酯酶(CHE)、LDH、總蛋白(TP)、ALB、ALP在不同給藥時(shí)間均呈不同程度變化，與空白對(duì)照組比較或者組間比較，給藥60 d時(shí)達(dá)到高峰期，給藥90 d和恢復(fù)期CHE、LDH則呈顯著性降低，說明肝損害沒有完全恢復(fù)。鞣質(zhì)與二苯乙烯苷2∶1配比組有一定的肝臟損傷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALT和AST在給藥60 d達(dá)到高峰，90 d和恢復(fù)期均下降至正常，但是CHE、LDH、ALP直至恢復(fù)期多繼續(xù)下降(LDH、ALP下降的原因有待研究)，說明該配比組較其他給藥組肝損傷略明顯?？梢姡焚|(zhì)與二苯乙烯苷配比可損傷到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，而且這種損傷不可逆。

1.4 未知成分 呂旸[13]應(yīng)用中藥活性/毒性作用與化學(xué)成分的相關(guān)性研究方法，將不同提取方法何首烏的UPLC指紋圖譜與何首烏對(duì)人肝細(xì)胞的毒性進(jìn)行PLS回歸分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與肝細(xì)胞毒性相關(guān)性較大的成分，但其結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步研究。

2 制何首烏致肝損傷機(jī)制研究

2.1 對(duì)血液生化酶的影響及肝臟病理研究 胡錫琴等[14,15]研究不同劑量制何首烏濃縮水煎液對(duì)大鼠肝臟的損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量組在不同階段對(duì)血清中ALT、ALP、AST呈現(xiàn)不同程度的影響。與對(duì)照組比較，大(40 g/kg·d-1)、中(20 g/kg·d-1)劑量組大鼠灌胃12周以上ALP、AST顯著升高(P<0.05)，灌胃時(shí)間少于12周和停藥2周后ALT、AST、ALP各指標(biāo)與對(duì)照組比較無顯著性差異；小劑量組(10 g/kg·d-1)不同階段均無顯著性差異。同時(shí)，肝臟病理檢查結(jié)果顯示[16]，各劑量組肝臟病理切片光鏡下見，不同劑量組肝細(xì)胞內(nèi)有不同程度的脂肪變性，少數(shù)大鼠肝細(xì)胞萎縮、肝血竇擴(kuò)張充血，偶見炎細(xì)胞浸潤(rùn)；大劑量組脂肪變性例數(shù)多于中、小劑量組，飼喂時(shí)間長(zhǎng)的大鼠病理切片顯示重于飼喂時(shí)間短的大鼠，雌性鼠出現(xiàn)肝臟脂肪變性多而重于雄性鼠。表明，制何首烏水煎濃縮液長(zhǎng)時(shí)間較大劑量灌胃時(shí)對(duì)大鼠肝臟有一定程度的毒副作用，并且這種肝毒性呈現(xiàn)“量-時(shí)-毒”相關(guān)性，且為可逆性損傷，隨著停藥可以逐漸恢復(fù)正常。

通常胞內(nèi)酶ALT、AST在急性肝損傷、重度損傷時(shí)從肝細(xì)胞內(nèi)釋放入血，血清中ALT、AST能明顯升高，而在慢性輕度損傷時(shí)，血清中ALT、AST升高不明顯。李玥等[17]觀察制何首烏醇提物不同劑量長(zhǎng)期(60 d)給藥對(duì)小鼠肝臟的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各劑量組血液生化指標(biāo)及病理組織學(xué)的檢測(cè)與空白組相比均無顯著性差異。提示制何首烏醇提物長(zhǎng)期給藥產(chǎn)生的肝臟損傷可能是非急性肝損傷，生化指標(biāo)表現(xiàn)不顯著。

2.2 致肝損傷的化學(xué)機(jī)制研究 自由基和脂質(zhì)過氧化在肝損傷中起著十分重要的作用。肌體通過酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基，攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并由此形成脂質(zhì)過氧化物，使組織細(xì)胞受損傷。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物，其含量的變化可反映組織細(xì)胞的損傷程度。谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)存在肌體各種組織中，以肝臟為最多，其具有消除體內(nèi)自由基和解毒雙重功能，此酶活力的大小，可反映肌體抗氧化能力的高低，并對(duì)肝臟的早期損傷及肝癌的早期診斷具有一定價(jià)值。單胺氧化酶(MAO)是診斷肝硬化的一項(xiàng)重要指標(biāo)，肝硬化時(shí)MAO活性常明顯增高。

胡錫琴等[15]從化學(xué)機(jī)制角度研究制何首烏致肝損傷的毒性機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量制何首烏水煎濃縮液大鼠灌胃90d，肝組織勻漿檢測(cè)，大劑量組(40 g/kg·d-1)MDA與對(duì)照組比較有顯著升高(P<0.05)；其他劑量組無顯著性差異。MAO、GSH-ST各劑量組均無顯著性差異。提示，制何首烏肝損傷可能與脂質(zhì)過氧化相關(guān)。在病理情況下，氧自由基過多產(chǎn)生，引發(fā)肝細(xì)胞膜、線粒體膜及溶酶體膜的脂質(zhì)過氧化，使肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物及降解產(chǎn)物(如MDA)可進(jìn)一步加重生物膜損傷，加快肝細(xì)胞壞死進(jìn)程，最終使肝細(xì)胞受損。

馬致潔[7]以何首烏致肝損傷患者的血清為研究對(duì)象，采用LC-MS/MS Q-TOF技術(shù)，表征臨床何首烏肝毒性患者血清與正常人血清的代謝圖譜差異，結(jié)合代謝組學(xué)分析手段，篩選了能準(zhǔn)確評(píng)估何首烏致肝毒性引發(fā)代謝紊亂的特征標(biāo)志物40個(gè)，代謝通路分析推測(cè)何首烏肝毒性可引發(fā)肝臟損傷和肝膽淤積，其機(jī)制可能與脂質(zhì)過氧化有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)1個(gè)與患者治療轉(zhuǎn)歸過程相關(guān)的標(biāo)志物四氫皮質(zhì)酮，可望用于何首烏肝損傷患者的預(yù)后，且在典型患者和何首烏致肝損傷的大鼠中被驗(yàn)證。

2.3 致肝損傷的免疫機(jī)制研究 細(xì)胞凋亡是指生物肌體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，通過自身基因調(diào)控，使生理上不需要的細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)有序消亡的過程，其不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞死亡方式[18,19]。細(xì)胞凋亡除了維持正常生理平衡外，還與許多疾病的形成密切相關(guān)。在肝臟疾病或肝損傷中，往往伴有肝細(xì)胞凋亡。肝細(xì)胞的凋亡機(jī)制很復(fù)雜，目前認(rèn)為，肝細(xì)胞以死亡受體介導(dǎo)的凋亡和線粒體誘導(dǎo)的凋亡為主要的凋亡形式[20]。

衛(wèi)培峰等[6]研究發(fā)現(xiàn)，制何首烏(6.67 g/kg·d-1)大鼠灌胃連續(xù)3個(gè)月，可誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡，并使血清TNF-α含量明顯升高。提示制何首烏導(dǎo)致的肝臟損害可能是由TNF-α作為刺激肝細(xì)胞凋亡的正性觸發(fā)因子誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡而發(fā)生的。

胡錫琴等[21]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠連續(xù)灌胃制何首烏水煎濃縮液(30 g/kg·d-1)90 d，給藥60 d時(shí)與對(duì)照組比較，大鼠血清中免疫球蛋白M(IgM)含量顯著性升高(P<0.05)，給藥90d時(shí)大鼠胸腺質(zhì)量顯著性升高(P<0.05)，免疫球蛋白G(IgG)的含量無顯著性差異；未檢測(cè)到免疫球蛋白A(IgA)的含量。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，血清IgM升高的大鼠，多數(shù)伴有ALP、ALT或AST的升高?？偨Y(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，何首烏大劑量長(zhǎng)期飼喂大鼠，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體液免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)，亦是大鼠肝臟損傷的表現(xiàn)。其機(jī)制可能是長(zhǎng)期給予大鼠何首烏后，何首烏或其代謝產(chǎn)物進(jìn)入肝細(xì)胞，使肝細(xì)胞膜的抗原性發(fā)生改變，在肝細(xì)胞表面形成小分子蛋白質(zhì)抗原，并與細(xì)胞表面的受體結(jié)合成復(fù)合物，使肌體產(chǎn)生抗體，再通過體液免疫將其清除。而肝臟為藥物轉(zhuǎn)化、代謝的主要器官，該實(shí)驗(yàn)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)給予大劑量何首烏，引起動(dòng)物體液免疫增強(qiáng)，從而導(dǎo)致血清IgM升高，最終引起肝臟損傷。

在肝臟的生物轉(zhuǎn)化過程中，細(xì)胞色素P450酶(CYP450)是Ⅰ相催化反應(yīng)中主要酶，是催化多種藥物、前毒物、前致癌物等外源性物質(zhì)的氧化和還原代謝的主要酶類。胡錫琴等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠連續(xù)灌胃制何首烏水煎濃縮液(30 g/kg·d-1)90 d，對(duì)大鼠肝臟微粒體CYP450無顯著影響。王文靜等[23]進(jìn)一步研究生何首烏、制何首烏對(duì)SD大鼠肝微粒體CYP450以及血液生化酶的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，予SD大鼠兩種相同劑量何首烏連續(xù)灌胃90 d，生何首烏組肝微粒體蛋白顯著性下降，CYP450含量顯著增高(P<0.01)，制何首烏組無明顯變化；血液生化酶中生何首烏組的血清ALT、AST顯著性降低，制何首烏血清ALP顯著性升高；生何首烏和制何首烏的血清TP、TG均顯著性降低；血清尿素氮(BUN)中二者均呈下降趨勢(shì)，但生何首烏具有顯著性；肌酐(CREA)二者均呈顯著性下降趨勢(shì)，表明生何首烏致肝損傷并有CYP450的明顯升高，制何首烏對(duì)CYP450無影響。生何首烏和制何首烏能夠影響血液生化酶，生何首烏降低ALT、AST，制何首烏升高ALP，二者同時(shí)降低TG、BUN和CREA。提示生何首烏、制何首烏致大鼠肝物質(zhì)代謝途徑的作用機(jī)制有所不同。

細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)是一種受乙醇誘導(dǎo)的CYP450亞族，能夠代謝約50%的臨床用藥，在肝臟中占肝細(xì)胞色素酶總量的7%，是肝細(xì)胞色素酶的重要成分。有研究表明，CYP2E1僅在肝中表達(dá)，是肝的特異性功能酶。目前，通過CYP2E1代謝的物種已經(jīng)被確定的近100種，其中大部分是前致癌物和前毒物，少部分為藥物，多為親脂性小分子化合物，尤其在一些肝毒性物質(zhì)(如乙醇、脂肪酸、亞硝胺、酮體、四氯化碳等)氧化代謝，CYP2E1起著重要作用。若CYP2E1活性受到抑制，則增加了該亞型代謝的藥物的濃度，延長(zhǎng)藥理作用時(shí)間，從而可增加藥物的不良反應(yīng)。同時(shí)，CYP2E1 mRNA表達(dá)水平往往與代謝活性相關(guān)，但是受體內(nèi)外諸多因素的影響，如在饑餓、禁食及糖尿病等。張敏[5]研究發(fā)現(xiàn)，制何首烏可顯著抑制大鼠肝組織CYP2E1 mRNA的表達(dá)，對(duì)CYP2E1酶活性有一定的誘導(dǎo)作用。由于酶活性測(cè)定結(jié)果與mRNA表達(dá)水平不一致，說明CYP2E1酶活性的升高可能不是通過影響基因轉(zhuǎn)錄水平而影響其蛋白水平來實(shí)現(xiàn)。推測(cè)，CYP2E1酶活性的誘導(dǎo)不是通過核受體介導(dǎo)，而是通過穩(wěn)定CYP2E1酶蛋白，從而減少CYP2E1的降解及延長(zhǎng)其代謝作用而起的誘導(dǎo)作用。

3 炮制與肝損傷相關(guān)性研究

3.1 炮制方法與時(shí)間對(duì)肝損傷的影響 中藥炮制乃是祖國(guó)醫(yī)學(xué)中的重要組成部分。清代《修事指南》載有“炮制不明，藥性不確，則湯方無準(zhǔn)，而病證不驗(yàn)也?！焙问诪跎飚愔?，《本草匯言》指出何首烏“生用氣寒，性斂，有毒；制熟氣溫，無毒”。腹腔給藥時(shí)，生何首烏的LD50為2.7 g/kg，制何首烏LD50為169.4 g/kg[24]。一項(xiàng)比較何首烏生品和炮制品對(duì)大鼠肝臟損傷作用差異的研究顯示，以生何首烏、制何首烏75%乙醇提取物按可比生藥量(50 g/kg)，連續(xù)予大鼠灌胃6周后，生何首烏組大鼠血清ALT、AST、ALP、結(jié)合膽紅素(DBIL)、TBIL顯著性升高(P<0.05或0.01)；間接膽紅素(IBIL)、總膽汁酸(TBA)顯著性降低(P<0.05或0.01)；制何首烏組血清各項(xiàng)指標(biāo)變化不明顯。病理組織顯示，生何首烏組肝組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，局部可見肝細(xì)胞壞死；制何首烏組肝臟組織基本正常，未見明顯病變現(xiàn)象[25]。在內(nèi)毒素特異質(zhì)模型上，接近臨床用藥劑量的生首烏即可表現(xiàn)出肝損傷作用，而制首烏表現(xiàn)出同樣肝損傷其劑量須擴(kuò)大4倍，提示炮制可降低何首烏的特異質(zhì)肝毒性[26]。

何首烏炮制不及或太過會(huì)影響成品質(zhì)量。目前，各地現(xiàn)行炮制規(guī)范多沿用歷史的習(xí)慣與經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)識(shí)不一，差別較大。而且現(xiàn)行控制標(biāo)準(zhǔn)主要是基于指標(biāo)性成分的含量測(cè)定，與安全性關(guān)聯(lián)不夠緊密。研究顯示[27,28]，市售制何首烏質(zhì)量參差不齊，二苯乙烯苷和游離蒽醌的含量及粉末顏色均存在較大差異；網(wǎng)購(gòu)的26批制何首烏相當(dāng)部分炮制減毒不充分，對(duì)肝細(xì)胞毒性(IC50)差異較大，其中4批樣品的毒性甚至大于生何首烏對(duì)照藥材。

炮制的時(shí)間和工藝均對(duì)其肝毒性有影響，適當(dāng)?shù)呐谥瓶梢詼p少甚至消除對(duì)肝臟的損害。呂旸[29]從生物檢定的角度，應(yīng)用肝細(xì)胞毒價(jià)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)22批生、制何首烏質(zhì)量。結(jié)果18種制何首烏毒性均低于生品，并隨著炮制時(shí)間的增加而降低，最終趨于穩(wěn)定。李衛(wèi)先等[30-32]以ALP、AST、ALT為指標(biāo)，考查籠屜蒸不同時(shí)間的制何首烏肝損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，72 h組、24 h組、12 h組及生品組的ALP、AST、ALT均顯著升高(P<0.05)，而48 h組和恢復(fù)期無顯著性差異。同法考查高壓鍋蒸不同時(shí)間的制何首烏肝損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，9 h組、5 h組、3 h組及生品組的ALP、AST、ALT均顯著升高(P<0.05)，而7 h組和恢復(fù)期無顯著性差異。同法考查傳統(tǒng)蒸曬重復(fù)不同次數(shù)的制何首烏肝損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，九蒸九曬組、五蒸五曬組、三蒸三曬組及生品組的ALP、AST、ALT均顯著升高(P<0.05)，而七蒸七曬組和恢復(fù)期無顯著性差異。因此，何首烏炮制時(shí)，采取籠屜蒸48 h、高壓鍋蒸7 h或七蒸七曬工藝較好。另有研究[28,33]發(fā)現(xiàn)，何首烏常壓清蒸法減毒速度較慢，蒸制12 h毒性僅下降13.6%；高壓清蒸法和高壓黑豆汁蒸法減毒速度相對(duì)較快，蒸制5～6 h毒性下降22.1%左右，且趨于穩(wěn)定，且高壓清蒸3h減毒效果較佳。

3.2 不同炮制品肝損傷比較研究 根據(jù)歷代炮制方法記載，何首烏有20多種炮制方法，常見的方法有清蒸，黑豆制，酒制，黑豆、黃酒制等。炮制方法不同，其內(nèi)在成分含量或結(jié)構(gòu)變化不同，對(duì)肝臟的毒性也存在不同程度的差別。

張敏[5]考查清蒸和黑豆汁蒸制不同時(shí)間的何首烏炮制品對(duì)大鼠肝臟的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同炮制品水煎濃縮液(用藥量相當(dāng)于成人用藥量的10倍)大鼠連續(xù)灌胃90 d，與空白組比較，各給藥組大鼠血清ALT無顯著性差異，AST均顯著升高，其中清蒸組升高非常顯著(P<0.01)；大鼠肝組織CYP2E1相對(duì)表達(dá)量(V值)與CYP2E1的基因mRNA水平顯著降低，其中清蒸組結(jié)果與空白組最為接近，黑豆汁制首烏各組隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)CYP2E1 mRNA表達(dá)似有增強(qiáng)的趨勢(shì)；各給藥組均對(duì)大鼠肝微粒體CYP2E1酶活性有誘導(dǎo)作用，且黑豆汁制16h、32h誘導(dǎo)作用顯著(P<0.05)，清蒸與黑豆汁制8h無顯著性差異；肝組織病理檢查，各給藥組大鼠肝組織細(xì)胞均有不同程度的病變，多數(shù)表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。可知，不同炮制品對(duì)大鼠肝細(xì)胞存在不同程度的損傷，炮制方法和炮制時(shí)間可能對(duì)這種肝毒性存在一定的影響。

吳婷[10]通過長(zhǎng)期(90 d)灌服大鼠何首烏生品及不同炮制品水煎濃縮液，探求何首烏生品及不同炮制品是否具有致肝臟損傷作用，以及這種作用隨著炮制方法的不同是否有解除或降低的趨勢(shì)；何首烏生品及不同炮制品導(dǎo)致肝臟損傷的發(fā)生是否與肝細(xì)胞凋亡有關(guān)；同時(shí)分析何首烏中致肝細(xì)胞損傷的物質(zhì)化學(xué)成分。結(jié)果顯示：①何首烏生品及不同炮制品水提物較醇提物均含有少量大黃素，微量大黃素甲醚(除九蒸九曬何首烏未檢測(cè)出)。何首烏生品及不同炮制品水提物中均含有鞣質(zhì)，其中清蒸組(清蒸32h)含量最高，九蒸九曬組其次。②各給藥組雄性大鼠體重與空白對(duì)照組比較，無顯著差異。雌性大鼠體重黑豆汁制首烏組(用藥量相當(dāng)于成人10倍量)與何首烏九蒸九曬組給藥第3周與空白對(duì)照組比較，有明顯差異(P<0.05)；給藥第4周，何首烏生品組、清蒸高劑量組(用藥量相當(dāng)于成人50倍量)、清蒸低劑量組(用藥量相當(dāng)于成人10倍量)、何首烏九蒸九曬組(用藥量相當(dāng)于成人10倍量)與空白對(duì)照組比較，有明顯差異(P<0.05)。③與空白對(duì)照組比較，何首烏生品組TBIL、IBIL明顯升高(P<0.05)；黑豆汁制首烏組TBIL、IBIL顯著升高(P<0.01)；清蒸低劑量組IBIL明顯升高(P<0.05)，GLO明顯降低(P<0.05)；清蒸高劑量組IBIL顯著升高(P<0.01)；何首烏九蒸九曬DBIL顯著降低(P<0.01)、IBIL顯著升高(P<0.01)，GLO明顯降低(P<0.05)，ALT、AST明顯升高(P<0.05)。④肝臟組織病理切片顯示，光鏡下何首烏生品組、清蒸低劑量組病變以肝竇充血為主，黑豆汁制首烏組、清蒸高劑量組、何首烏九蒸九曬組除可見肝竇充血，肝細(xì)胞萎縮偶見點(diǎn)狀壞死，何首烏九蒸九曬組還可見肝細(xì)胞脂肪變性。⑤何首烏生品組、清蒸低劑量組、黑豆汁制首烏組未見明顯細(xì)胞核凋亡，可見肝竇中散在血紅細(xì)胞。清蒸高劑量組、何首烏九蒸九曬組可見細(xì)胞核凋亡。與空白對(duì)照組比較，何首烏清蒸高劑量組大鼠肝組織凋亡指數(shù)明顯增高(P<0.05)；何首烏九蒸九曬組大鼠肝組織凋亡指數(shù)顯著性增高(P<0.01)。表明：①何首烏中鞣質(zhì)對(duì)大鼠肝臟具有一定損傷作用，大黃素對(duì)肝損傷作用有待進(jìn)一步研究。②何首烏生品及不同炮制品對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育有一定毒性影響，尤其是雌性體重方面，但不能排除人為因素(如灌胃)對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育影響。③大鼠給藥3個(gè)月，何首烏生品及炮制品均不同程度對(duì)大鼠肝臟造成損傷，以何首烏九蒸九曬組顯著。何首烏清蒸高劑量組、何首烏九蒸九曬組通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡造成肝損害，其中清蒸何首烏對(duì)肝的損害程度與給藥劑量成正相關(guān)性。

4 結(jié)語(yǔ)

制何首烏作為臨床常用滋補(bǔ)中藥，具有廣泛的藥理活性和藥用價(jià)值。何首烏炮生為熟內(nèi)在成分明顯改變，致肝物質(zhì)代謝途徑的作用機(jī)制發(fā)生變化。但其肝損傷不良反應(yīng)臨床仍時(shí)有報(bào)道，其肝毒性不容忽視。諸多學(xué)者從毒性物質(zhì)基礎(chǔ)、毒性體內(nèi)過程、炮制減毒等多方面深入研究，雖已取得了一定研究成果，但對(duì)于其中毒機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)仍眾說紛紜、尚無定論。因此，仍需從體內(nèi)代謝或細(xì)胞凋亡的諸多通路層面，進(jìn)一步探討中毒可能機(jī)制，為臨床不良反應(yīng)提供更充分的解釋，為臨床合理用藥提供有效參考。此外，目前市售制何首烏質(zhì)量參差不齊，質(zhì)量不佳是引發(fā)肝毒性的可能因素之一。嚴(yán)格制定炮制標(biāo)準(zhǔn)，尋求能夠兼顧療效與安全的檢測(cè)方法，杜絕生熟混用，合理用藥，是減少其不良反應(yīng)發(fā)生的有效手段。

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2014-11-06

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1006-5687(2015)06-0057-06

*通訊作者：房德敏，E-mail：fangdeminwx@163.com。