電針后外敷威靈仙浸膏治療日本大耳白兔實(shí)驗(yàn)性膝骨關(guān)節(jié)炎的研究

李 敏，丁武華，李 莉，方 偉，郭俐宏

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

電針后外敷威靈仙浸膏治療日本大耳白兔實(shí)驗(yàn)性膝骨關(guān)節(jié)炎的研究

李 敏1，丁武華1，李 莉2，方 偉2，郭俐宏2

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

目的 研究電針配穴聯(lián)合自制威靈仙浸膏外敷治療實(shí)驗(yàn)性日本大耳白兔膝骨關(guān)節(jié)炎合并關(guān)節(jié)腔積液的效果及作用機(jī)制。方法 將日本大耳白兔36只隨機(jī)分為模型組、電針組、威靈仙組及聯(lián)合組，4組均于第1，3，7天各注射1次弗氏完全佐劑(0.1 mL)于左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)造模；造模成功后電針組取足三里、血海、陽(yáng)陵泉為主穴電針刺激30 min,威靈仙組于膝骨關(guān)節(jié)處每日涂抹威靈仙浸膏,聯(lián)合組在電針足三里、血海、陽(yáng)陵泉30 min后膝骨關(guān)節(jié)處每日涂抹威靈仙浸膏,均治療2周。分別于造模前及治療后2周測(cè)定關(guān)節(jié)積液中炎癥遞質(zhì)前列腺素E2(PGE2)、透明質(zhì)酸(HA)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平；計(jì)算足趾關(guān)節(jié)腫脹率及消腫時(shí)間，并于治療結(jié)束后取動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨測(cè)定軟骨MMP-1細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率。結(jié)果 治療2周后，聯(lián)合組PGE2、IL-1β水平,MMP-1細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率及足趾關(guān)節(jié)腫脹率均明顯低于治療前及電針組、威靈仙組(P均<0.05),消腫時(shí)間明顯短于電針組、威靈仙組(P均<0.05)，HA水平高于電針組、威靈仙組(P均<0.05)。結(jié)論 電針配穴聯(lián)合自制威靈仙浸膏外敷治療日本大耳白兔實(shí)驗(yàn)性膝骨關(guān)節(jié)炎合并關(guān)節(jié)腔積液效果好。其作用機(jī)制可能是電針刺激可激發(fā)經(jīng)氣，降低痛閾，威靈仙浸膏經(jīng)皮吸收后可促進(jìn)局部血液循環(huán)及局部病變組織新陳代謝，增加HA分泌，抑制IL-1β的合成，二者協(xié)同促使病變組織恢復(fù)，減輕關(guān)節(jié)疼痛。

威靈仙浸膏；膝骨關(guān)節(jié)炎;前列腺素E2；透明質(zhì)酸；軟骨MMP-1細(xì)胞

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膝骨關(guān)節(jié)炎是由于膝關(guān)節(jié)局部濕濁痹阻及血瘀氣滯而起，歸“骨痹”“筋痹”范疇，治當(dāng)利濕除痹、舒筋通絡(luò)、活血化瘀、行氣止痛[1]。當(dāng)膝關(guān)節(jié)滑膜受到勞損、外傷、感染等刺激后，滑膜下層毛細(xì)血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管通透性增大，致使關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生大量滲出液，出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液[2]。威靈仙為毛莨科植物威靈仙干燥根及根莖，《本草綱目》記載威靈仙“味微辛咸”，通經(jīng)絡(luò)、消痰涎、祛風(fēng)濕、散癖積[3],藥性辛散溫通，通行十二經(jīng)脈，既能祛風(fēng)濕，又能通經(jīng)止痹痛。其主要有效成分為常春藤皂苷元及齊墩果酸，具有清熱、消炎抑菌、強(qiáng)心、利尿作用[4]。本實(shí)驗(yàn)采取電針配穴聯(lián)合自制威靈仙浸膏外敷治療實(shí)驗(yàn)性日本大耳白兔膝骨關(guān)節(jié)炎合并關(guān)節(jié)腔積液，以期研究聯(lián)合治療的鎮(zhèn)痛消炎作用機(jī)制，為臨床提供安全可靠的治療膝骨關(guān)節(jié)炎合并關(guān)節(jié)腔積液治療方案。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 日本大耳白兔36只，體質(zhì)量(2 500±50)g，雌雄兼用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2011-0008；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證：SYXK(鄂)2011-0031。采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)，隨機(jī)分為模型組、電針組、威靈仙組及聯(lián)合組，每組9只。

1.2 儀器設(shè)備及藥品試劑 SDZ-Ⅱ型電子針療儀(上海坤弘)；弗氏完全佐劑(上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司)；生理鹽水；威靈仙浸膏組方及自制方法：威靈仙10 g、透骨草30 g、當(dāng)歸20 g、川烏10 g、海桐皮30 g、紅花15 g、伸筋草30 g、川牛膝15 g、艾葉10 g、木瓜15 g、草烏10 g、桂枝10 g、防風(fēng)10 g碾成粉末(藥材由太和醫(yī)院中藥房提供)，混合凡士林并加少許香油調(diào)成糊狀備用。

1.3 動(dòng)物模型制備 造模時(shí)先剃掉兔膝關(guān)節(jié)及以下毛發(fā)，碘伏消毒，采用日本鬼頭康彥膝骨關(guān)節(jié)炎造模法[5]，將弗氏完全佐劑0.1 mL于第1，3，7天注入左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，根據(jù)臨床上超疲勞容易提前出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病特點(diǎn)，每日強(qiáng)迫動(dòng)物活動(dòng)30 min，14 d后出現(xiàn)以下與臨床急性膝關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)一致的癥狀即可確定大鼠急性膝關(guān)節(jié)炎模型造模成功：①關(guān)節(jié)及其周圍僵硬、活動(dòng)受限；②關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛，同時(shí)軟組織腫脹或積液；③發(fā)病的部位常見(jiàn)于膝、髖、踝等關(guān)節(jié)處；④關(guān)節(jié)積液檢查出現(xiàn)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)降低、透明質(zhì)酸(HA)含量明顯升高；⑤關(guān)節(jié)病理切片鏡檢出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔大量滲出液，軟骨表面粗糙，滑膜增生、粘連、肥厚等膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學(xué)改變。

1.4 治療方法 將兔固定于兔固定器，電針組取足三里、血海、陽(yáng)陵泉為主穴，用一次性無(wú)菌針灸針齊刺，旁開(kāi)1寸兩旁各刺1針，其針尖與正中一針的針尖匯合，刺入骨膜，行導(dǎo)氣手法，使針感向膝周擴(kuò)散為佳；以齊刺點(diǎn)為正極，配穴為負(fù)極，接 SDZ-Ⅱ型電子針療儀，連續(xù)波，頻率10 Hz，留針30 min。威靈仙組僅將威靈仙浸膏均勻涂抹在無(wú)菌紗布上，覆蓋于兔膝部并用彈性繃帶包扎。聯(lián)合組先給予電針組相同治療，在電針齊刺完成后，將威靈仙浸膏均勻涂抹在無(wú)菌紗布上，覆蓋于兔膝部并用彈性繃帶包扎。模型組每日僅消毒。以上治療1次/d，14 d為1個(gè)療程。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法 ①于治療前后分別抽取兔膝關(guān)節(jié)腔積液，測(cè)定積液中前列腺素E2(PGE2)、IL-1β、HA含量。②病理檢查患者軟骨MMP-1陽(yáng)性表達(dá)率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。③計(jì)算膝關(guān)節(jié)腫脹百分率。方法：先取100 mL量筒注入蒸餾水，液面與量筒最高處平齊，用50 mL注射器吸取量筒內(nèi)蒸餾水約30 mL。于每只兔左膝關(guān)節(jié)縫矢狀面用記號(hào)筆做一標(biāo)記，然后把兔左足緩慢伸入量筒內(nèi)，使標(biāo)記與量筒最高處平齊。再用已吸入30 mL水的注射器向量筒內(nèi)緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處及兔膝關(guān)節(jié)標(biāo)記處一致，讀取注射器內(nèi)剩余液體體積，再用30 mL-注射器內(nèi)剩余液體體積即為兔的左膝關(guān)節(jié)容積，重復(fù)3次取平均值。左膝關(guān)節(jié)腫脹百分率(%)=(造模后容積-造模前容積)/造模前容積×100%。

2 結(jié) 果

2.1治療前后各組PGE2、IL-1β、HA水平及MMP-1陽(yáng)性表達(dá)率比較 治療后電針組、威靈仙組、聯(lián)合組PGE2水平及MMP-1陽(yáng)性表達(dá)率均低于本組治療前及模型組(P均<0.05)，威靈仙組與電針組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；聯(lián)合組PGE2、IL-1β水平及MMP-1陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于電針組及威靈仙組(P均<0.05)，HA明顯高于電針組及威靈仙組(P均<0.05)；電針組HA有一定的升高，IL-1β有降低趨勢(shì)，但與本組治療前及模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；威靈仙組HA高于本組治療前及電針組(P均<0.05)， IL-1β明顯低于本組治療前及電針組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 治療前后各組足腫脹度及消腫時(shí)間比較 治療后電針組、威靈仙組、聯(lián)合組足腫脹度明顯低于本組治療前及模型組(P均<0.05)。威靈仙組與電針組足腫脹度及消腫時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合組足腫脹度及消腫時(shí)間明顯低于電針組及威靈仙組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

膝關(guān)節(jié)炎常出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液，其病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)腔及滑膜炎性浸潤(rùn)，造成關(guān)節(jié)面軟骨被破壞、變性并繼發(fā)滑液炎癥，是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分解與合成代謝紊亂造成的慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病[6]。臨床上多發(fā)于35歲以上的中年人，臨床以膝關(guān)節(jié)疼痛、變形和活動(dòng)受限為主要特點(diǎn)，目前治療多以抗炎、消腫為主，但療效并不理想。中醫(yī)認(rèn)為，當(dāng)膝關(guān)節(jié)因外傷或其他原因受損傷后，局部關(guān)節(jié)血瘀氣滯，濕濁之氣痹阻于膝，針灸可以舒筋通絡(luò)、行氣止痛，中藥內(nèi)服外敷可以活血化瘀、利濕除痹，聯(lián)合應(yīng)用效果較好[7]。本研究所選的陽(yáng)陵泉穴可強(qiáng)筋祛濕，主治膝痹；足三里具有養(yǎng)血益氣之功效，主治下肢痿痹；血海穴主活血，與陽(yáng)陵泉及足三里配伍具有舒筋活絡(luò)、利通關(guān)節(jié)之奇效。且電針刺激可激發(fā)經(jīng)氣，降低痛閾，減輕關(guān)節(jié)滑膜表面神經(jīng)末梢對(duì)炎性因子IL-1β、PGE2刺激的反應(yīng)敏感度[8]。而中藥威靈仙有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、消腫抗炎鎮(zhèn)痛作用，能改善關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境而達(dá)“通則不痛”的功效；且威靈仙浸膏吸收后可促進(jìn)局部組織血液循環(huán)及新陳代謝，促使滑膜內(nèi)襯B型滑膜細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞大量分泌HA，達(dá)到潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、延緩軟骨退變及保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用；還可抑制機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的IL-1β及PGE2等炎癥因子，減輕對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的破壞，減少關(guān)節(jié)內(nèi)滲出液[9-10]。

表1 治療前后各組PGE2、IL-1β、HA水平及MMP-1陽(yáng)性表達(dá)率比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與聯(lián)合組比較，P<0.05；④與電針組比較，P<0.05。

表2 治療前后各組足腫脹度及消腫時(shí)間比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與聯(lián)合組比較，P<0.05。

正常的關(guān)節(jié)滑液中僅含有微量的IL-1β，但在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎合并關(guān)節(jié)腔積液時(shí)，IL-1β的含量則會(huì)異常增高。PGE2是機(jī)體的主要炎癥因子和重要的細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)因子，是花生四烯酸環(huán)氧合酶代謝產(chǎn)物，為二十碳不飽和脂肪酸，當(dāng)出現(xiàn)感染時(shí)，PGE2大量產(chǎn)生。HA是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖單位有規(guī)律重復(fù)構(gòu)成的大分子鏈狀多糖，是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)的重要組成部分。HA可減少膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)PGE2等炎性遞質(zhì)的合成及擴(kuò)散，減輕滑膜的通透性及關(guān)節(jié)內(nèi)滲液[11]。正常關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)極低，在膝骨關(guān)節(jié)炎早期常出現(xiàn)關(guān)節(jié)滑液IL-1β、PGE2及MMP-1細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率升高及HA降低的現(xiàn)象。故本實(shí)驗(yàn)研究采用電針聯(lián)合威靈仙浸膏外敷治療膝骨性關(guān)節(jié)炎合并關(guān)節(jié)腔積液動(dòng)物模型，以IL-1β、HA、PGE2及MMP-1細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率為主要生化指標(biāo)來(lái)衡量該治療方案的療效。

本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組PGE2、IL-1β水平及MMP-1陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于電針組及威靈仙組，HA明顯高于電針組及威靈仙組。提示電針刺激并配合威靈仙浸膏外敷聯(lián)合治療可減少炎癥因子PGE2、IL-1β的產(chǎn)生，抑制MMP-1的陽(yáng)性表達(dá)，促進(jìn)HA的分泌，療效明顯優(yōu)于單用電針刺激或威靈仙浸膏外敷法，對(duì)臨床治療膝關(guān)節(jié)炎合并關(guān)節(jié)積液有一定的參考價(jià)值。

[1] 張拴平,郝陽(yáng)泉.關(guān)節(jié)內(nèi)灌注沖洗并中藥熏洗治療膝骨性關(guān)節(jié)炎50例[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,33(5):68

[2] 唐瑭，陳德森，李莉，等． 通痹外敷膏聯(lián)合關(guān)節(jié)腔沖洗治療膝骨性關(guān)節(jié)炎合并積液的臨床研究[J]． 國(guó)際中醫(yī)中藥雜志， 2014，3(11)：213-216

[3] 李增華． 威靈仙考證探析[J]． 中醫(yī)中藥，2007，45(20)：62-63

[4] 周效思，周凱，譚安雄，等． 威靈仙對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎結(jié)構(gòu)和功能的影響[J]． 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(10)：454-2457

[5] 張曉軼，節(jié)曉光，張雅麗，等． “CHK”術(shù)式對(duì)兔膝OA中SOD、MDA及NO水平的影響[J]． 貴州醫(yī)藥，2008 32(8)：680-684

[6] 國(guó)延軍,牟成林,程杰,等． 祛瘀通痹湯治療原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床研究[J].河北中醫(yī)藥報(bào),2009，24(4)：21-22

[7] 陳才興,孫成長(zhǎng).中藥內(nèi)外兼治合透明質(zhì)酸鈉治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006，16(7):427-428

[8] 王軍旗，薛愛(ài)榮． 超微針刀配合推拿治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎56例[J].中醫(yī)研究，2012，25(9)：54-57

[9] 柳景紅,祁開(kāi)澤,吳濤,等． 痛風(fēng)速效靈對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型日本大耳白兔步態(tài)和關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,16(5):592-594

[10] 周效思，周凱，封芬，等.威靈仙對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎IL-1β、TNF-a、PGE2的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(5)：1143-1145

[11] 周效思，周凱． 威靈仙水提取液的鎮(zhèn)痛抗炎作用研究[J]． 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6(11)：39-40

Experimental study on external application of Clematis chinensis extract after acupuncture treatment in Japanese big ear rabbits with experimental knee osteoarthritis

LI Min1,DING Wuhua1,LI Li2,FANG Wei2,GUO Lihong2

(1.Shiyan Taihe Hospital (Affiliated to Hubei Medical College),Shiyan 442000,Hubei,China; 2.Hubei Medical College,Shiyan 442000,Hubei,China)

Objective It is observe the effect of electro acupuncture combined with self-made Clematis extract by external application on the Japanese big ear rabbits of experimental knee osteoarthritis (KOA)with joint effusion,and to explore its anti inflammation mechanism.Methods 36 white rabbits were randomly divided into model group,electro-acupuncture group,Clematis group and combined treatment group.All the rabbits were given complete Freund's adjuvant (0.1 mL) in the left knee joint cavity one time on the first,third and 7th day to establish models of KOA.After the models successfully established,electro-acupuncture group was treated with electro-acupuncture at Zusanli,Xuehai,Yanglingquan for 30 min; Clematis group was treated with Clematis extract on knee joint daily by external application; combined treatment group was treated with both electro-acupuncture and Clematis extract.All the treatment lasted for 2 weeks.The levels of PGE2,HA,IL-1β in joint effusion were determined before model establish and 2 weeks after treatment in all groups; toes swelling rate and swelling time of joint were counted,and the animal articular cartilage was gotten to detect the positive expression rate of MMP-1 cartilage cells at the end of treatment.Results After 2 weeks' treatment,the levels of PGE2,IL-1β,the positive rate of expression of MMP-1 cell rate and the toe joint swelling rate were significantly lower than that before treatment and the other two groups,swelling time was shorter while the level of HA was higher in combination group compared with that in the other two groups.Conclusion Electro-acupuncture combined with self-made Clematis extract topical therapy can be effective in the treatment of Japanese big ear rabbits of experimental knee osteoarthritis with joint effusion.The mechanism may be that: electro-acupuncture can arouse the Qi and decrease pain threshold,the extract can promote the local blood circulation and local tissue metabolism,increase the secretion of HA,inhibit IL-1β production,thus to promote the recovery of pathological tissue and relive joint pain together.

Clematis extract; knee osteoarthritis; prostaglandin E2; hyaluronic acid; MMP-1 cell

李敏，女，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥藥理及護(hù)理。

李莉，E-mail：951777718@qq.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.13.009

R-332

A

1008-8849(2015)13-1394-03

2014-12-01