流感嗜血桿菌自身因子在生物膜形成過程中的作用

高雪，尚小領(lǐng)，張玉妥△

流感嗜血桿菌自身因子在生物膜形成過程中的作用

高雪1，尚小領(lǐng)2，張玉妥1△

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）是人體上呼吸道常見寄生菌，當(dāng)機體免疫力低下時，可引起發(fā)??；當(dāng)Hi在感染部位形成生物膜（Biofilm，BF）后，對抗生素的敏感性下降，常引起疾病慢性化，使臨床治療變得棘手。近年來，Hi BF的致病性和BF形成相關(guān)自身因子已漸漸成為臨床和基礎(chǔ)研究學(xué)者關(guān)注的熱點，本文就近年來國內(nèi)外的報道綜述如下。

嗜血菌，流感；生物膜；藥物耐受性；綜述

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）是革蘭陰性菌，常寄居在人上呼吸道，在人體免疫力低下時可引起感染，是一種常見的條件致病菌。細(xì)菌生物膜（Biofilm，BF）是具有一定空間構(gòu)型的細(xì)菌群體，由被覆細(xì)菌、脂多糖、基質(zhì)蛋白、核酸等成分組成。已經(jīng)證實，很多臨床疾病和Hi BF有關(guān)，如慢性阻塞性肺疾?。–OPD）急性發(fā)作［1］、囊性肺纖維化（CF）［2］、慢性鼻-鼻竇炎（CRS）［3-4］、分泌性中耳炎（OMA）［5］、腺樣體肥大［6-7］等。Hi BF的形成受其自身多種因素的參與和影響，主要包括以下幾點。

1　菌毛（pili）

Pili是Hi重要的抗原和毒力因子，在BF形成早期有黏附和定植作用。較早的研究發(fā)現(xiàn)，pili抗原丟失的變異株生產(chǎn)BF的能力僅為親本株的1/4～1/3［8］。Ⅳ型菌毛（TypeⅣpili，Tfp）是在Hi、奈瑟球菌、腸致病大腸桿菌等革蘭陰性菌細(xì)胞端部的短纖毛，由呈螺旋形排列的蛋白亞基構(gòu)成。Tfp和細(xì)菌的蹭行運動有關(guān)，能介導(dǎo)細(xì)菌吸附到宿主上皮細(xì)胞，引發(fā)后續(xù)生理活動。用熒光素標(biāo)記的Tfp特異性抗體孵育Hi BF，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Tfp在BF內(nèi)部呈纖細(xì)的的小橋梁結(jié)構(gòu)，構(gòu)成菌體之間輸送營養(yǎng)物質(zhì)的“水通道”，在細(xì)菌之間起連接和運輸作用［9］。Tfp由pilABCD、comABCDEF兩個操縱子共同調(diào)控編碼。PilA是Tfp中主要的蛋白亞基，與該蛋白的功能關(guān)系密切。一個PilA缺陷的突變株，其形成BF的生物量是其親本株的1/2，而重組基因補足株生物量是其親本株的3/4；PilA和細(xì)菌的黏附能力關(guān)系密切［10］。PilB 和Tfp三磷酸腺苷酶具有同源性，PilC是普通分泌途徑跨膜蛋白（general secretory pathway transmembrane protein，Gsp）家族的細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，PilD和Ⅳ型前菌毛蛋白同源。ComE是一種分泌素，ComA、ComB、ComC、ComD則與ComE分泌素活性的穩(wěn)定性有關(guān)，ComF的功能還不清楚；pil和com基因簇中每個基因的缺失突變都會引起B(yǎng)F厚度、密度以及總生物量的減少，pilA和comC兩個基因的影響最顯著［11］。

2　蛋白質(zhì)

2.1Hi的氧化-還原系統(tǒng)Hi的氧化-還原系統(tǒng)不完善，過氧化物酶-谷氧還原蛋白（peroxiredoxin-glutaredoxin，PGdx）屬于Hi硫醇依賴過氧化物酶家族，包含一個N末端過氧化物酶區(qū)和一個C末端谷氧還原蛋白區(qū)，具有感應(yīng)、對抗環(huán)境氧化壓力、監(jiān)管細(xì)胞凋亡等功能。缺失PGdx蛋白的變異株形成BF的生物量比其親本株減少25%～50%［12］。

2.2Hi敏感抗菌肽（sap）細(xì)菌為了生存，必須從宿主獲取生存所需的鐵和血紅素。Sap除了能抵抗宿主免疫作用，還可以調(diào)節(jié)亞鐵血紅素的轉(zhuǎn)運。sapABCDFZ編碼6個蛋白，SapA是一個胞質(zhì)底物結(jié)合蛋白，SapB和SapC是兩個跨膜通透性酶蛋白，SapD和SapF是兩個和內(nèi)膜基質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)的腺苷亞基（ATPase subunits），SapZ作用尚不明確。SapF在Hi對亞鐵血紅素的獲取與細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)運和調(diào)解中有著關(guān)鍵作用，SapF缺失變異株在南美栗鼠中耳和鼻腔形成BF的黏附性下降［13］。

2.3P6蛋白是Hi高度保守的細(xì)胞外膜蛋白（outer membrane protein，OMP），其分子質(zhì)量為16 ku。在動物實驗中，基于慢性中耳炎是一種BF感染性疾病的認(rèn)識，用純化后的P6蛋白免疫動物，發(fā)現(xiàn)免疫后動物中耳炎的發(fā)病率并無明顯的下降，因此推測，P6蛋白在Hi BF形成過程的作用并不是很重要［8，14］。

2.4Haps蛋白是Hi的一種表面黏附分子，屬于自我轉(zhuǎn)運蛋白家族，具有絲氨酸（Ser，S）活性，能介導(dǎo)Hi吸附于人呼吸道上皮細(xì)胞，在BF形成前期，可以促使Hi聚集和微菌落形成；Haps蛋白還能與細(xì)菌胞外基質(zhì)中的黏連蛋白、膠原等結(jié)合，胞外基質(zhì)在細(xì)菌群體與外界環(huán)境異物（機體植入物、組織細(xì)胞等）之間起黏附作用［14］。

2.5HWM1/2蛋白HWM1/2蛋白能夠和紅細(xì)胞表面受體發(fā)生凝集反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)菌與上皮細(xì)胞的黏附，還可以綁定細(xì)胞表面胞外糖蛋白，與鄰近細(xì)菌形成一種穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，維持BF內(nèi)菌體之間的連接［14］。

2.6IgA1蛋白酶是一種水解酶，可以水解人免疫球蛋白IgA1鉸鏈區(qū)多肽序列TPPTPSPSTPPTPSPS，為細(xì)菌提供氨基酸；它還參與激膚釋放酶-激膚系統(tǒng)的級聯(lián)反應(yīng)，直接或間接降解宿主蛋白質(zhì)，引起組織破壞。也可通過降解宿主免疫球蛋白及影響補體因子等途徑削弱宿主防御功能。在Hi BF的頂部，IgA1蛋白酶濃度比BF中部和底部高，因此，IgA1蛋白酶對BF的結(jié)構(gòu)具有保護作用［14］。

2.7Hia蛋白是一種Hi表面的黏附素，由hia基因編碼。在莢膜型Hi中，hia以同源基因hsf的形式存在。Hia有兩個同源結(jié)合區(qū)HBD1、HBD2，能和人呼吸道細(xì)胞表面受體發(fā)生結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)菌的定植及微菌落形成。體外BF定量實驗發(fā)現(xiàn)，hia陽性的菌株形成BF的能力顯著增強［2］。

3　DNA

DNA是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)，除了存在于細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)外，在BF形成過程中，DNA還以胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）的形式出現(xiàn)在BF胞外基質(zhì)中［15-16］。4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）是一種能和活體DNA特異性結(jié)合的熒光染料，在358～461 nm處發(fā)出藍(lán)光。用DAPI標(biāo)記Hi特異性抗體，孵育Hi BF后，激光共聚焦顯微鏡觀察，在BF中，DNA呈現(xiàn)一種厚實的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是BF的基本骨架和主要成分，用DNaseⅠ酶處理早期的BF，發(fā)現(xiàn)BF的發(fā)育受到抑制，結(jié)構(gòu)變得疏松而容易解離［9］。

人β防御素3（Human-defensin-3，hBD-3）是一種能同時作用于革蘭陰性和革蘭陽性菌的抗菌肽，在皮膚和腔道等部位分泌表達。Hi BF中的胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）能和hBD-3結(jié)合，抵抗人體固有免疫反應(yīng)，維持BF的結(jié)構(gòu)和BF內(nèi)細(xì)菌的生存［17］。

DNA結(jié)合蛋白（DNA-binding proteins from starved cells，Dps）屬于鐵蛋白超家族，能結(jié)合鐵離子，為細(xì)菌生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。Dps在不同的Hi菌株間高度保守，氨基酸排列順序完全一致。在BF中，Dps的轉(zhuǎn)錄隨膜內(nèi)氧化壓力的增加而增加。Dps缺失后，細(xì)菌對外界氧化壓力敏感性提高；Dps的存在，可以保護細(xì)菌抵抗氧化作用繼續(xù)生存；Dps也可以結(jié)合細(xì)菌DNA，形成一種穩(wěn)定有序的Dps-DNA復(fù)合體，增強細(xì)菌BF對宿主黏膜的黏附性，抵抗宿主免疫清除作用［18］。

4　脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS）

LOS是Hi表面的一種黏附素，其本質(zhì)是一種丟失了特異性O(shè)抗原的脂多糖，結(jié)構(gòu)中含有多個成分和結(jié)構(gòu)不同的糖基，LOS含有類似于人糖脂類碳水化合物的決定基，可逃避來自人體天然免疫的攻擊。

N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetyl-neuraminic，NeuAc）是一種唾液酸（sialic acid，SA），唾液酸在細(xì)胞和細(xì)胞、細(xì)胞和環(huán)境異物的黏附活動中有著重要的作用。Hi從環(huán)境獲取NeuAc后，可以通過CMP-NeuAc合成酶siaβ運輸作用，使NeuAc先連接到一個胞苷-單磷酸上，然后再通過胞苷-單磷酸將NeuAc連接到LOS糖鏈蛋白上，使LOS唾液酸化。流室法培養(yǎng)流Hi發(fā)現(xiàn)，一個CMP-NeuAc合成酶siaβ缺失、LOS不能完成唾液酸化的菌株，其形成BF的能力顯著下降；同時，與親本株相比，該菌株在大鼠中耳和肺部BF黏附時間顯著縮短［19］。磷酸膽堿（phosphorylcholine，PCho）也是LOS化學(xué)修飾的一種形式，Hi基因序列存在一個偶然位點（contingency loci）lic1，共包括licA、licB、licC、licD共4個基因，licD基因調(diào)控Hi LOS磷酸膽堿化的表達［20］。PCho可以促進細(xì)菌對宿主細(xì)胞的黏附。在BF形成初期，PCho不是一個必須的條件，但在BF后期，PCho可以促進BF的成熟和穩(wěn)定。PCho化與BF厚度、覆蓋面積、光滑程度、生物量呈正相關(guān)［21］。

5　密度感應(yīng)（quorum　sensing,QS）系統(tǒng)

QS系統(tǒng)是細(xì)菌通過信號分子感知群體密度多少，調(diào)控自身生理活動進而使細(xì)菌群體達到生存穩(wěn)態(tài)平衡的一種自我調(diào)控能力。luxS基因是包括Hi在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)菌QS系統(tǒng)中重要的調(diào)控因子，可調(diào)控細(xì)菌的毒素因子和細(xì)菌代謝。luxS調(diào)控合成自誘導(dǎo)分子（Autoinducer 2，AI-2），后者可以促進鞭毛表達，增強細(xì)菌活動；AI-2也是一種菌種間信號分子，可以在不同的細(xì)菌間傳遞化學(xué)遞質(zhì)，協(xié)調(diào)種群間的生理活動［22］，luxS基因缺失后，AI-2濃度降低，細(xì)菌群體之間信號交流減弱，生存穩(wěn)態(tài)失衡；同時，luxS基因缺失還影響Hi LOS的磷酸膽堿化表達，進而影響B(tài)F的形成［23］。

腺苷三磷酸結(jié)合盒（ATP-blinding-cassette，ABC）轉(zhuǎn)運蛋白是一種跨膜蛋白，利用結(jié)合和水解ATP產(chǎn)生的能量對胞內(nèi)外的生物分子進行轉(zhuǎn)運［24］。RbsB是Hi ABC轉(zhuǎn)運蛋白中由rbsB（the ribose transport operon）編碼的一個蛋白，該蛋白能攝取細(xì)菌群體中的AI-2，并在胞內(nèi)外運輸，對BF內(nèi)細(xì)菌密度穩(wěn)定和穩(wěn)態(tài)均衡具有重要意義［25］。

6　雙組份信號系統(tǒng)（two-component　signaling　system）

該系統(tǒng)最早在大腸桿菌氮調(diào)節(jié)蛋白系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，其功能是使微生物在不同的環(huán)境下感受外界刺激，并作出相應(yīng)的反應(yīng)。雙組份信號系統(tǒng)由激酶感受器（histidine kinase，HK）和效應(yīng)調(diào)節(jié)器（response regulator，RR）組成。激酶感受器感受到環(huán)境變化后，通過磷酸轉(zhuǎn)移途徑將信號傳遞給轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，效應(yīng)調(diào)節(jié)器進而通過上調(diào)或下調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄來作出回應(yīng)［26］。Hi含有多個不同的雙組份信號系統(tǒng)，QseB/C是由qseB和qseC等位基因編碼的一個雙組份信號分子，由一個啟動子控制。實驗研究揭示，和親本株相比，qseC基因缺失的Hi BF在48 h后密度明顯減少，說明qseC缺失后，調(diào)節(jié)器的功能受到影響，BF內(nèi)的細(xì)菌不能繼續(xù)在QS的調(diào)控下穩(wěn)定生長［27］。

總之，Hi是一種常見的BF菌，探討Hi BF形成因素和機制，對認(rèn)識和治療BF病具有及其重要的指導(dǎo)意義。

［1］Thanavala Y，Lugade AA.Role of nontypeable Haemophilus influenzae in otitis media and chronic obstructive pulmonary disease［J］. AdvOtorhinolaryngol，2011，72（8）:170-175.doi:10.1159/ 000324785.

［2］Cardines R，Giufre M，Pompilio A，et al.Haemophilus influenzae in children with cystic fibrosis:antimicrobial susceptibility，molecular epidemiology，distribution of adhesins and biofilm formation［J］.Int J Med Microbiol，2012，302（1）:45-52.doi:10.1016/j.ijmm.2011.08.003.

［3］Oncel S，Pinar E，Sener G，et al.Evaluation of bacterial biofilms in chronic rhinosinusitis［J］.J Otolaryngol Head Neck Surg，2010，39 （1）:52-55.doi:10.2310/7070.2009.090008

［4］Manes RP，Batra PS.Bacteriology and antibiotic resistance in chronic rhinosinusitis［J］.Facial Plast Surg Clin North Am，2012，20（1）: 87-91.doi:10.1016/j.fsc.2011.10.010.

［5］Saafan ME，Ibrahim WS，Tomoum MO.Role of adenoid biofilm in chronic otitis media with effusion in children［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2013，270（9）:2417-2425.doi:10.1007/s00405-012-2259-1.

［6］Drago L，De Vecchi E，Torretta S，et al.Biofilm formation by bacteria isolated from upper respiratory tract before and after adenotonsillectomy［J］.APMIS，2012，120（5）:410-416.doi:10.1111/j.1600-0463.2011.02846.x.

［7］Swidsinski A，Goktas O，Bessler C，et al.Spatial organisation of microbiota in quiescent adenoiditis and tonsillitis［J］.J Clin Pathol，2007，60（3）:253-260.doi:10.1136/jcp.2006.037309.

［8］Murphy TF，Kirkham C.Biofilm formation by nontypeable Haemophilus influenzae:strain variability，outer membrane antigen expression and role of pili［J］.BMC Microbiol，2002，2:7.doi:10.1186/1471-2180-2-7.

［9］Jurcisek JA，Bakaletz LO.Biofilms formed by nontypeable Haemophilus influenzae in vivo contain both double-stranded DNA and type IV pilin protein［J］.J Bacteriol，2007，189（10）:3868-3875. doi:10.1128/JB.01935-06.

［10］Jurcisek JA，Bookwalter JE，Baker BD，et al.The PilA protein of non-typeable Haemophilus influenzae plays a role in biofilm formation，adherence to epithelial cells and colonization of the mammalian upper respiratory tract［J］.Mol Microbiol，2007，65（5）:1288-1299.doi:10.1111/j.1365-2958.2007.05864.x.

［11］Carruthers MD，Tracy EN，Dickson AC，et al.Biological roles of nontypeable Haemophilus influenzae type IV pilus proteins encoded by the pil and com operons［J］.J Bacteriol，2012，194（8）:1927-1933.doi:10.1128/JB.06540-11.

［12］Murphy TF，Kirkham C，Sethi S，et al.Expression of a peroxiredoxin-glutaredoxin by Haemophilus influenzae in biofilms and during human respiratory tract infection［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2005，44（1）:81-89.doi:10.1016/j.femsim.2004.12.008.

［13］Vogel AR，Szelestey BR，Raffel FK，et al.SapF-mediated hemeiron utilization enhances persistence and coordinates biofilm architecture of Haemophilus［J］.Front Cell Infect Microbiol，2012，2.42. doi:10.3389/fcimb.2012.00042.

［14］Webster P，Wu S，Gomez G，et al.Distribution of bacterial proteins in biofilms formed by non-typeable Haemophilus influenzae［J］.J Histochem Cytochem，2006，54（7）:829-842.doi:10.1369/ jhc.6A6922.2006.

［15］Allesen-Holm M，Barken KB，Yang L，et al.A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms［J］. Mol Microbiol，2006，59（4）:1114-1128.doi:10.1111/j.1365-2958.2005.05008.x.

［16］Spoering AL，Gilmore MS.Quorum sensing and DNA release in bacterial biofilms［J］.Curr Opin Microbiol，2006，9（2）:133-137.doi: 10.1016/j.mib.2006.02.004.

［17］Jones EA，Mcgillivary G，Bakaletz LO.Extracellular DNA within a nontypeable Haemophilus influenzae-induced biofilm binds human beta defensin-3 and reduces its antimicrobial activity［J］.J Innate Immun，2013，5（1）:24-38.doi:10.1159/000339961.

［18］Pang B，Hong W，Kock ND，et al.Dps promotes survival of nontypeable Haemophilus influenzae in biofilm communities in vitro and resistance to clearance in vivo［J］.Front Cell Infect Microbiol，2012，2: 58.doi:10.3389/fcimb.2012.00058.eCollection 2012.

［19］Swords WE，Moore ML，Godzicki L，et al.Sialylation of lipooligosaccharides promotes biofilm formation by nontypeable Haemophilus influenzae［J］.Infect Immun，2004，72（1）:106-113.doi:10.1128/ IAI.72.1.106-113.2004.

［20］Mccrea KW，Xie J，Marrs CF，et al.Prevalence of genetic differences in phosphorylcholine expression between nontypeable Haemophilus influenzae and Haemophilus haemolyticus［J］.BMC Microbiol，2010，10:286.doi:10.1186/1471-2180-10-286.

［21］Hong W，Pang B，West-Barnette S，et al.Phosphorylcholine expression by nontypeable Haemophilus influenzae correlates with maturation of biofilm communities in vitro and in vivo［J］.J Bacteriol，2007，189（22）:8300-8307.doi:10.1128/JB.00532-07.

［22］Armbruster CE，Hong W，Pang B，et al.Indirect pathogenicity of Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis in polymicrobial otitis media occurs via interspecies quorum signaling［J］.MBio，2010，1（3）:e00102-10.doi:10.1128/mBio.00102-10.

［23］Armbruster CE，Hong W，Pang B，et al.LuxS promotes biofilm maturation and persistence of nontypeable haemophilus influenzae in vivo via modulation of lipooligosaccharides on the bacterial surface ［J］.Infection And Immunity，2009，77（9）:4081-4091.doi:10.1128/ IAI.00320-09.

［24］Rees DC，Johnson E，Lewinson O.ABC transporters:the power to change［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（3）:218-227.doi: 10.1038/nrm2646.

［25］Armbruster CE，Pang B，Murrah K，et al.RbsB（NTHI_0632）mediates quorum signal uptake in nontypeable Haemophilus influenzae strain 86-028NP［J］.Mol Microbiol，2011，82（4）:836-850.doi: 10.1111/j.1365-2958.2011.07831.x.

［26］Casino PRVM.The mechanism of signal transduction by two-component systems［J］.Curr Opin Struct Biol，2010，20（6）:763-771. doi:10.1016/j.sbi.2010.09.010.

［27］Unal CM，Singh B，F(xiàn)leury C，et al.QseC controls biofilm formation of non-typeable Haemophilus influenzae in addition to an AI-2-dependent mechanism［J］.Int J Med Microbiol，2012，302（6）:261-269.doi:10.1016/j.ijmm.2012.07.013.

（2014-05-04收稿2014-09-20修回）

（本文編輯魏杰）

Role of haemophilus influenza factor in the process of biofilm formation

GAO Xue1，SHANG Xiaoling2，ZHANG Yutuo1△
1 Institute of Pathogen Biology and Immunology of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China；2 Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery of the First Affiliated Hospital of Hebei North University
△Corresponding AuthorE-mail:yvtuozhang@sina.com

The Haemophilus influenzae（Hi）is a common opportunistic pathogen from human respiratory tract.The lower immunity can cause the disease.After the biofilm（BF）is formatted by Hi at the site of infection，the antibiotic sensitivity is declined，which often causes the chronic disease，inducing the difficulty in clinical treatment.In recent years，the pathogenicity of Hi BF and BF form related factors have gradually become the focus of clinical and basic research.This paper reviewed recent studies as following.

haemophilus influenza；biofilms；drug tolerance；review

R378.4

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.029

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題（20110537）

1張家口，河北北方學(xué)院病原生物與免疫學(xué)研究所（郵編075000）；2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

△E-mail:yvtuozhang@sina.com