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    PJ34對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織MMP-9、Claudin-5表達(dá)的影響

    2015-02-07 12:10:06吳捧蓮李巖付新慧杜良鶴王東玉
    關(guān)鍵詞:局灶通透性腦缺血

    吳捧蓮,李巖,付新慧,杜良鶴,王東玉

    (1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,遼寧 錦州 121001;2.遼寧省錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 錦州 121000)

    ·論著·

    PJ34對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織MMP-9、Claudin-5表達(dá)的影響

    吳捧蓮1,李巖2,付新慧1,杜良鶴1,王東玉2

    (1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,遼寧 錦州 121001;2.遼寧省錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 錦州 121000)

    目的探討多聚ADP核糖聚合酶1(PARP-1)抑制劑PJ34對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后缺血側(cè)皮層金屬蛋白酶9(MMP-9)和Claudin-5表達(dá)的影響。方法采用線栓法制備大鼠局灶腦缺血再灌注模型,腹腔注射PJ34,用伊文思藍(lán)(EB)法檢測(cè)血腦屏障通透性變化,采用2,3,5-三氨基苯甲四氮唑(TTC)染色檢測(cè)腦梗死體積變化,免疫組化和Western blot方法檢測(cè)腦缺血側(cè)皮層MMP-9和Claudin-5表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較,隨缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng),模型組MMP-9表達(dá)、EB含量、腦梗死體積逐漸增加,48 h達(dá)峰;Claudin-5的表達(dá)、EB含量、腦梗死體積逐漸減少,48 h最低(P均<0.05)。與模型組比較,PJ34組MMP-9表達(dá)、EB含量、腦梗死體積在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯降低,Claudin-5的表達(dá)、EB含量、腦梗死體積在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯增高(P均<0.05)。結(jié)論P(yáng)J34通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá),增加Claudin-5的表達(dá)來(lái)維持血腦屏障通透性,對(duì)腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。

    PJ34;金屬蛋白酶9;Claudin-5;血腦屏障;缺血再灌注

    PARP-1的抑制劑PJ34[N-(6-氧代-5,6二氫-菲-2-基)-N,N-二甲基乙酰胺],為水溶性菲啶酮類化合物,主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性阻斷多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase-1,PARP-1)分子上NAD+結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作用,在缺血再灌注損傷和帕金森病、癌癥的動(dòng)物模型中取得較好治療效果[1]。PJ34對(duì)缺血再灌注損傷血腦屏障通透性的研究機(jī)制尚未完全清楚。近年研究表明金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)可以降解基底膜蛋白、層黏連蛋白、膠原蛋白和緊密連接蛋白(Claudin-5和occludin),破壞血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性。

    本實(shí)驗(yàn)研究建立在上述研究的基礎(chǔ)上,采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型,選用PJ34作為干預(yù)因素,觀察PJ34對(duì)大鼠局灶腦缺血再灌注BBB通透性變化、缺血側(cè)腦組織MMP-9、Claudin-5蛋白表達(dá)的影響,探討PJ34減輕腦缺血再灌注損傷的機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料和試劑

    健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠120只,體質(zhì)量250~300 g,由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK[遼]2010-0001)。隨機(jī)均分為3組:假手術(shù)組、模型組、PJ34組。各組分別在缺血再灌注24 h、48 h取材。PJ34組在缺血再灌注時(shí)及再灌注后2 h分別給予PJ34(10 mg/kg),假手術(shù)組、模型組在相同時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水。PJ34購(gòu)自Selleck.cn公司;兔抗鼠MMP-9多克隆抗體、生物素標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;兔抗鼠Claudin-5多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司。

    1.2 大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型制備

    參照Longa等[2]的實(shí)驗(yàn)方法,制作大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注模型。采用直徑2 mm的魚(yú)線,長(zhǎng)約5.8 cm,一端用酒精燈稍加熱使魚(yú)線頭部直徑約為0.25~0.28 mm,備用。大鼠10%水合氯醛(300 mg/kg,腹腔注射)麻醉后,固定,消毒,頸部正中切口,分離頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)、外動(dòng)脈,勿損傷迷走神經(jīng),于頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈根部結(jié)扎,在頸總動(dòng)脈分叉近心端處剪一小口,插入魚(yú)線,進(jìn)線(1.8±0.5)cm,感到有阻力時(shí),即栓線到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處及大腦前動(dòng)脈近心端,從而阻斷大腦中動(dòng)脈血流,結(jié)扎固定魚(yú)線??p合筋膜、皮膚。栓塞2 h后使血流再通。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程與模型組相同,不插魚(yú)線。大鼠麻醉后約2 h開(kāi)始蘇醒,于再灌注時(shí)判斷其神經(jīng)功能缺損情況,按照l(shuí)onga評(píng)分法[3]進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分1~3分納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,0分、4分剔除,符合評(píng)分但有蛛網(wǎng)膜下腔出血、術(shù)后死亡作為缺失值剔除,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)足,術(shù)后保持環(huán)境溫度25~30℃。

    1.3 伊文思藍(lán)(Evans blue,EB)BBB通透性測(cè)定

    每亞組隨機(jī)抽取5只大鼠,在取腦前30 min經(jīng)尾靜脈注射2%EB。麻醉后用肝素化生理鹽水心臟灌流至右心房流出液體為清亮。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取腦組織,稱重,置于甲酰胺中(100 mg/mL),45℃水浴24 h,離心取上清液。分光光度計(jì)波長(zhǎng)為620 mm測(cè)定上清液吸光度(optical density,OD)值,腦組織EB含量計(jì)算公式:腦組織EB含量(μg/g)=待測(cè)樣品EB含量(μg/mL)×甲酰胺溶液(mL)/腦濕重(g),待測(cè)樣品EB含量是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得。

    1.4 腦梗死體積測(cè)定(TTC染色法)

    每亞組隨機(jī)抽取5只大鼠,斷頭取腦,快速經(jīng)枕骨大孔取出腦組織,洗凈腦組織,-20℃冰箱速凍30 min。腦組織從額極向后以2 mm間距冠狀切成5片。腦片置于37℃水浴箱避光染色15~30 min,注意中間翻片使切片均勻接觸染色液,10%多聚甲醛中固定。鼠腦切片用數(shù)碼相機(jī)拍照,用眼科鑷分離白色區(qū)與紅色區(qū),分別稱重,以梗死組織重量占缺血側(cè)腦組織重量的百分比作為梗死體積的判定標(biāo)準(zhǔn)。

    1.5 免疫組化染色檢測(cè)MMP-9、Claudin-5在腦組織的表達(dá)

    每亞組隨機(jī)抽取5只大鼠10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,快速打開(kāi)胸腔,經(jīng)左心室穿刺插管入主動(dòng)脈,灌注4℃生理鹽水250 mL,同時(shí)剪開(kāi)右心耳,4%多聚甲醛250 mL緩慢灌注至液體清亮斷頭取腦,固定液中保存。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋,連續(xù)冠狀切片,操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行MMP-9、Claudin-5免疫組化染色。切片染色后每個(gè)樣本選取5張切片,每張切片于400倍光鏡下系統(tǒng)隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算平均積分光密度值(mean oprieal density,MOD)。圖像分析MMP-9、Claudin-5在腦組織額頂葉皮層的表達(dá),用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像分析。

    1.6 Western blot檢測(cè)MMP-9、Claudin-5在腦組織的表達(dá)

    每亞組隨機(jī)抽取5只大鼠,斷頭取腦,冰上迅速分離額頂葉皮層,放入EP管中,-80℃冰箱保存。組織標(biāo)本加入適量裂解液,進(jìn)行超聲波粉碎,低溫離心取上清液。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量,沸水煮5 min,離心備用。制備分離膠和濃縮膠,加樣,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加一抗:兔抗大鼠多克隆MMP-9抗體(1∶300)和Claudin-5(1∶300)4℃孵育過(guò)夜,TBST漂洗,5 min× 3次,加二抗(山羊抗兔IgG,1∶3 000)孵育2 h。TBST漂洗,5 min×3次,ECL發(fā)光,X線曝光、顯影、定影,計(jì)算機(jī)圖像分析。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 PJ34對(duì)血腦屏障通透性的影響

    用EB法檢測(cè)血腦屏障通透性,EB含量變化來(lái)評(píng)價(jià)血腦屏障通透性變化。與假手術(shù)組比較,模型組與PJ34組均明顯增高(P<0.05),EB含量在再灌注后48 h達(dá)峰。與模型組比較,PJ34組能降低血腦屏障的破壞,使EB含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 PJ34對(duì)大鼠EB含量的影響(μg/g濕重)Tab.1 Influence of PJ34 on EB content in rats(μ g/g wet weight)

    2.2 梗死體積百分比測(cè)定

    用TTC染色法檢測(cè)腦梗死體積。與假手術(shù)組比較,模型組與PJ34組均明顯增高(P<0.05),腦梗死體積在再灌注后48 h達(dá)峰。與模型組比較,PJ34組腦梗死體積明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見(jiàn)表2。

    表2 大鼠腦梗死體積百分比比較(%)Tab.2 Comparison of the percentage of infarct volume in rats(%)

    2.3 MMP-9和Claudin-5的分布和表達(dá)

    免疫組化結(jié)果顯示,MMP-9在缺血側(cè)額頂葉皮層胞質(zhì)中呈棕褐色或棕黃色陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)組比較,模型組、PJ34組MMP-9的MOD值在再灌注后24 h增加,48 h達(dá)高峰,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,PJ34組MMP-9的MOD值在再灌注后減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3、圖1。Claudin-5在缺血側(cè)額頂葉皮層中沿微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕褐色或棕黃色表達(dá)。與假手術(shù)組比較,模型組和PJ34組Claudin-5在再灌注后24 h MOD值降低,48 h MOD值降低最明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,PJ34組Claudin-5在再灌注后MOD值均高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3、圖2。

    圖1 免疫組化法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮層MMP-9的表達(dá) ×400Fig.1 Expressions of MMP-9 measured by immunohistochemistry assay in the ischemic cerebral cortex of rats×400

    表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)免疫組化法檢測(cè)MMP-9蛋白和Claudin-5蛋白的MOD值比較Tab.3 Comparison of the MOD values of MMP-9 and Claudin-5 protein in each group at different time points in rats by Immunohistochemistry

    圖2 免疫組化法檢測(cè)缺血側(cè)微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Claudin-5的表達(dá) ×400Fig.2 Expressions of claudin-5 measured by immunohistochemistry assay in the ischemic brain microvessel endothelial cells of rats ×400

    2.4 Claudin-5和MMP-9蛋白的表達(dá)

    采用Western blot法進(jìn)一步證實(shí)假手術(shù)組、模型組和PJ34組中Claudin-5和MMP-9蛋白表達(dá)的影響。與假手術(shù)組比較,模型組出現(xiàn)MMP-9特異性條帶,24 h增高,48 h達(dá)峰;與模型組比較,PJ34組 MMP-9特異性條帶均減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組Claudin-5特異性條帶24 h降低,48 h降低最明顯;與模型組比較,PJ34組Claudin-5特異性條帶均增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4、圖3。

    表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MMP-9蛋白和Claudin-5蛋白相對(duì)含量的比較(%)Tab.4 Comparison of the relative content of MMP-9 and Claudin-5 protein in each group at different time points in rats by Western blot(%)

    圖3 Western blot法檢測(cè)缺血側(cè)皮層MMP-9、Claudin-5的表達(dá)Fig.3 The expressions of MMP-9 and Claudin-5 were measured by Western blot analysis in the ischemic cerebral cortex of rats

    3 討論

    PARP-1抑制劑在心腦血管疾病、癌癥、內(nèi)分泌疾病和炎癥中的作用已經(jīng)成為全球研究和關(guān)注的熱點(diǎn),但較少見(jiàn)其對(duì)血腦屏障通透性方面的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要觀察了PARP-1抑制劑PJ34對(duì)MMP-9、Claudin-5在腦缺血再灌注損傷中表達(dá)的影響,旨在探討PJ34對(duì)血腦屏障通透性影響的研究機(jī)制。

    PARP-1是一種DNA損傷效應(yīng)酶,主要分布細(xì)胞核內(nèi),對(duì)DNA損傷修復(fù)起重要作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)生DNA損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí),PARP-1被激活,應(yīng)用PARP-1抑制劑PJ34,可以抑制PARP-1的表達(dá),能充分恢復(fù)ATP水平,減少神經(jīng)細(xì)胞死亡,對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用[4]。研究表明在大鼠局灶腦缺血再灌注損傷中,PJ34干預(yù)使腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá)減少,降低TNF-α對(duì)MMP-9mRNA合成的誘導(dǎo),從而降低MMP-9的表達(dá)[5,6]。Koh等[7]通過(guò)研究PARP抑制劑3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)的治療效果,PARP抑制劑3-AB治療組各時(shí)間點(diǎn)血漿及腦內(nèi)MMP-9的水平、核轉(zhuǎn)錄因子kB(nuclear factor-kappa B,NF-kB)的活性顯著減少。TNF-α通過(guò)NF-kB基因的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn),誘導(dǎo)MMP-3的表達(dá),MMP-3能激活MMP-9。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,在腦缺血再灌注損傷24 h時(shí),MMP-9表達(dá)明顯升高,48 h時(shí)達(dá)高峰,PJ34干預(yù)腦缺血再灌注后,缺血側(cè)皮層MMP-9的活性降低、表達(dá)減少,梗死體積減少,神經(jīng)缺損有所改善。

    腦缺血再灌注后激活的膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞均能釋放MMP-9,MMP-9可以攻擊腦毛細(xì)血管基底膜和緊密連接(tight junction,TJ)蛋白,導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤(rùn)、血腦屏障開(kāi)放、血管源性水腫、缺血后出血性轉(zhuǎn)化[8]。Claudin-5是構(gòu)成TJ蛋白的骨架蛋白,是決定TJ蛋白屏障通透性的主要蛋白,維護(hù)大鼠的BBB完整性。TJ蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成腦和血液之間物質(zhì)交換的第一道屏障,BBB是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵。因此,MMP-9可以降解Claudin-5蛋白。研究表明在大鼠缺血再灌注損傷模型組,MMP-9表達(dá)升高,Claudin-5表達(dá)減少,PARP抑制劑3-AB(10 mg/kg)治療組顯著上調(diào)Claudin-5的蛋白表達(dá)[9]。再灌注損傷中血腦屏障通透性破壞的一個(gè)重要機(jī)制是MMP-9降解Claudin-5[10,11]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致,應(yīng)用PJ34干預(yù)后MMP-9表達(dá)減少,Claudin-5表達(dá)增加。MMP-9和Claudin-5在調(diào)節(jié)血腦屏障通透性和血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性中起重要作用[12]。大鼠腦缺血損傷后,MMP-9被激活,激活的MMP-9通過(guò)降解Claudin-5,增加血腦屏障通透性。應(yīng)用MMP-9抑制劑后,Claudin-5表達(dá)下調(diào),血腦屏障通透性減少[13]。MMP-9降解Claudin-5的機(jī)制可能為:缺血再灌注損傷使炎性因子增加,導(dǎo)致NF-kB磷酸化,NF-kB的激活能上調(diào)MMP-9的表達(dá)[14]。Claudin-5的降解和血腦屏障通透性增加是MMP-9通過(guò)NF-kB/MMP-9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究也提示,在腦缺血再灌注后,MMP-9的表達(dá)下降可以增加Claudin-5的表達(dá)。

    本研究采用大腦中動(dòng)脈栓塞制備局灶腦缺血再灌注模型,在缺血再灌注后24 h,MMP-9的表達(dá)增加,Claudin-5的表達(dá)減少,血腦屏障通透性增加,梗死體積增加。在48 h時(shí)間點(diǎn)MMP-9的表達(dá)達(dá)峰,Claudin-5的表達(dá)最低,血腦屏障通透性達(dá)峰,腦梗死體積進(jìn)一步增加,表明MMP-9參與血腦屏障的破壞,Claudin-5對(duì)血腦屏障有保護(hù)作用。應(yīng)用PJ34干預(yù)后,MMP-9的表達(dá)減少,Claudin-5的表達(dá)增加,從而改善血腦屏障通透性,減少梗死體積,減少缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損。

    綜上所述,PJ34通過(guò)降低MMP-9的表達(dá),減少Claudin-5的降解,使Claudin-5的表達(dá)增加,改善血腦屏障通透性,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

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    (編輯 武玉欣)

    Influence of PJ34 on the Expression ofMMP-9 and Claudin-5 in Ratwith FocalCerebral Ischemia Reperfusion Injury

    WUPeng-lian1,LIYan2,F(xiàn)UXin-hui1,DU Liang-he1,WANG Dong-yu2
    (1.Graduate SchoolofLiaoning MedicalUniversity,Jinzhou 121001,China;2.DepartmentofNeurology,Jinzhou CentralHospital,Jinzhou 121000,China)

    Objective To investigate the effectsofPJ34,a poly ADP-ribose polymerase(PARP)inhibitor,on the expression ofmatrix metalloproteinases-9(MMP-9)and Claudin-5 in ischemic cortex of rats with focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R)injury.MethodsThe focal cerebral ischemia-reperfusion model of middle cerebral artery occlusion(MCAO)was established by intraluminal suture.PJ34 was injected intraperitoneally.Blood-brain barrier(BBB)permeability was quantitatively determined by Evansblue assay.Infarctvolume changes were observed by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloridedyeing(TTC)staining.The expression ofthe MMP-9 and Claudin-5 in rats ofcerebralcortex were measured by immunohistochemistry assay and Western blotanalysis.ResultsCompared with sham group,the expression ofMMP-9,the contents ofEB and infarctvolume increased progressively over time after I/R,and reached maximum levels at 48 h(P<0.05);The expression of Claudin-5,the contents of EB and infarct volume reduced significantly over time after I/R,and reached the minimum levels at 48 h in model group(P<0.05).Compared with model group,the expression of MMP-9,the contents of EB and infarct volume was reduced significantly and the expression of Claudin-5,the contents ofEB and infarctvolume was increased atthe same time pointin PJ34 group(P<0.05).ConclusionPJ34 maintained the blood-brain barrierpermeability by inhibiting the expression ofMMP-9,and increasing the expression ofClaudin-5,which had neuroprotection on cerebralischemiareperfusion injury.

    PJ34;matrix metalloproteinases-9;Claudin-5;blood-brain barrier;ischemia-reperfusion

    R743.3

    A

    0258-4646(2015)08-0694-05

    遼寧省自然科學(xué)基金(201102074)

    吳捧蓮(1988-),女,碩士研究生.

    王東玉,E-mail:1448219167@qq.com

    2015-02-24

    網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:

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