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      硫化砷誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡研究

      2015-02-08 06:21:38王娟姚瑤陳麗娟
      實(shí)用老年醫(yī)學(xué) 2015年6期
      關(guān)鍵詞:活率膜電位活性氧

      王娟 姚瑤 陳麗娟

      砷劑雖然是一種毒性藥物,但作為傳統(tǒng)中藥成分用于治療疾病亦歷史悠久。于20世紀(jì)70年代,我國(guó)哈爾濱學(xué)者利用含砒霜即三氧化二砷(AS2O3)的民間驗(yàn)方“癌靈1號(hào)”治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)取得良好療效[1],使砷劑這一古老的中藥煥發(fā)了新的光彩,目前已用于多種腫瘤的治療。多發(fā)性骨髓瘤(MM)是惡性漿細(xì)胞增殖性疾病,是不可治愈的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,本文觀察了硫化砷(As4S4)對(duì)MM細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡效應(yīng),并對(duì)其機(jī)制作了初步探討。

      1 資料和方法

      1.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞接種于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco BRL公司)中,飽和濕度條件下,37℃、5%CO2中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

      1.2 細(xì)胞增殖活性測(cè)定采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法[2]。U266細(xì)胞以1×108/L接種于96孔培養(yǎng)板中,在終濃度為1、2、3、4 μmol/L As4S4作用下培養(yǎng)48 h,離培養(yǎng)終點(diǎn)4 h加入MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入DMSO,酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。細(xì)胞活率由臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè),根據(jù)處理組存活細(xì)胞數(shù)與死細(xì)胞數(shù)的比例來(lái)計(jì)算。用細(xì)胞離心涂片器(Shandon,Runcorn,UK)收集細(xì)胞至載玻片,用瑞氏染液染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。生長(zhǎng)抑制率及細(xì)胞活率按如下公式計(jì)算:生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組細(xì)胞數(shù)-處理組細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組細(xì)胞數(shù);細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))。

      1.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基(ROS)

      1.3.1 細(xì)胞周期分析:參照文獻(xiàn)[3],收集(1~2)×106細(xì)胞用70%的冷乙醇在-20℃固定過(guò)夜,經(jīng)PBS(phosphate-buffered saline)緩沖液充分漂洗后,用含1%核糖核酸酶(RNase)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液(pH 7.4)37℃處理30 min,并用250 μg/ml碘化丙啶染色。DNA含量分布由流式細(xì)胞儀檢測(cè)。所有數(shù)據(jù)由Beckman Coulter公司的Multicycle軟件收集、存儲(chǔ)和分析。

      1.3.2 Annexin-V分析:使用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Annexin V和碘化丙啶(PI)雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,根據(jù)BD Biosciences公司提供的說(shuō)明書操作。取(1~2)×105細(xì)胞,經(jīng)PBS漂洗后加100 μl結(jié)合緩沖液,重懸細(xì)胞,加5 μl AnnexinV-FITC,10 μl PI避光孵育15 min后加400 μl結(jié)合緩沖液,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

      1.3.3 線粒體跨膜電位檢測(cè):參照文獻(xiàn)[4],取5×105細(xì)胞,PBS清洗1次,加入10 μg/ml Rh123 37℃孵育30 min,PBS漂洗1次,加入終濃度10 μg/ml PI 4℃暗處放置30 min,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

      1.3.4 活性氧的測(cè)定方法:細(xì)胞內(nèi)活性氧測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行,二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFHDA)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶催化變成DCFH,在活性氧存在下被氧化成DCF,DCF熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比。將藥物處理的細(xì)胞(1×105)經(jīng)過(guò)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,重懸于1 ml含有10 μmol/L DCFHDA(sigma,USA)的PBS中,以未加染料的樣品作為對(duì)照,37℃孵育20 min,PBS洗滌2次,流式細(xì)胞儀檢測(cè)5000個(gè)活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

      2 結(jié)果

      2.1 As4S4對(duì)U266細(xì)胞增殖抑制和殺傷作用我們觀察了As4S4對(duì)MM細(xì)胞U266的影響,發(fā)現(xiàn)As4S4呈時(shí)間和劑量依賴的方式抑制U266細(xì)胞的生長(zhǎng),同時(shí)伴有細(xì)胞活率的降低。經(jīng)48 h處理后生長(zhǎng)抑制率在1、2、3、4 μmol/L濃度時(shí)分別為32.8%、39.8%、57.8%和64.6%;活率在0、1、2、4 μmol/L時(shí)分別為95.9%、87.7%、72.6%和42.6%,見(jiàn)圖1。因此選擇As4S4 4 μmol/L作為藥物處理濃度。

      圖1 As4S4對(duì)U266細(xì)胞增殖抑制和殺傷作用

      2.2 As4S4誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡4 μmol/L As4S4處理U266細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:染色體凝聚、細(xì)胞核破裂而細(xì)胞膜保持完整等凋亡特征,見(jiàn)圖2A。annexin V-FITC/PI雙標(biāo)結(jié)果顯示,48 h時(shí)凋亡細(xì)胞占48.5%,見(jiàn)圖2B。線粒體跨膜電位檢測(cè)顯示線粒體跨膜電位輕度降低,見(jiàn)圖2C。

      2.3 As4S4處理U266細(xì)胞DNA含量分布U266細(xì)胞經(jīng)4 μmol/L As4S4處理后DNA含量檢測(cè)顯示細(xì)胞周期阻滯在G1期,G1期由53.4%增加到83.7%;而S期明顯降低,由35.3%降低至3.4%,結(jié)果見(jiàn)圖2D。

      2.4 As4S4增加U266細(xì)胞活性氧濃度我們采用DCFHDA檢測(cè)As4S4處理U266細(xì)胞活性氧,發(fā)現(xiàn)As4S4作用于U266細(xì)胞12 h時(shí)活性氧水平增高,而24 h時(shí)活性氧恢復(fù)到正常水平。結(jié)果見(jiàn)圖3。

      3 討論

      MM在歐美國(guó)家的年發(fā)生率是(2~5)/10萬(wàn)人口,在我國(guó)為1/10萬(wàn)人口。幾十年來(lái)一直采用激素和細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合化療,盡管近年來(lái)加用反應(yīng)停抑制血管新生治療或采用自體骨髓移植治療,但仍是一種不能治愈的血液系統(tǒng)腫瘤。砷劑用于治療惡性腫瘤歷史悠久,研究顯示AS2O3具有抑制MM細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡作用[6]。As4S4亦是傳統(tǒng)中藥的主要成分,As4S4治療白血病臨床效果顯著,不良反應(yīng)較小,As4S4與氧化砷雖同為砷劑,但在分子結(jié)構(gòu)、砷的價(jià)態(tài)、給藥途徑、作用特點(diǎn)等方面存在很大差異,作用機(jī)制亦不同。As4S4對(duì)于MM的作用尚屬未知,對(duì)其進(jìn)行深入研究很有必要。

      圖2 4 μmol/L As4S4誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡作用

      圖3 4 μmol/L As4S4誘導(dǎo)U266細(xì)胞ROS產(chǎn)生DCFHDA流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度

      我們的研究結(jié)果顯示As4S4對(duì)MM細(xì)胞株U266細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制效應(yīng),此作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性,在抑制生長(zhǎng)的同時(shí)伴有細(xì)胞活率的降低,同時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)上伴有凋亡特征。DNA含量的分析顯示As4S4能誘導(dǎo)U266細(xì)胞周期靜止,大部分細(xì)胞被阻滯在G1期,從側(cè)面證實(shí)了其增殖抑制效應(yīng)。部分化療藥物可使處于周期靜止期的細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段。我們用檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡最敏感的指標(biāo)Annexin V檢測(cè)了其誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡活性,結(jié)果表明As4S4具有誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡效應(yīng)。細(xì)胞凋亡存在外源性和內(nèi)源性2種途徑,在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中發(fā)生凋亡的細(xì)胞線粒體跨膜電位會(huì)降低,我們用Rh123檢測(cè)了As4S4處理U266細(xì)胞時(shí)線粒體跨膜電位改變,發(fā)現(xiàn)線粒體跨膜電位輕度降低,說(shuō)明其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用部分通過(guò)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑,即線粒體信號(hào)通路發(fā)揮作用。

      許多化療藥物是通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)自由基水平才實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用的。常用化療藥阿霉素、絲裂霉素、放線菌素代謝時(shí)產(chǎn)生半醌自由基,它能促進(jìn)核膜與線粒體膜的脂類氧化[7]。近年的研究認(rèn)為活性氧是細(xì)胞凋亡的信號(hào)之一[8],Yi等[9]報(bào)道As2O3通過(guò)誘導(dǎo)NB4細(xì)胞線粒體產(chǎn)生活性氧類(ROS)而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)同樣會(huì)導(dǎo)致ROS的生成,線粒體對(duì)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力(ER stress)誘導(dǎo)的ROS累積和凋亡的發(fā)生亦具有重要意義,ROS在ER stress誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[10]。我們檢測(cè)結(jié)果顯示12 h時(shí)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),24 h熒光強(qiáng)度恢復(fù)正常,說(shuō)明As4S4在作用早期可增加U266細(xì)胞ROS濃度,從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。ROS的產(chǎn)生不僅可通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,亦可經(jīng)ER stress通路誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡。

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