中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)及其在重癥急性胰腺炎中的研究進(jìn)展

楊 求 薛東波

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一種病死率極高的急腹癥。當(dāng)免疫系統(tǒng)功能增強(qiáng)時(shí)，引起的人體全身性炎癥反應(yīng)綜合征將會(huì)導(dǎo)致MODS的產(chǎn)生。研究表明，SAP患者炎性損傷與中性粒細(xì)胞的活化與趨化密切相關(guān),活化的中性粒細(xì)胞還可以通過(guò)釋放NETs來(lái)參與捕獲并殺滅病原菌[1]。NETs 由多種成分組成，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上附著的蛋白主要參與炎性反應(yīng)[2]。NETs是一種全新的導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制，其存在可以補(bǔ)充吞噬作用機(jī)制，能夠防止細(xì)菌逃逸，從而更好地殺滅病原體，保護(hù)宿主。在來(lái)自SAP小鼠模型的胰腺組織中，NETs加劇了胰腺組織的損傷。通過(guò)明確NETs與SAP之間的相關(guān)性，將有助于通過(guò)調(diào)控NETs來(lái)改善SAP患者的病情。因此，由于NETs與SAP之間的相互作用，針對(duì)NETs的研究可能會(huì)成為SAP治療的關(guān)鍵點(diǎn)。

一、NETs的組成成分及作用

NETs是由去聚化的染色質(zhì)DNA構(gòu)成的基本骨架，其表面附著瓜氨酸化組蛋白(CitH3)、嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)、組織蛋白酶G(CG)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、細(xì)胞外冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(eCIRP)和其他蛋白質(zhì)[3]。此結(jié)構(gòu)使NETs可以通過(guò)這些毒性蛋白捕獲并殺死病原微生物、真菌和寄生蟲(chóng)等[4]。

當(dāng)用脂多糖(LPS)或其他誘導(dǎo)NETs形成的物質(zhì)刺激多核中性粒細(xì)胞(PMN)時(shí)，PMN將首先失去核小葉并使染色質(zhì)解聚以形成游離的DNA纖維網(wǎng)，這種結(jié)構(gòu)的釋放將導(dǎo)致核膜破裂，細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)將黏附至DNA纖維上，最終，NETs將在細(xì)胞膜破裂后釋放[5]。在體外，由DNA纖維組成的NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)通過(guò)將抗菌蛋白附著到這些入侵病原菌上結(jié)合并殺死病原體。在患有敗血性血管內(nèi)血栓形成的個(gè)體中觀察到DNA與細(xì)菌纏結(jié)形成的血栓的存在，這證實(shí)了DNA纖維網(wǎng)可防止細(xì)菌在體內(nèi)逃逸。研究表明，NE、MPO和組蛋白等幾種特殊蛋白質(zhì)除具有抗菌活性外，其與NETs的形成也密切相關(guān)，MPO和NE的缺乏會(huì)阻斷NETs的形成[2]。

二、NETs的形成機(jī)制

根據(jù)是否需要活性氧(ROS)，將NETs的形成機(jī)制分為ROS依賴性和非ROS依賴性途徑。

1.ROS依賴性NETs的形成：PMA誘導(dǎo)NETs形成的途徑取決于ROS。PMA與細(xì)胞膜上的蛋白激酶C受體(PKC受體)結(jié)合并激活PKC。激活的PKC啟動(dòng)Raf-MEK-ERK(MAPK)途徑，并隨后激活NADPH氧化酶(NOX)，從而導(dǎo)致ROS產(chǎn)生[6]。ROS激活MPO，觸發(fā)NE從嗜酸性顆粒活化轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。NE轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中水解染色質(zhì)上的組蛋白，使染色質(zhì)去組裝形成游離的DNA復(fù)合物。組蛋白瓜氨酸化，這是由蛋白質(zhì)精氨酸脫亞氨酶4(PAD4)介導(dǎo)的，最終導(dǎo)致染色體解聚形成NETs[7]。

多數(shù)病原微生物、炎性細(xì)胞因子和化學(xué)物質(zhì)通過(guò)以下途徑驅(qū)動(dòng)NETs的形成，通過(guò)不同的上游受體[例如細(xì)菌致病因子的Toll樣受體(TLR)、整聯(lián)蛋白的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)等],從而激活NOX而形成的信號(hào)通路。作為該途徑中最重要的物質(zhì)，由PMN產(chǎn)生或由病原體分泌的ROS直接誘導(dǎo)NE從細(xì)胞質(zhì)顆粒轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而激活NETs形成所需的下游反應(yīng)。

ROS依賴的NETs的形成同時(shí)也受到自噬的調(diào)節(jié)。通過(guò)Ⅲ型組織相容性復(fù)合體(MHC)蛋白受體，調(diào)節(jié)NETs的形成，自噬的抑制會(huì)阻止佛波酯(PMA)或LPS/IL-8誘導(dǎo)的NETs形成，這表明自噬在NETs形成中的重要作用[8]。

2.非ROS依賴性NETs的形成:鈣離子是主要參與非ROS依賴性NETs形成的關(guān)鍵物質(zhì)。鈣離子載體直接激活PAD4和鈣蛋白酶以誘導(dǎo)NETs釋放而沒(méi)有ROS生成，由于PAD4的活化取決于鈣離子的存在，因此鈣離子缺乏會(huì)破壞NETs的形成。除了鈣離子的參與外，據(jù)報(bào)道核因子κB(NF-κB)還可以在不產(chǎn)生ROS的情況下調(diào)節(jié)尿酸誘導(dǎo)的NETs形成，表明NETs形成所需的下游核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受NF-κB調(diào)節(jié)[9]。在沒(méi)有NADPH氧化酶活化和ROS產(chǎn)生的情況下，也觀察到了由血小板誘導(dǎo)的NETs形成。經(jīng)LPS激活后，血小板表面的糖蛋白Ⅰb(GPⅠb)與嗜中性粒細(xì)胞上的β2-整聯(lián)蛋白(CD18)結(jié)合，然后激活Src激酶PI3K-ERK途徑，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，最終形成NETs[10]。

三、NETs與SAP之間的關(guān)聯(lián)

中性粒細(xì)胞在與SAP相關(guān)的炎性損傷中起著至關(guān)重要的作用[1]。在嚴(yán)重水腫或壞死的胰腺區(qū)域發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加。NETs及其活化的中性粒細(xì)胞來(lái)源的成分也在受損SAP動(dòng)物模型的組織中檢測(cè)到，并加劇了SAP的惡化和炎性組織損傷[11]。這些結(jié)果證實(shí)了NETs與SAP之間的聯(lián)系。研究表明，SAP患者的炎癥性損害是由活化的NETs及其組成成分引起的[12]。

1.NETs與SAP的發(fā)生——細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶的活化相關(guān):在SAP小鼠模型胰腺組織中發(fā)現(xiàn)了NETs的存在，其在體內(nèi)誘導(dǎo)胰蛋白酶活化、炎性反應(yīng)和組織損傷,SAP胰腺組織與NETs共存會(huì)增加胰蛋白酶的活性[13]。無(wú)細(xì)胞組蛋白包括那些源自NETs的毒性蛋白，破壞胰腺腺泡細(xì)胞質(zhì)膜，導(dǎo)致腺泡細(xì)胞質(zhì)泄漏和細(xì)胞死亡。抑制eCIRP顯著降低了NETs誘導(dǎo)的來(lái)自腺泡細(xì)胞的胰蛋白酶原分泌，這表明與NETs相關(guān)的eCIRP參與了炎性胰腺的蛋白水解激活。

2.NETs與SAP的進(jìn)展——全身性炎癥反應(yīng)綜合征相關(guān)：SAP的特征是胰蛋白酶原的異常激活后全身炎癥的級(jí)聯(lián)激活。酶原激活導(dǎo)致胰腺組織自消化和胰腺損傷。NETs組成成分中的eCIRP，可作為一種新型的損傷相關(guān)分子模式(DAMP)，通過(guò)蛋白水解消化(例如炎癥性細(xì)胞因子降解)在NETs中降解潛在有害的DAMPs[14]。受損的腺泡細(xì)胞釋放DAMP來(lái)促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1β的產(chǎn)生和細(xì)胞表面模式識(shí)別受體(包括TLR)的激活，最終導(dǎo)致SAP患者發(fā)生全身性炎癥反應(yīng)綜合征，SIRS持續(xù)性發(fā)生將會(huì)導(dǎo)致多個(gè)器官衰竭。

3.NETs與SAP患者凝血功能異常相關(guān):凝血纖維蛋白溶解異常導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)可能對(duì)急性胰腺炎的嚴(yán)重程度起重要作用。膠原蛋白或二磷酸腺苷(ADP)等經(jīng)典的血小板激動(dòng)劑引起的血小板活化會(huì)誘導(dǎo)NETs的生成。NETs除發(fā)揮抗菌活性外，還可以引發(fā)促凝、促血栓形成。NETs能夠促進(jìn)凝血酶的生成，反過(guò)來(lái)，激活的血小板促進(jìn)NETs的形成[15]。NETs的DNA纖維網(wǎng)和NE可以激活凝血因子(Ⅻ和Ⅹa因子)，并結(jié)合血小板，導(dǎo)致血小板減少，最終導(dǎo)致DIC，因此，NETs與SAP嚴(yán)重程度之間的關(guān)系由DIC的發(fā)生率可以表明。NETs可能是導(dǎo)致SAP患者DIC發(fā)生的關(guān)鍵因素。

4.NETs與SAP的局限化——參與胰腺壞死組織屏障的形成相關(guān):在早期急性炎癥性損傷后，SAP患者的胰腺炎癥不會(huì)停止在穩(wěn)定階段。相反，會(huì)引起局部并發(fā)癥，例如胰腺壞死、胰腺假性囊腫的形成。NETs在壞死胰腺組織、胰腺假性囊腫中的存在，表明NETs參與了這些結(jié)構(gòu)的形成。由于NETs促進(jìn)滲出液中蛋白質(zhì)的聚集，形成將炎性物質(zhì)限制在一個(gè)部位的屏障，從而減少了對(duì)周圍組織的損害。細(xì)胞外DNA和染色質(zhì)相關(guān)蛋白有助于凝結(jié)并增強(qiáng)在NETs表面形成的纖維蛋白凝塊。通過(guò)緩慢遷移和增殖成纖維細(xì)胞，該屏障最終可以轉(zhuǎn)化為纖維化組織[16]。

四、NETs對(duì)SAP患者身體其他器官造成的損傷

SAP的特征是胰蛋白酶原異常激活后全身炎癥的級(jí)聯(lián)激活。故而中性粒細(xì)胞可能發(fā)生趨化性并遷移到身體各種組織以形成NETs。SAP的許多致命并發(fā)癥，已顯示與NETs的形成密切相關(guān)。因此，在SAP患者體內(nèi)，NETs不僅存在于胰腺組織中并對(duì)其造成傷害，而且還會(huì)對(duì)其他相關(guān)器官造成更嚴(yán)重的損害。

1.肺部損傷：在SAP患者體內(nèi)，NETs中的DNA纖維網(wǎng)在肺細(xì)小支氣管中起支架作用，并與痰液結(jié)合形成痰液螺栓，由NE誘導(dǎo)的氣道上皮產(chǎn)生過(guò)多的黏蛋白與痰液螺栓形成的復(fù)合物阻塞微小支氣管，為細(xì)菌的生長(zhǎng)和定殖創(chuàng)造了合適的環(huán)境，最終引起急性肺損傷。SAP會(huì)導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞過(guò)度激活，過(guò)度活化的嗜中性粒細(xì)胞可能導(dǎo)致多器官功能不全綜合征的發(fā)展，而肺部是該綜合征的主要靶點(diǎn)?；罨闹行粤＜?xì)胞釋放NE、ROS和其他促炎性介質(zhì)，進(jìn)一步激活NETs的形成，從而導(dǎo)致肺損傷[17]。MPO誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞中的DNA鏈斷裂，從而破壞肺泡正常氣體交換，引起急性肺損傷。

2.腎臟損傷：NETs的形成與DAMP相關(guān)，DAMP在多種疾病模型中引發(fā)炎性反應(yīng)。此外，在人類和實(shí)驗(yàn)性胰腺炎中，多種DAMP被視為與胰腺炎相關(guān)的“危險(xiǎn)信號(hào)”，例如高遷移率族1號(hào)盒(HMGB1)已顯示對(duì)實(shí)驗(yàn)性SAP具有重要作用,并可能在SAP后參與腎臟損傷[18]。中和HMGB1可顯著改善SAP病程及腎臟損傷。研究表明，NETs的形成受NF-κB通路的調(diào)節(jié)。在SAP小鼠體內(nèi)，丁酸鈉通過(guò)抑制NF-κB通路和調(diào)節(jié)HMGB1來(lái)減輕SAP小鼠的器官損傷[19]。Shi等[20]認(rèn)為富含氫的鹽水通過(guò)抑制活性氧(ROS)和NF-κB途徑對(duì)?；悄懰徕c誘導(dǎo)的SAP的腎臟損傷起到保護(hù)作用。

3.心臟損傷:當(dāng)SAP中的胰蛋白酶進(jìn)入心臟血液中，NETs可強(qiáng)化胰蛋白酶的活性，損傷心肌細(xì)胞。在SAP早期，調(diào)節(jié)NETs的 NF-κB過(guò)度活化，激活單核-吞噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞系統(tǒng)，釋放大量炎性因子，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮的損傷,SAP時(shí)活化的中性粒細(xì)胞釋放微粒小泡，里面含有調(diào)節(jié)NETs形成的MPO,MPO可催化產(chǎn)生大量的ROS, 也可以破壞冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。經(jīng)過(guò)NETs進(jìn)一步激活的胰蛋白酶致使SAP患者血液處于高凝狀態(tài)，將血小板活化，活化后的血小板與NETs結(jié)合凝集成血栓，堵塞血管[21]。研究表明，冠狀動(dòng)脈中與NETs相關(guān)的血栓經(jīng)常引發(fā)心肌梗死，在SAP患者中已觀察到[22]。在SAP患者體內(nèi)，受損的血管內(nèi)皮上浸潤(rùn)的T輔助細(xì)胞在NETs的作用下進(jìn)一步激活，加重炎癥浸潤(rùn)，增加了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脫落的風(fēng)險(xiǎn)[23]。

4.腸黏膜屏障功能異常：腸屏障功能異常在SAP的病理生理中起著關(guān)鍵作用，受損的腸屏障可能成為其他并發(fā)癥的源頭，包括SIRS和MODS，這進(jìn)一步加劇了SAP。越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明NF-κB和NLRP3促進(jìn)炎性反應(yīng)，而NF-κB/ NLRP3炎性體途徑的激活是通過(guò)NETs介導(dǎo)的，進(jìn)一步引發(fā)炎性細(xì)胞因子的釋放[24]。Yang等[25]研究認(rèn)為蟲(chóng)草素通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB和NLRP3炎性體的活化，抑制NTEs的活性，從而減緩SAP的癥狀，同時(shí)抑制促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生。SAP可使腸黏膜通透性增加，壞死腺泡細(xì)胞釋放的大量HMGB1可影響腸黏膜的物理屏障功能。研究表明，在SAP患者的腸道中，NETs破壞腸的微生態(tài)平衡，從而導(dǎo)致腸屏障受損，腸黏膜通透性增加，內(nèi)毒素產(chǎn)生增加以及腸菌群失衡。

五、展 望

NETs自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)就引起了科學(xué)界的極大興趣，研究人員進(jìn)行了大量研究以檢查其結(jié)構(gòu)、功能和形成機(jī)制。在確認(rèn)這些結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)大的抗菌功能的同時(shí)，多項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)NETs參與了多個(gè)器官中許多非感染性疾病的病理生理過(guò)程，例如急性炎癥性疾病和血栓性疾病等。NETs及其成分在SAP引起的炎性應(yīng)激下對(duì)正常組織的損害以及炎性細(xì)胞的激活引起炎性級(jí)聯(lián)的過(guò)程中起著重要的作用。此外，NETs的形成是由胰液成分或SAP釋放的炎性細(xì)胞因子引起的，它們可能通過(guò)胰腺腺泡損傷或胰管阻塞而誘SAP。因此，NETs和SAP的產(chǎn)生可能形成惡性循環(huán)。針對(duì)這一關(guān)系，對(duì)于NETs與SAP的功能、機(jī)制和關(guān)系以及針對(duì)NETs的干預(yù)措施吸引了眾多研究人員的關(guān)注。今后新的檢測(cè)技術(shù)和藥物的開(kāi)發(fā)將大大加速針對(duì)NETs的SAP患者的臨床治療。