多種探針的RT-PCR檢測(cè)H5N1病原體方法的建立及應(yīng)用

孫春瓊　沭陽(yáng)南關(guān)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇省沭陽(yáng)縣　223600

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多種探針的RT-PCR檢測(cè)H5N1病原體方法的建立及應(yīng)用

孫春瓊沭陽(yáng)南關(guān)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇省沭陽(yáng)縣223600

摘要目的：探究多種探針的RT-PCR檢測(cè)H5N1病原體方法的建立及應(yīng)用。方法：分析Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列，針對(duì)保守區(qū)分別設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)特異性引物(P1/P2，P3/P4)。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)兩種病毒的快速雙重PCR方法。結(jié)果：合適引物濃度為P1/P2為0.32μmol/L，P3/P4為0.96μmol/L。雙重檢測(cè)的最小病毒核酸量為2ng/μl，H5N1病原體混合液在相對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，而其他病毒及空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶。結(jié)論：多種探針的RT-PCR檢測(cè)H5N1病原體具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于禽流感的預(yù)防和控制具有積極的作用。

關(guān)鍵詞逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)H5N1病原體探針引物

禽流感由于其高致病性曾經(jīng)給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)致命的打擊，有些禽流感甚至可以直接傳染給人。近年來(lái)禽流感又反復(fù)出現(xiàn)，引起了相關(guān)部門的廣泛關(guān)注，也成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。其中，H5N1傳染性強(qiáng)，為衛(wèi)生部新傳染病防治法中規(guī)定報(bào)告的法定傳染病，可以通過(guò)人畜傳播，具有較強(qiáng)的致病性。目前，國(guó)際上比較常用的檢測(cè)禽流感病毒的方法為雞胚病毒分離法，但是由于檢測(cè)過(guò)程比較繁瑣，耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間和精力，不適合用于大型的傳染病檢測(cè)[1]。近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，為檢驗(yàn)及診斷學(xué)帶來(lái)了很多便利。其中RT-PCR檢測(cè)由于其定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，為H5N1病原體的檢測(cè)帶來(lái)了很多便利。本文主要闡述了多種探針的RT-PCR檢測(cè)H5N1病原體方法的建立及應(yīng)用，具體報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)樣本收集2014年1月H5N1禽流感暴發(fā)流行期間的H5N1病毒株，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行分離，提取H5N1亞型標(biāo)準(zhǔn)抗原并進(jìn)行保存。

1.2試劑和儀器QIAamp病毒RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，SARS-CoY RNA熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法試劑盒、禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、RNA酶抑制劑、dNTP購(gòu)自Promega公司。分子生物學(xué)軟件選擇DNAstar 10.0版本，primer 10.0版本。儀器選擇PE 9600PCR儀、uglltcycler熒光PcR檢測(cè)儀。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1RNA的抽提：采取標(biāo)本，立即進(jìn)行前處理，使用QIAamp病毒RNA提取試劑盒(產(chǎn)自德國(guó)QIAGEN公司)抽提禽流感病毒RNA。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，以H5N1病原體RNA為模板，P1/P2為引物進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)結(jié)束后用15g/dl的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR產(chǎn)物。反應(yīng)條件為:42℃40min，94℃4min，然后94℃35s，42℃35s，72℃35s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8min[2]。

1.3.2引物設(shè)計(jì)：參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已注冊(cè)的禽流感病毒H5N1亞型毒株的基因核苷酸序列，用primer10.0版本軟件設(shè)計(jì)多對(duì)引物P1/P2和P3/P4，同源性分析采用DNAstar10.0版本生物軟件進(jìn)行比較，理論跨幅為290bp和320bp[3]，引物及探針序列如下(由上海生工生物工程有限公司提供)。引物序列(5’端用生物素標(biāo)記)：上游：5’-TATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAG-3’(25bp)；下游：5’-GCAAATTCTGCATTGTAACGATCC-3’(24bp)；探針序列為：5’-GCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCT-3’。

1.3.3PCR檢測(cè)：選取最佳引物濃度，以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR敏感性實(shí)驗(yàn)，具體操作如下：94℃3min，然后進(jìn)入循環(huán)94℃30s，54℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，于72℃延伸10min，4℃保存。用10g/dl瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取5μl PCR產(chǎn)物與6×Loading buffer 1μl混勻，點(diǎn)樣，100～120V電泳30min，在紫外燈下觀察擴(kuò)增片段判斷結(jié)果[4]。

2結(jié)果

2.1確定引物濃度本次共實(shí)施5組實(shí)驗(yàn)，P1/P2的引物濃度分別為0.32、0.48、0.64、0.80、0.96μmol/L。P3/P4引物濃度分別為0.32、0.48、0.64、0.80、0.96μmol/L。經(jīng)過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，合適的引物濃度為P1/P2 0.32μmol/L，P3/P4 0.96μmol/L。進(jìn)行PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已注冊(cè)的兩種禽流感病毒的基因核苷酸序列進(jìn)行比較，同源性達(dá)98%以上。

2.2特異性與敏感性檢測(cè)經(jīng)測(cè)定10-4病毒液的RNA濃度為2ng/μl，因此該方法可檢測(cè)的最小病毒核酸量為2ng/μl。根據(jù)雙重PCR分析，H5N1病原體混合液均在相應(yīng)位置出現(xiàn)兩條特異性條帶，其他病毒及空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶，特異性明顯。P1/P2和P3/P4二聯(lián)檢測(cè)10倍梯度稀釋的單項(xiàng)模板，P1/P2和P3/P4的敏感度都為10-4，與單項(xiàng)RT-PCR敏感性相同。

3討論

禽流感是一種烈性傳染病，是當(dāng)今世界人類面臨的最嚴(yán)重的健康威脅之一，它能引起動(dòng)物及人類傳染急性呼吸系統(tǒng)疾病，被國(guó)際獸疫局確定為Ⅰ類烈性傳染病，世界衛(wèi)生專家曾多次強(qiáng)調(diào)加強(qiáng)禽流感病毒的防控及研究對(duì)于動(dòng)物和人類健康具有重要的意義。由于禽流感病毒血清型較多，且容易發(fā)生變異，因此尋找一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)禽流感病毒，尤其是具有高致病性的H5N1亞型病毒的方法至關(guān)重要。

禽流感病毒的檢測(cè)一般需要依靠實(shí)驗(yàn)室檢查，其中病毒的分離鑒定是最終確診的主要依據(jù)，實(shí)驗(yàn)室檢查雖然準(zhǔn)確度較高，但耗時(shí)較長(zhǎng)、操作繁瑣，需要專業(yè)人員才能完成，不適合用于大規(guī)模的臨床檢測(cè)，此外，血清學(xué)檢測(cè)也是臨床上一種常用的診斷技術(shù)，但是其特異性及敏感性有限，用于檢測(cè)H5N1病毒具有一定的局限性。近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，已被大量用于禽流感病毒的檢測(cè)，其中主要的檢測(cè)方法有聚合酶鏈反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和熒光RT-PCR、核酸分子雜交、基因探針技術(shù)、ELISA等方法。RT-PCR是近年來(lái)發(fā)展的一種較為成熟的體外基因擴(kuò)增技術(shù)，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成功的用于多種病毒的基因檢測(cè)。

目前關(guān)于H5N1亞型病毒的研究越來(lái)越多，Chen等對(duì)來(lái)自我國(guó)南方地區(qū)的21株宿主為鴨的H5N1禽流感病毒進(jìn)行了分離和全基因組測(cè)序，并與Genbank中的某些病毒株一起構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用于相關(guān)基因的進(jìn)化研究[5]。本文結(jié)果顯示，合適的引物濃度為P1/P2 0.32μmol/L，P3/P4 0.96μmol/L，PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增后基因測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的基因核苷酸序列進(jìn)行比較，同源性達(dá)98%以上。P1/P2和P3/P4二聯(lián)檢測(cè)10倍梯度稀釋的單項(xiàng)模板，P1/P2和P3/P4的敏感度都為10-4，與單項(xiàng)RT-PCR敏感性相同。就檢測(cè)敏感性與特異性而言，在理想狀態(tài)下，只要退火溫度足夠低，能夠保證引物同目的序列有效退火，就可以減少檢測(cè)過(guò)程中的非特異性結(jié)合，提高檢測(cè)的特異性，而根據(jù)雙重PCR的分析結(jié)果恰恰證明了這一點(diǎn)，H5N1病原體混合液均在相應(yīng)位置出現(xiàn)兩條特異性條帶，而其他病毒及空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶。就敏感性而言，在多種探針的應(yīng)用中，多重PCR引物檢測(cè)的敏感性幾乎接近單重PCR水平，敏感性較高。此外，多重PCR引物可以用于成組病原體的檢測(cè)，但是引物濃度是關(guān)鍵，只要選擇合適的引物濃度，多個(gè)PCR中不同的引物就可以在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行特異性擴(kuò)增，在同一個(gè)PCR反應(yīng)中就可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體，節(jié)省時(shí)間，提高檢測(cè)效率。

目前，RT-PCR技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、流行病分子生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，也為臨床診斷提供了新的思路。

RT-PCR技術(shù)具有針對(duì)性強(qiáng)、檢測(cè)周期短、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，可以有效的檢測(cè)出H5N1病毒，對(duì)于禽流感的預(yù)防和控制具有積極的作用，值得在臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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[5]鐘靜,黃平,等.廣東兩株人禽流感H5N1毒株節(jié)段基因及蛋白特征和進(jìn)化分析〔J〕. 中華傳染病雜志，2011,29(3):171.

(編輯雅文)

收稿日期2015-02-12

中圖分類號(hào)：R446.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1001-7585(2015)18-2527-03