電針對腦缺血/再灌注模型大鼠雙側(cè)腦區(qū)IL-1β、ICAM-1表達(dá)的影響

宋映周，孫琳琳，任暎貞，張旭輝，許明敏，于淼，郭郁，圖婭

(1．北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029;2．北京首鋼醫(yī)院，北京 100028)

腦血管病是人類健康大敵，當(dāng)前威脅人類健康的三大疾患之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高等特點(diǎn)。腦缺血炎性反應(yīng)是缺血性腦損害的重要病理機(jī)制之一。腦缺血后級聯(lián)式炎性反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的動態(tài)過程。缺血后機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，在缺血損傷區(qū)各種炎性因子表達(dá)增加，包括細(xì)胞因子和細(xì)胞間粘附分子。針刺對腦缺血性疾病具有良好干預(yù)作用［1］，且這種干預(yù)作用貫穿于腦缺血性疾病的急性期、損傷期及恢復(fù)期。研究發(fā)現(xiàn)針刺百會、足三里穴對神經(jīng)、內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)具有良性調(diào)節(jié)作用，可抑制腦缺血/再灌注區(qū)的炎性反應(yīng)，促進(jìn)腦梗死區(qū)的神經(jīng)功能恢復(fù)［2］。本實(shí)驗(yàn)通過對比觀察不同時(shí)間大鼠健、患側(cè)腦區(qū)IL-1β 和ICAM-1 的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討針刺干預(yù)腦缺血性疾病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、分組和處理

SPF 級SD 大鼠，雄性，體重(275±15)g，動物來源于中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源中心【SCXK(京)2009-0017】。實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所進(jìn)行【SYXK(京)2010-0021】，并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分成空白組(10 只)和造模組，造模成功(根據(jù)神經(jīng)功能評分)的大鼠再隨機(jī)分為模型組和針刺組，模型組和針刺組又分為12、24、48、72、96 h 和144 h 六個(gè)時(shí)程，每個(gè)時(shí)程10 只。時(shí)程的計(jì)算方法:起點(diǎn)為拔栓實(shí)現(xiàn)再灌注時(shí)間，終止點(diǎn)為取材時(shí)間，之間時(shí)長為各時(shí)程?？瞻捉M不做任何處理;模型組造模成功后，于每日針刺組治療時(shí)給予抓取刺激一次;針刺組電針刺激大鼠頭部百會和足三里(患側(cè))，采用疏密波，頻率2 ～100 Hz，強(qiáng)度2 mA，每次20 min，每日1 次，首次治療于拔栓后30 min，末次治療為灌注取材前150 min。

1.2 試劑和儀器

兔抗大鼠IL-1β IgG(Santa Cruz Biotechnology，批號:G2110)，山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號:V0602)，山羊抗鼠ICAM-1 IgG(R＆D system 公司，批號:EWL0109111)，生物素標(biāo)記的兔抗山羊IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號:W0524)，辣根酶標(biāo)記親和素-HRP 連接物(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號:V0723)，DAB 顯色試劑盒(北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司)，大鼠MCAO 栓線-2432、2634、2636，4A 級(北京沙東生物技術(shù)有限公司)，華佗牌無菌針灸針0.30×25 mm(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，長城牌KWD-808Ⅱ全能脈沖電針儀(常州市武進(jìn)長城醫(yī)療器械有限公司)，顯微鏡(日本Olympus 公司)。

1.3 腦缺血/再灌注損傷模型制備和神經(jīng)功能評分

參照改良的Zea Longa 方法［3］制備腦缺血/再灌注損傷大鼠模型。大鼠10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰臥固定，取頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，結(jié)扎并切斷ECA 后，由ECA 殘端沿ICA 緩慢插入栓線，此時(shí)栓線完全阻塞大腦中動脈入口。缺血后2 h 進(jìn)行再灌注，麻醉動物，緩慢輕拉栓線，大鼠清醒后自由進(jìn)食水和食物。

參照改良的Bederson 5 級評分法［4］。0 級(計(jì)0分):無功能缺損;1 級(計(jì)1 分):不能完全伸展左前肢;2 級(計(jì)2 分):左前肢屈曲，向左側(cè)推動時(shí)阻力下降;3級(計(jì)3 分):爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;4 級:不能自發(fā)行走，意識喪失，包括24 h 內(nèi)死亡;剔除評級為0 級和4 級的大鼠。

1.4 指標(biāo)檢測與方法

免疫組化法檢測雙側(cè)腦組織中IL-1β 和ICAM-1含量。用10%水合氯醛麻醉大鼠，切開胸腔，充分暴露心臟，依次用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注300 ～400 mL，取腦組織置于4%多聚甲醛中，4℃保存。切取視交叉前后2 ～3 mm 的腦組織截面，制備冰凍切片。檢測時(shí)采用枸櫞酸修復(fù)液，微波爐中微波熱修復(fù)10 ～15 min，用PBS 沖洗2 次，加一抗(兔抗大鼠IL-1β，山羊抗大鼠ICAM-1)室溫孵育48 h;PBS 沖洗3 次，加二抗，室溫孵育2 h;加生物素-酶，室溫孵育30 min;PBS沖洗3 次，DAB 顯色，中性樹膠封固，二甲苯擦拭玻片。

1.5 數(shù)據(jù)的讀取與分析

在光學(xué)顯微鏡下對標(biāo)本的健側(cè)和患側(cè)皮質(zhì)、紋狀體相關(guān)腦區(qū)進(jìn)行分析和圖像采集，分別觀察相關(guān)腦區(qū)IL-1β、ICAM-1 的表達(dá)情況，使用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件進(jìn)行圖像密度比對，檢測積分光度值(integrated optical density，IOD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。服從正態(tài)分布，方差齊時(shí)，各組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA);服從正態(tài)分布，方差不齊，采用t 檢驗(yàn);不服從正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以α=0.05 作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分

正常組大鼠無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，模型組(在模型制備過程中死亡率為28.8%)大鼠隨著存活時(shí)間的延續(xù)，神經(jīng)功能評分有降低趨勢，96、144 h 的評分與造模后比較有極顯著性差異(P ＜0.01)。

表1 模型組大鼠各時(shí)程造模后與取材前神經(jīng)功能評分比較Tab．1 Comparison of the neurofunctional scores of the rats in the model group during the time course after modeling

2.2 各組大鼠腦組織IL-1β 變化趨勢比較

腦缺血/再灌注損傷后，模型組健、患側(cè)腦組織IL-1β 表達(dá)均高于正常組，且呈典型雙峰模式。健側(cè)在12 h 到達(dá)第一峰峰值，至48 h 小幅下降后又持續(xù)增高，在144 h 到達(dá)第二峰峰值;患側(cè)在48 h 到達(dá)第二峰峰值，72 h 短暫下降后又持續(xù)增高。48 h 時(shí)，患側(cè)明顯高于健側(cè)(P ＜0.05)，而96、144 h 時(shí)IL-1β 表達(dá)又明顯低于健側(cè)(P ＜0.05)。針刺組健、患側(cè)腦組織的IL-1β 均在24 h 到達(dá)第一峰峰值，之后迅速下降，至144 h 到達(dá)第二峰峰值，但患側(cè)的第一峰峰值和第二峰峰值均低于健側(cè)(P ＜0.05)。除第24 h，針刺組健側(cè)高于模型組健側(cè)(P ＜0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)均低于模型組健側(cè)(P ＜0.05);針刺組患側(cè)在各時(shí)間點(diǎn)的IL-1β 表達(dá)均顯著低于模型組患側(cè)(P ＜0.05)。見表2，見圖1。

表2 各組大鼠健、患側(cè)腦組織中IL-1β 的IOD 值比較(±s，n=10)Tab．2 Comparison of the IL-1β values between bilateral brain tissues of the rats in in each group

表2 各組大鼠健、患側(cè)腦組織中IL-1β 的IOD 值比較(±s，n=10)Tab．2 Comparison of the IL-1β values between bilateral brain tissues of the rats in in each group

注:#:與空白組比較P ＜0.05;△:與模型組健側(cè)比較P ＜0.05;▲:與模型組患側(cè)比較P ＜0.05，□:與針刺組健側(cè)比較P ＜0.05。Note．# P ＜0.05，vs．control group;△P ＜0.05，vs．model group healthy side;▲P ＜0.05，vs．model group affected side;□P ＜0.05，vs．a(chǎn)cupunture group healthy side．

組別Groups 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h空白組Control group 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72模型組健側(cè)Model group healthy side 319807.71±97115.86#263859.30±18863.82#240213.46±108386.47#338739.89±130629.53#418094.09±82264.77#470523.51±32894.01#患側(cè)Model group affected side 279250.51±65430.68#284544.8±77287.66#340476.88±84865.46#△270354.62±24252.11#323688.62±71031.85#△391050.44±95572.07#△針刺組健側(cè)Acupunture group healthy side 239633.38±40715.95△398421.28±45902.22△256400.21±71303.38 233507.35±55078.68△219471.50±98511.13△260347.54±50688.53△患側(cè)Acupunture group affected side 191513.48±32696.92▲200794.00±66092.71▲□166092.71±35070.34▲□183753.24±64289.76▲192891.96±58550.56▲209295.24±29807.97▲□

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠患側(cè)腦組織IL-1β 免疫組化圖(×100)Fig．1 Expression of IL-1β in affected side brain tissues at different time points in the rats of each group．Immunohistochemical staining，×100．

2.3 各組大鼠腦組織ICAM-1 變化趨勢比較

腦缺血/再灌注損傷后，模型組健、患側(cè)腦組織ICAM-1 表達(dá)均呈現(xiàn)雙峰模式，在24 h 到達(dá)第一峰峰值，之后迅速下降，至72 h 又呈上升趨勢，在144 h 時(shí)達(dá)到第二峰峰值。模型組健、患側(cè)的兩個(gè)峰值均高于正常組(P ＜0.05)，且在48 h 時(shí)，患側(cè)的ICAM-1 表達(dá)高于健側(cè)(P ＜0.05)。針刺組健、患側(cè)腦組織ICAM-1 表達(dá)也均呈現(xiàn)雙峰模式，在24 h 到達(dá)第一峰峰值，之后持續(xù)下降，分別在144 h 和96 h呈上升趨勢，并在144 h 到達(dá)第二峰峰值。除第96 h，針刺組健側(cè)ICAM-1 表達(dá)均高于針刺組患側(cè)(P ＜0.05)。針刺組健側(cè)在12、24 和48 h 的ICAM-1 表達(dá)均高于模型組健側(cè)(P ＜0.05)。針刺組患側(cè)在12、24、48 h 的ICAM-1 表達(dá)均高于模型組患側(cè)(P ＜0.05)，在144 h 時(shí)低于模型組患側(cè)(P ＜0.05)。見表3，見圖2。

表3 各組大鼠健、患側(cè)腦組織中ICAM-1 的IOD 值比較(±s，n=10)Tab．3 Comparison of IOD values of ICAM-1 between bilateral brain tissue in the rats of each group

表3 各組大鼠健、患側(cè)腦組織中ICAM-1 的IOD 值比較(±s，n=10)Tab．3 Comparison of IOD values of ICAM-1 between bilateral brain tissue in the rats of each group

注:#:與空白組比較P ＜0.05，△:與模型組健側(cè)比較P ＜0.05，▲:與模型組患側(cè)比較P ＜0.05，□:與針刺組健側(cè)比較P ＜0.05。Note．#P ＜0.05，vs．the control group;△P ＜0.05，vs．the model group healthy side;▲P ＜0.05，vs．the model group affected side;□P ＜0.05，vs．a(chǎn)cupunture group healthy side．

組別Groups 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h空白組Control group 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74模型組健側(cè)Model group healthy side 159509.92±37488.98#288824.99±85352.68#147767.39±34214.72 181026.82±64548.24#273672.49±173401.83#307281.12±125453.66#患側(cè)Model group affected side 162049.45±38542.74 248977.65±18853.59#155241.03±74295.91△202082.30±61369.86#203827.80±55309.95 335731.39±34122.78#針刺組健側(cè)Acupunture group healthy side 402705.87±183392.23△496248.81±59003.44△347462.70±60274.80△275956.55±111158.30 272454.16±105007.53△426407.09±24300.12患側(cè)Acupunture group affected side 234326.77±44547.28▲□287853.74±65379.62▲□234156.08±8424.30▲□207482.43±82936.51□218252.23±94233.61 301480.25±40683.47▲□

3 討論

缺血性腦中風(fēng)是常見的中風(fēng)類型，其發(fā)生率約占中風(fēng)總?cè)藬?shù)的60% ～80%［5］。對其損傷與修復(fù)機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)是造成腦缺血/再灌注損傷的主要原因之一［6－7］。早期給予溶栓、抗凝治療可有效降低再灌注損傷，但這種治療存在嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，對于長期中風(fēng)患者的恢復(fù)作用不顯著。近年來，大量研究表明針刺對腦缺血性疾病有良好的干預(yù)作用。本實(shí)驗(yàn)選取百會和足三里(患側(cè))對腦缺血/再灌注損傷模型大鼠進(jìn)行干預(yù)。其中百會為督脈穴，督脈循行于脊里，入絡(luò)腦，與腦和脊髓都有密切聯(lián)系，針刺百會可以促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)。足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，手足陽明經(jīng)行于四肢外側(cè)，匯聚于頭部，刺激陽明經(jīng)穴可以通調(diào)氣血，改善肢體功能障礙，調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)運(yùn)動中樞。有研究認(rèn)為針刺百會、足三里穴能減輕缺血時(shí)腦功能損傷，通過抑制腦缺血/再灌注區(qū)的炎性反應(yīng)，降低ICAM-1 表達(dá)，促進(jìn)缺血區(qū)腦神經(jīng)功能恢復(fù)［2］。

IL-1β 主要由神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。腦缺血再灌注后，IL-1β蛋白含量顯著增多，其主要原因是缺血后再灌注可激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，分泌大量IL-1β，促使白細(xì)胞向缺血區(qū)浸潤，導(dǎo)致神經(jīng)元壞死［8］［9］［10］。ICAM-1 為免疫球蛋白超家族成員，主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是重要的白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子之一，參與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的信號交換，介導(dǎo)細(xì)胞黏附、識別、活化、增殖、分化、炎性反應(yīng)，以及損傷修復(fù)等多種病理生理功能［11］。腦缺血損傷后，炎性細(xì)胞因子IL-1β 可激活胞內(nèi)信號通路，使ICAM-1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)增高。在黏附分子介導(dǎo)下白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，白細(xì)胞變形移出血管并浸潤到腦組織，導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元死亡和梗死面積擴(kuò)大［12］。

腦缺血/再灌注損傷初期(48 h 內(nèi))，由炎性細(xì)胞分泌的炎性因子具有神經(jīng)毒性作用，其持續(xù)時(shí)間越長、表達(dá)越多，應(yīng)激損傷程度越強(qiáng)［13－14］。腦缺血/再灌注損傷中后期(72 －144 h)，主要由膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子具有神經(jīng)保護(hù)作用，可刺激機(jī)體啟動神經(jīng)損傷修復(fù)功能，促進(jìn)神經(jīng)元存活及組織再生［15－16］。本實(shí)驗(yàn)中正常組大鼠腦區(qū)的IL-1β 和ICAM-1 均少量表達(dá)，主要來源于神經(jīng)元細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［17－18］。模型組大鼠患側(cè)腦區(qū)的IL-1β 和ICAM-1 表達(dá)均呈現(xiàn)典型的雙峰模式。腦缺血早期，強(qiáng)烈的應(yīng)激及損傷反應(yīng)導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子表達(dá)增高。腦缺血中后期，隨著炎性反應(yīng)的抑制及修復(fù)功能的啟動而表達(dá)降低。針刺百會和足三里穴后，早期患側(cè)腦區(qū)IL-1β 的表達(dá)水平顯著降低，炎性反應(yīng)得到抑制。中后期，炎性因子增多，表達(dá)時(shí)間提前，可激活損傷-修復(fù)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，促進(jìn)損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)。ICAM-1 在損傷修復(fù)早期和中后期表達(dá)水平均顯著增高，表明針刺可活化膠質(zhì)細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞間聯(lián)系，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，恢復(fù)神經(jīng)元功能。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠患側(cè)腦組織ICAM-1 免疫組化圖(×100)Fig．2 Expression of ICAM-1 in the affected side brain tissues at different time points in the rats of each group．Immunohistochemical staining，×100．

模型組患側(cè)腦區(qū)IL-1β 在缺血再灌注早期表達(dá)高于健側(cè)，在中后期低于健側(cè)，提示早期的細(xì)胞損傷與IL-1β 表達(dá)增高有關(guān)，中后期健側(cè)腦組織通過啟動內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，產(chǎn)生缺氧耐受，從而減緩了缺血區(qū)的細(xì)胞損傷。健、患側(cè)腦組織中ICAM-1 表達(dá)趨勢相似，提示健側(cè)腦組織在應(yīng)激-損傷過程中可能發(fā)揮了協(xié)同替代作用。針刺組患側(cè)腦區(qū)IL-1β 和ICAM-1 的表達(dá)水平低于健側(cè)，表明電針可以抑制缺血區(qū)的炎癥反應(yīng)，并活化了健側(cè)腦區(qū)相關(guān)的細(xì)胞信號。

本研究結(jié)果表明針刺可影響雙側(cè)腦組織中IL-1β 和ICAM-1 的表達(dá)，且患側(cè)表達(dá)水平均低于健側(cè)，提示針刺百會配伍足三里穴對腦缺血后機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)激-損傷-修復(fù)信號鏈發(fā)揮了網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用，針刺可通過降低患側(cè)腦組織IL-1β 和ICAM-1 的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，改善腦缺血再灌注損傷，這可能是針刺治療腦缺血性疾病的機(jī)制之一。

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