• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    肥胖男性不育患者精子線粒體膜電位、游離脂肪酸、活性氧的關(guān)系

    2015-02-07 11:25:01白雙勇王劍松趙慶華
    關(guān)鍵詞:精漿膜電位活性氧

    白雙勇,王劍松,趙慶華

    (昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.泌尿外科;2.婦科,昆明 650101)

    ·論著·

    肥胖男性不育患者精子線粒體膜電位、游離脂肪酸、活性氧的關(guān)系

    白雙勇1,王劍松1,趙慶華2

    (昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.泌尿外科;2.婦科,昆明 650101)

    目的探討肥胖男性不育患者精子線粒體膜電位的改變,以及線粒體膜電位與精漿中游離脂肪酸、活性氧之間的關(guān)系。方法按照研究條件,隨機整群選取正常生育男性51人(對照組)、正常體重指數(shù)不育男性36人(正常體重不育組)、超重不育男性44人(超重不育組)、肥胖不育男性45人(肥胖不育組)。精液常規(guī)分析,ELSA法檢測精漿中游離脂肪酸、活性氧,流式細胞儀檢測精子線粒體膜電位。結(jié)果線粒體膜電位正常率的比較中正常體重不育組(27.34%±13.38%)、超重不育組(28.26%±9.76%)、肥胖不育組(25.27%±7.51%)均低于對照組(35.12%±15.90%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。肥胖不育組中線粒體膜電位正常率雖然低于正常體重不育組及超重不育組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。精子線粒體膜電位正常率與精子前向運動率呈明顯正相關(guān)(r=0.29,P<0.01)。精漿中游離脂肪酸與精漿中活性氧呈明顯正相關(guān)(r=0.30,P<0.01),精漿中活性氧與精子正常線粒體膜電位呈明顯負相關(guān)(r=-0.24,P<0.01)。結(jié)論超重及肥胖男性不育患者精漿中游離脂肪酸增高,引起活性氧增加,活性氧使得線粒體膜電位下降,最終可能導(dǎo)致精子運動能力下降。治療時應(yīng)考慮建議患者減少高脂餐、適當運動。

    肥胖;男性不育;活性氧;游離脂肪酸;線粒體膜電位

    隨著全球人口肥胖率上升,肥胖對生育的影響逐漸引起人們的重視。研究顯示,肥胖可能增加男性不育率[1]。肥胖男性內(nèi)臟脂肪堆積,過多的游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FA)在進行氧化過程中產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[2]。在低水平時ROS可以調(diào)節(jié)精子生理功能,包括精子獲能、頂體反應(yīng)、線粒體鞘穩(wěn)定性和精子的運動性。但是過量的ROS及其代謝產(chǎn)物可能損傷DNA、脂質(zhì)、蛋白,改變酶系統(tǒng),影響精子線粒體功能,改變精子線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP),而精子運動能力的維持主要依賴于線粒體提供的能量[3]。本研究目的是探討在肥胖男性精子MMP與精漿中ROS、FFA三者之間的關(guān)系,為臨床分析肥胖男性不育病因以及診治提供一定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料

    本研究在昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會同意下進行,每個參與的患者都被告知相應(yīng)的權(quán)利。在2013年3月至12月于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心就診的人群中隨機整群抽取男性。男性不育癥標準:有規(guī)律性生活未避孕1年而未使妻子受孕的男性。根據(jù)中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會2013年10月1日實施衛(wèi)生行業(yè)標準的成人體質(zhì)量判定標準,男性正常體重指數(shù)(body mass index,BMI)標準:24.00 kg/m2>BMI≥18.5 kg/m2;超重組:28.00 kg/m2>BMI≥24.0 kg/m2;肥胖組:BMI≥28.0 kg/m2。排除標準:與超重/肥胖無關(guān)的疾病或異常病史(包括精索靜脈曲張、隱睪癥、腫瘤、男性絕育術(shù)、睪丸扭轉(zhuǎn));嚴重附屬性腺炎癥;有明顯的影響生育力的毒物接觸,如農(nóng)藥廠、電焊、油漆等工作人群;嚴重少弱精癥和無精子癥。隨機整群抽取來生殖中心就診已經(jīng)生育健康一孩且BMI正常男性51人為對照組,正常BMI不育男性36人(正常體重不育組),超重不育男性44人(超重不育組),肥胖不育男性45人(肥胖不育組)。

    1.2 方法

    1.2.1 精液分析:所有參與課題男性不育癥患者禁欲48~72 h后,通過手淫辦法獲取精液,嚴格按照世界衛(wèi)生組織2010年第5版人類精液檢驗與處理實驗室手冊要求,由昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院男科實驗室工作人員按操作規(guī)程精液常規(guī)分析。

    1.2.2 流式細胞儀檢測精子MMP:制備單細胞懸液:取10萬個精子,重懸于0.5 mL細胞培養(yǎng)液中。加入0.5 mL JC-1染色工作液(購于碧云天生物技術(shù)公司,MMP檢測試劑盒JC-1),顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。600 g、4℃離心3~4 min,沉淀細胞。棄上清,用JC-1染色緩沖液洗滌2次。加入1 mL JC-1染色緩沖液重懸細胞,600 g、4℃離心3~4 min,沉淀細胞,棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液重懸后,行流式細胞儀分析。把試劑盒中提供的CCCP(10 mmol/L)推薦按照1:1 000的比例加入到細胞培養(yǎng)液中,稀釋至10 μmol/L,處理細胞20 min。隨后按照下述方法裝載JC-1,進行MMP的檢測。10 μmol/L CCCP處理20 min后線粒體的膜電位會完全喪失,JC-1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光。未經(jīng)10 μmol/L CCCP處理的精子為陰性對照。流式細胞儀(FACSCalibur型,美國BD公司)檢測JC-1單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為490 nm,發(fā)射光設(shè)置為530 nm;檢測JC-1聚合物時,可以把激發(fā)光設(shè)置為525 nm,發(fā)射光設(shè)置為590 nm。綠色熒光說明MMP下降,該細胞很可能處于細胞凋亡早期。紅色熒光說明MMP比較正常,細胞的狀態(tài)也比較正常。

    1.2.3 檢測精漿中FFA、ROS:精液相關(guān)指標檢測后,將精液標本經(jīng)2 000 g離心25 min獲取精漿,行ELISA(上海鑫樂生物有限公司試劑盒)檢測精漿中ROS、FFA。根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的吸光度計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣品的吸光度在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 19.0軟件導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以表示,采用單因素方差分析比較,LSD分析各組間差異,Person相關(guān)性分析檢測各因素之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同BMI組男性不育患者中精液分析、精漿中ROS、FFA、精子正常MMP率及MMP下降率比較

    在精液各項指標比較中,超重不育組精子活動率高于正常體重不育組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。精漿FFA的比較中,超重不育組及肥胖不育組高于對照組及正常體重不育組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在精漿ROS水平比較中,肥胖不育組高于對照組、正常體重不育組、超重不育組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在各組精液中精子正常MMP率的比較中,3個不育組均低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而3個不育組的比較中,肥胖不育組中正常MMP率雖然低于正常體重不育組及超重不育組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在MMP下降率的比較中,3個不育組均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    2.2 BMI、精漿中ROS、FFA、精子正常MMP率、MMP下降率與精液常規(guī)各項指標相關(guān)性分析

    BMI與精子濃度呈正相關(guān)(r=0.17,P<0.05),與精子正常MMP率呈負相關(guān)(r=-0.17,P<0.05),與精子MMP下降率呈正相關(guān)(r=0.18,P<0.05)。BMI與精漿中FFA呈明顯正相關(guān)(r=0.56,P<0.01),與精漿中ROS呈明顯正相關(guān)(r=0.44,P<0.01)。精子正常MMP率與精子前向運動率呈明顯正相關(guān)(r=0.29,P<0.01),而精子MMP下降率與精子活動率呈負相關(guān)(r=-0.27,P<0.05),與精子前向運動率呈明顯負相關(guān)(r=-0.24,P<0.01)。精漿中FFA與精漿中ROS呈明顯正相關(guān)(r=0.30,P<0.01),精漿中ROS與精子正常MMP率呈明顯負相關(guān)(r=-0.24,P<0.01)。見表2。

    表1 不同BMI男性不育患者MMP及精漿中ROS、FFA的比較Tab.1 Comparison of ROS,F(xiàn)FA in the seminal plasma and MMP in different BMI infertile patient groups

    表2 男性不育患者中精液指標、MMP、精漿中ROS、FFA及BMI相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of ROS,F(xiàn)FA in the seminal plasma,BMI,MMP and semen analysis

    3 討論

    線粒體的呼吸鏈是機體產(chǎn)生ROS的主要部位,呼吸鏈的各復(fù)合體在傳遞電子的過程中,由于將漏出的電子直接交給氧,產(chǎn)生部分被還原的氧,所以得到ROS這樣的“副產(chǎn)物”,特別O2-產(chǎn)生主要來自呼吸鏈。復(fù)合體Ⅲ中通過Q循環(huán)傳遞電子,接受單電子的半醌型QH-在內(nèi)膜中自由移動,通過非酶促反應(yīng)直接將單個電子泄露給O2而生成O2-[5]。

    肥胖患者中有較高水平的FFA,導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生過量ROS[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)在小鼠脂肪前體細胞中添加FFA,24 h后該細胞ROS明顯上升。Erdemir等[7]發(fā)現(xiàn)肥胖導(dǎo)致睪丸內(nèi)ROS增加,ROS類能使脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)硝基化而損傷細胞膜和膜蛋白。羥自由基可直接引起蛋白質(zhì)、核酸等各種生物分子的氧化損傷而喪失功能,進而破壞細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。線粒體是細胞產(chǎn)生ROS的主要部位,因此線粒體DNA、基質(zhì)中的酶最易融到ROS攻擊而損傷[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肥胖不育組精漿中FFA高于對照組、正常體重不育組、超重不育組,與后3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在精漿中ROS水平比較中,肥胖不育組精漿中FFA高于對照組、正常體重不育組、超重不育組,與后3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。超重不育組精漿中ROS含量高于對照組及正常體重不育組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而正常體重不育組與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。精漿中FFA與精漿中ROS呈明顯正相關(guān),與前兩者研究結(jié)果相似。ROS被認為是男性不育的重要病因,有研究發(fā)現(xiàn)[9]在30%~40%男性不育患者精漿中發(fā)現(xiàn)ROS水平增加。精子容易受到ROS攻擊,而且缺乏細胞內(nèi)酶修復(fù)系統(tǒng),主要是由于精子膜富含多不飽和脂肪酸,易受氧的作用和損傷,出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化,繼而快速大量ATP喪失,導(dǎo)致精子運動能力下降[10]。

    線粒體正常膜電位主要是依賴于位于線粒體基質(zhì)和線粒體膜間隙內(nèi)的質(zhì)子泵,使得基質(zhì)與膜之間不同的質(zhì)子保持一定電化學(xué)梯度。當線粒體內(nèi)ROS過度增加時,MMP下降。Ferramosca等[11]發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈的效率與精子活動率呈正相關(guān),而與精子不活動率呈負相關(guān),在其隨后的研究[12]中進一步發(fā)現(xiàn)精子活動率不僅與線粒體呼吸鏈功能呈正相關(guān),與ROS呈負相關(guān),且線粒體呼吸鏈功能受到ROS的抑制作用。Mupfiga等[13]認為MMP與精液中ROS有明顯相關(guān)性,而與精液中白細胞數(shù)量無相關(guān)性。La Vignera[14]的研究結(jié)果顯示,在超重和肥胖男性與對照組精子MMP下降率的比較中,后兩者增高。在各組精液中精子正常MMP率的比較中,正常體重不育組、超重不育組、肥胖不育組3組均低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而3組不育人群的比較中,肥胖不育組正常MMP率雖然低于正常體重不育組及超重不育組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在MMP下降率的比較中,結(jié)果與正常MMP率一致。精子正常MMP率與精子前向運動率呈明顯正相關(guān),而精子MMP下降率與精子活動率呈負相關(guān),與精子前項運動率呈明顯負相關(guān)。精漿中ROS與精子正常MMP率呈明顯負相關(guān)。

    綜上所述,本研究結(jié)果顯示由于超重及肥胖男性不育患者精漿中FFA增高,引起ROS增加,ROS使得MMP下降,最終可能導(dǎo)致精子運動能力下降。該結(jié)果對于臨床超重、肥胖男性不育的病因分析及診治提供了一定參考,在治療肥胖及超重男性不育患者時,應(yīng)該考慮改變其不良的生活、飲食習(xí)慣,減少高脂餐的攝入,適量運動。但由于本次研究樣本數(shù)量有限,還需要進一步擴大樣本量去證實該結(jié)果。

    [1]Du Plessis SS,Cabler S,McAlister DA,et al.The effect of obesity on sperm disorders and male infertility[J].Nat Rev Urol,2010,7(3):153-161.

    [2]Takahashi K,Yamaguchi S,Shimoyama T,et al.JNK-and IkappaB-dependent pathways regulate MCP-1 but not adiponectin release from artificially hypertrophied 3T3-L1 adipocytes preloaded with palmitate in vitro[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2008,294(5):E898-E909.

    [3]Henkel RR.Leukocytes and oxidative stress:dilemma for sperm function and male fertility[J].Asian J Androl,2011,13(1):43-52.

    [4]Hampl R,Drábková P,Kand′ár R,et al.Impact of oxidative stress on male infertility[J].Ceska Gynekol,2012,77(3):241-245.

    [5]Bournat JC,Brown CW.Mitochondrial dysfunction in obesity[J]. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes,2010,17(5):446-452.

    [6]Davis LM,Rho JM,Sullivan PG.UCP-mediated free fatty acid uncoupling of isolated cortical mitochondria from fasted animals:correlations to dietary modulations[J].Epilepsia,2008,49(Suppl 8):117-119.

    [7]Erdemir F,Atilgan D,Markoc F,et al.The effect of diet induced obesity on testicular tissue and serum oxidative stress parameters[J].Actas Urol Esp,2012,36(3):153-159.

    [8]Amaral A,Louren?o B,Marques M,et al.Mitochondria functionality and sperm quality[J].Reproduction,2013,146(5):R163-R174.

    [9]Lanzafame FM,La Vignera S,Vicari E,et al.Oxidative stress and medical antioxidant treatment in male infertility[J].Reprod Biomed Online,2009,19(5):638-659.

    [10]Gharagozloo P,Aitken RJ.The role of sperm oxidative stress in male infertility and the significance of oral antioxidant therapy[J]. Hum Reprod,2011,26(7):1628-1640.

    [11]Ferramosca A,Provenzano SP,Coppola L,et al.Mitochondrial respiratory efficiency is positively correlated with human sperm motility[J].Urology,2012,79(4):809-814.

    [12]Ferramosca A,Pinto Provenzano S,Montagna DD,et al.Oxidative stress negatively affects human sperm mitochondrial respiration[J].Urology,2013,82(1):78-83.

    [13]Mupfiga C,F(xiàn)isher D,Kruger T,et al.The relationship between seminal leukocytes,oxidative status in the ejaculate,and apoptotic markers in human spermatozoa[J].Syst Biol Reprod Med,2013,59(6):304-311.

    [14]La Vignera S,Condorelli RA,Vicari E,et al.Negative effect of increased body weight on sperm conventional and nonconventional flow cytometric spermparameters[J].J Androl,2012,33(1):53-58.

    (編輯 陳 姜)

    Relationship ofFree Fatty Acid,Reactive Oxygen Speciesand Sperm MitochondrialMembrane Potentialin Obese Male Infertility Patients

    BAIShuang-yong1,WANGJian-song1,ZHAOQing-hua2
    (1.Department of Urology,The Second Affiliated Hospital,Kunming Medical University,Kunming 650101,China;2.Department of Gynecology,The Second Affiliated Hospital,Kunming MedicalUniversity,Kunming 650101,China)

    Objective To investigate the change ofsperm mitochondrialmembrane potentialin obese male infertility patients,and to explore the relationship of sperm mitochondrial membrane potential with the reactive oxygen species and free fatty acids in seminal plasma.MethodsAccording to the research conditions,samples were randomly selected by clustersampling from outpatient,and divided into normalbody massindex fertile men as control group(n=51),normal body mass index infertile group(n=36),overweight infertile group(n=44),and obesity infertile group(n=45). Semen routine analysis was performed.Free fatty acid and reactive oxygen species in the seminal plasma was determined by ELSA method,sperm mitochondrial membrane potential was determined by flow cytometry.ResultsThe rate of normal sperm mitochondrial membrane potential in normal weight infertility(27.34%±13.38%),overweight infertility(28.26%±9.76%),obesity infertility group(25.27%±7.51%)were lower than the control group(35.12%±15.90%),the difference was statistically significant(P<0.05).Although obesity infertility group normal rate of mitochondrial membrane potential were lower than normal weight infertility group and the overweight infertility group,but there was no statistically significant difference.The rate ofsperm normalmitochondrialmembrane potentialwas positively correlated with the rate ofsperm progressive motility(r=0.29,P<0.01).Free fatty acid was positively correlated with reactive oxygen species in seminal plasma(r=0.30,P<0.01),reactive oxygen species in seminal plasma was negatively correlated with sperm normal mitochondrial membrane potential(r=-0.24,P<0.01).ConclusionFree fatty acid was elevated in the seminal plasma of overweight and obese patients with male infertility,which causes increased reactive oxygen species,reduced mitochondrial membrane potential,and eventually lead to the decline of sperm movement ability.Patients undergoing the treatment should be advised to reduce the high fatdietand perform properexercise.

    obesity;male infertility;reactive oxygen species;free fatty acid;mitochondrial membrane potential

    R698

    A

    0258-4646(2015)07-0653-04

    白雙勇(1972-),男,副主任醫(yī)師,博士研究生.

    王劍松,E-mail:jiansongwang@yahoo.com

    2014-12-30

    網(wǎng)絡(luò)出版時間:

    猜你喜歡
    精漿膜電位活性氧
    有關(guān)動作電位的“4坐標2比較”
    參芪復(fù)方對GK大鼠骨骼肌線粒體膜電位及相關(guān)促凋亡蛋白的影響研究
    精漿生化與精子參數(shù)相關(guān)性分析
    男性不育中醫(yī)證型與精漿游離microRNA表達相關(guān)性研究
    解脲支原體感染對男性不育者精漿活性氧與細胞因子的影響
    TLR3活化對正常人表皮黑素細胞內(nèi)活性氧簇表達的影響
    魚藤酮誘導(dǎo)PC12細胞凋亡及線粒體膜電位變化
    硅酸鈉處理對杏果實活性氧和苯丙烷代謝的影響
    分光光度法和原子吸收法測定精漿鋅結(jié)果比較觀察
    紅細胞膜電位的光學(xué)測定方法
    亚洲av综合色区一区| 青草久久国产| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 首页视频小说图片口味搜索 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品免费视频内射| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产男人的电影天堂91| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 999精品在线视频| 99久久精品国产亚洲精品| 99国产精品一区二区蜜桃av | 成年动漫av网址| 在线观看www视频免费| 精品少妇内射三级| 亚洲av男天堂| 国产黄色免费在线视频| 亚洲第一青青草原| 青春草视频在线免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 日日摸夜夜添夜夜爱| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 波野结衣二区三区在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| 999精品在线视频| 欧美日韩精品网址| 制服人妻中文乱码| 亚洲伊人久久精品综合| 日本午夜av视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 热re99久久精品国产66热6| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一区二区三区精品91| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜激情久久久久久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久久久久人人人人人| 欧美在线黄色| 国产欧美日韩精品亚洲av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品日本国产第一区| 黄片播放在线免费| 91麻豆av在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 黑丝袜美女国产一区| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 午夜免费鲁丝| 777米奇影视久久| 欧美日韩一级在线毛片| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲,欧美精品.| 午夜福利视频在线观看免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 色播在线永久视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 99香蕉大伊视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 99热网站在线观看| 国产色视频综合| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 午夜福利一区二区在线看| www.自偷自拍.com| 亚洲欧美激情在线| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 成年人黄色毛片网站| 色94色欧美一区二区| 国产主播在线观看一区二区 | 欧美日韩一级在线毛片| 嫁个100分男人电影在线观看 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 男女国产视频网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲九九香蕉| 久久国产精品大桥未久av| 国产一区二区激情短视频 | av在线app专区| 妹子高潮喷水视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 午夜福利,免费看| 日韩电影二区| 97在线人人人人妻| 好男人电影高清在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 超碰成人久久| 在现免费观看毛片| 婷婷色综合www| 在线观看免费高清a一片| 高清av免费在线| 一级片'在线观看视频| 久久这里只有精品19| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 性色av乱码一区二区三区2| 国产成人精品在线电影| 亚洲久久久国产精品| 亚洲精品一二三| 精品人妻在线不人妻| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产在线一区二区三区精| 少妇粗大呻吟视频| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品日本国产第一区| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲国产欧美网| 一本大道久久a久久精品| 中文字幕高清在线视频| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品一区二区免费欧美 | 麻豆av在线久日| 中国美女看黄片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| e午夜精品久久久久久久| 午夜激情久久久久久久| 中国国产av一级| 大片免费播放器 马上看| av不卡在线播放| 亚洲欧美激情在线| 中文字幕制服av| www.自偷自拍.com| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久亚洲精品不卡| 国产成人一区二区在线| 九草在线视频观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产成人精品无人区| 日韩av不卡免费在线播放| 成年人黄色毛片网站| 极品人妻少妇av视频| 91麻豆av在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 精品少妇内射三级| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 成人国产一区最新在线观看 | 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人av教育| 婷婷丁香在线五月| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 天堂8中文在线网| 国产成人a∨麻豆精品| 高清欧美精品videossex| 水蜜桃什么品种好| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲国产精品999| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品成人在线| 精品国产一区二区久久| 欧美中文综合在线视频| av在线播放精品| 热99国产精品久久久久久7| 999精品在线视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 大陆偷拍与自拍| 国产精品成人在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 欧美精品一区二区免费开放| 成人国产av品久久久| 免费在线观看影片大全网站 | 大香蕉久久网| 免费观看av网站的网址| 一区二区三区精品91| 国产成人av教育| 久久久精品94久久精品| 久久99热这里只频精品6学生| 日本欧美国产在线视频| 国产精品一二三区在线看| 超碰97精品在线观看| tube8黄色片| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 99热国产这里只有精品6| 久久久国产一区二区| 人人澡人人妻人| 2021少妇久久久久久久久久久| 日韩一区二区三区影片| 少妇精品久久久久久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 高清黄色对白视频在线免费看| 婷婷色综合大香蕉| 成人三级做爰电影| 国产免费视频播放在线视频| 超碰成人久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美97在线视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久精品成人免费网站| 日韩制服骚丝袜av| √禁漫天堂资源中文www| 中文字幕av电影在线播放| 欧美日韩精品网址| 午夜视频精品福利| 亚洲第一av免费看| 捣出白浆h1v1| 男的添女的下面高潮视频| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 高清欧美精品videossex| 热re99久久精品国产66热6| 波多野结衣av一区二区av| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲国产日韩一区二区| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 男女国产视频网站| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲成人免费电影在线观看 | 97在线人人人人妻| 亚洲,欧美精品.| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲国产av影院在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜免费成人在线视频| 高清视频免费观看一区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 多毛熟女@视频| 亚洲欧美清纯卡通| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜影院在线不卡| 在线天堂中文资源库| 久久久亚洲精品成人影院| 精品久久久久久电影网| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲图色成人| 亚洲av美国av| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 狂野欧美激情性bbbbbb| 91成人精品电影| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 1024视频免费在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| av电影中文网址| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲国产日韩一区二区| 日本av免费视频播放| 在线观看国产h片| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久久国产欧美日韩av| 黑丝袜美女国产一区| 婷婷色综合大香蕉| 久久久精品94久久精品| 曰老女人黄片| 免费黄频网站在线观看国产| 国产成人精品在线电影| 欧美日韩视频精品一区| 成人影院久久| 久久久久网色| 丝袜喷水一区| 亚洲成色77777| 男人操女人黄网站| 国产高清videossex| 丝袜脚勾引网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲av片天天在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲欧美激情在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 麻豆av在线久日| 欧美另类一区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 高清av免费在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 男人添女人高潮全过程视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 性少妇av在线| 好男人视频免费观看在线| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 女性被躁到高潮视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 欧美黑人精品巨大| 久久99一区二区三区| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品久久久久成人av| www.自偷自拍.com| 女人久久www免费人成看片| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 黄色怎么调成土黄色| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久av网站| 日韩大码丰满熟妇| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| a级毛片黄视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 免费不卡黄色视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久国产精品大桥未久av| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 亚洲黑人精品在线| 成人国语在线视频| 一本综合久久免费| 男人舔女人的私密视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 一级,二级,三级黄色视频| 婷婷丁香在线五月| 中文字幕精品免费在线观看视频| 91字幕亚洲| 在线天堂中文资源库| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产精品一区二区在线不卡| 女性被躁到高潮视频| 精品亚洲成国产av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 麻豆国产av国片精品| 欧美国产精品一级二级三级| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲国产精品国产精品| 视频区欧美日本亚洲| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一区二区三区四区激情视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品福利永久在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 免费黄频网站在线观看国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 色婷婷av一区二区三区视频| 99久久综合免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品.久久久| bbb黄色大片| 午夜免费鲁丝| 国产精品一二三区在线看| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲av国产av综合av卡| 久久久精品94久久精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品视频人人做人人爽| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 大码成人一级视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 91老司机精品| 精品亚洲成国产av| 男人操女人黄网站| a级毛片黄视频| videosex国产| 激情五月婷婷亚洲| av天堂在线播放| 性色av乱码一区二区三区2| 久久99热这里只频精品6学生| 国产在线观看jvid| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品二区激情视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲黑人精品在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲av片天天在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| e午夜精品久久久久久久| www日本在线高清视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产人伦9x9x在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 婷婷成人精品国产| www.999成人在线观看| 男女国产视频网站| 久久亚洲精品不卡| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品久久久av美女十八| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 精品高清国产在线一区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 男女国产视频网站| 亚洲少妇的诱惑av| 日本午夜av视频| 国产精品一二三区在线看| 久久久久久久久久久久大奶| 日本欧美国产在线视频| 90打野战视频偷拍视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲av日韩在线播放| 午夜免费鲁丝| 久久天堂一区二区三区四区| 日本一区二区免费在线视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 91精品三级在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产精品国产精品| 欧美精品一区二区大全| 精品高清国产在线一区| kizo精华| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 一级,二级,三级黄色视频| 99国产精品99久久久久| 亚洲,欧美,日韩| 免费av中文字幕在线| 国产在线观看jvid| 国产成人91sexporn| 午夜精品国产一区二区电影| 久热这里只有精品99| 七月丁香在线播放| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 五月开心婷婷网| 最近手机中文字幕大全| 交换朋友夫妻互换小说| 超碰97精品在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 一个人免费看片子| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品国产亚洲av涩爱| 丝袜美足系列| 交换朋友夫妻互换小说| 婷婷色av中文字幕| 亚洲免费av在线视频| 精品一品国产午夜福利视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成年人免费黄色播放视频| 99九九在线精品视频| 国产福利在线免费观看视频| 欧美成人午夜精品| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久久精品94久久精品| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲精品国产av成人精品| 电影成人av| 亚洲精品国产区一区二| 国产成人91sexporn| 成年动漫av网址| 久久久久久久久免费视频了| 欧美日韩综合久久久久久| 9热在线视频观看99| 亚洲美女黄色视频免费看| 老熟女久久久| √禁漫天堂资源中文www| 十八禁网站网址无遮挡| 婷婷色综合www| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 十分钟在线观看高清视频www| 久久久精品免费免费高清| 久久99热这里只频精品6学生| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲人成77777在线视频| 丝袜脚勾引网站| 亚洲天堂av无毛| 波多野结衣av一区二区av| 欧美精品av麻豆av| 五月开心婷婷网| 女性被躁到高潮视频| 成人手机av| 新久久久久国产一级毛片| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 99久久精品国产亚洲精品| 午夜免费观看性视频| 黄色怎么调成土黄色| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 免费观看av网站的网址| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 99热网站在线观看| 1024香蕉在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产黄色免费在线视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产一区二区三区综合在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 日韩av不卡免费在线播放| 成年av动漫网址| www.精华液| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜福利乱码中文字幕| 日本av手机在线免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久人人爽人人片av| 少妇人妻 视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 色播在线永久视频| 18在线观看网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| www.熟女人妻精品国产| 久久久国产精品麻豆| 国产精品久久久久久精品电影小说| 69精品国产乱码久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 丁香六月欧美| 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜免费成人在线视频| 久久热在线av| 亚洲欧美精品自产自拍| 悠悠久久av| 国产男女内射视频| 大香蕉久久网| 亚洲专区国产一区二区| 操美女的视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 999久久久国产精品视频| 国产成人啪精品午夜网站| 视频区欧美日本亚洲| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 18禁国产床啪视频网站| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产熟女午夜一区二区三区| h视频一区二区三区| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲一区二区三区欧美精品| 新久久久久国产一级毛片| 欧美久久黑人一区二区| 大话2 男鬼变身卡| 18禁观看日本| 精品一区在线观看国产| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品国产超薄肉色丝袜足j| xxx大片免费视频| 国产精品九九99| 久久国产精品影院| 在线av久久热| 看免费成人av毛片| 久热爱精品视频在线9| 亚洲av男天堂| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲天堂av无毛| 午夜精品国产一区二区电影| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 男女无遮挡免费网站观看| bbb黄色大片| 日日夜夜操网爽| 国产在线免费精品| 中文字幕精品免费在线观看视频| 超色免费av| 日本五十路高清| 久久ye,这里只有精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美日韩av久久| 婷婷色综合大香蕉| 国产真人三级小视频在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲国产av新网站| 亚洲av在线观看美女高潮| 高清av免费在线| 午夜福利,免费看| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产免费福利视频在线观看| 久久久精品区二区三区| 一区在线观看完整版| 亚洲精品国产av蜜桃| 99精品久久久久人妻精品| av在线app专区| 欧美精品av麻豆av| 国产高清不卡午夜福利| 一级a爱视频在线免费观看| 最黄视频免费看| 美女午夜性视频免费| 中国国产av一级| 天天添夜夜摸| 秋霞在线观看毛片| 国产国语露脸激情在线看| 97在线人人人人妻| svipshipincom国产片|