系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型的制備

吳玉娥，李航，陳梅玲，龔寶勇，張鈺，黃韌*

(1.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663;2.廣東藥學(xué)院，廣州 510224)

動(dòng)物模型是研究感染性疾病發(fā)病機(jī)制的主要工具［1，2］。因其可在整體動(dòng)物上模擬病原和宿主(人)間的復(fù)雜作用，并且可以避開倫理問題直接研究病原對(duì)動(dòng)物的組織或因子的作用，動(dòng)物模型具有體外試驗(yàn)不可比擬的優(yōu)勢(shì)。近年來，臨床上侵襲性念珠菌感染的發(fā)病率和死亡率不斷上升，相對(duì)應(yīng)出現(xiàn)了許多真菌感染的動(dòng)物模型研究。根據(jù)不同的研究目的，研究者們通常會(huì)選擇不同的動(dòng)物種類和感染途徑來建立動(dòng)物模型，但目前最為常用的還是靜脈感染小鼠模型［3］。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期進(jìn)行念珠菌感染動(dòng)物模型研究，在系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型建立上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。我們的建模方法穩(wěn)定，具可重復(fù)性，已成功應(yīng)用于念珠菌毒力研究及抗真菌藥物篩選［4］。本文主要從菌株制備、靜脈接種、劑量選擇及模型評(píng)價(jià)等方面對(duì)模型建立的每個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行細(xì)節(jié)描述，希望為其他科研工作者提供參考和幫助。

1 材料與方法

1.1 菌株

白色念珠菌(C.albicans)SC5314、CaR、CaS、CaDel、CaCoM-A、CaCoM-B 及非白念珠菌(C.parapsilosis)，均為中國(guó)科學(xué)院微生物研究所張立新博士饋贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠

SPF 級(jí)ICR 小鼠，體重22 ～26 g，4 ～6 周齡，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2012-0002】。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在負(fù)壓感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK(粵)2012-0122】，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開展經(jīng)廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所動(dòng)物使用和管理委員會(huì)審批。

1.3 免疫抑制

環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞制藥廠)腹腔注射，1 次/24 h，共注射3 次，注射劑量為100 mg/kg，第4 天進(jìn)行念珠菌接種。

1.4 菌株制備

1.4.1 菌體培養(yǎng)

(1)從－80℃冰箱取出菌液，解凍。使用滅菌接種環(huán)把解凍后的菌液接種到固體YEPD 平板上，30℃培養(yǎng)26h，觀察菌體有無生長(zhǎng)，是否污染。

(2)確定無污染后，從培養(yǎng)皿上挑選單個(gè)菌落用無菌接種環(huán)接種到液體YEPD［2］中，30℃搖床培養(yǎng)16 h，200 r/min。

(3)觀察液體YEPD 渾濁度，渾濁為接種成功。

(4)菌落形態(tài)觀察:取1 滴乳酚甲苯胺藍(lán)染色液加入1 滴菌液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡鏡檢。

1.4.2 分裝保存

(1)在超凈工作臺(tái)上將接菌成功的液體YEPD倒入已滅菌的45 mL 離心管中，離心(3000 r/min，10 min)。

(2)丟棄上層液體，加入適量滅菌生理鹽水，吹打混勻，離心(3000 r/min，10 min)。重復(fù)二次。

(3)丟棄上層液體，加入適量滅菌生理鹽水，吹打混勻。使用20%無菌甘油-生理鹽水配置成一定體積，取100 μL 于包被板中，每個(gè)樣品至少加兩孔。用酶標(biāo)儀測(cè)其A 值，使其A 值達(dá)到0.35 ～0.4［此時(shí)菌液濃度為(3 ～5)×107CFU/mL］，分裝置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 接菌前濃度調(diào)整

于－80℃冰箱內(nèi)取出備用菌液，解凍后置于36℃培養(yǎng)箱中復(fù)蘇1 h，按照預(yù)計(jì)接菌濃度對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋。例如，預(yù)計(jì)接種濃度為(3.0 ～5.0)×105cells/mL，則將菌液稀釋100 倍。留取1 mL 稀釋后的菌液，用于確定實(shí)際接菌濃度。

1.4.4 確定實(shí)際菌液濃度

菌液經(jīng)10 倍梯度稀釋，選擇三個(gè)稀釋度的菌液，分別取0.2 mL 加入固體無菌YEPD 培養(yǎng)基，使用滅菌的玻璃涂棒涂布均勻。30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，計(jì)算菌落數(shù)目，菌落數(shù)在30 ～300 之間的稀釋度有效。按下面公式計(jì)算出菌液的含菌數(shù):每毫升原菌液活菌數(shù)=同一稀釋度三個(gè)重復(fù)平皿菌落平均數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 5。

1.4.5 菌株保存穩(wěn)定性測(cè)試

按照1.4.3 和1.4.4 所述，對(duì)－80℃冰箱保存的菌株(以CaR，CaS，CaDel，CaCoM-A 和CaCoM-B為例)定期取出進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。

1.5 靜脈接種

采用1 mL 注射器，每只小鼠經(jīng)尾靜脈接種酵母型菌進(jìn)行感染。接種當(dāng)天秤量每只小鼠體重，根據(jù)體重確定每只小鼠的接種劑量，常用接種劑量為0.2 mL 菌液/20 g 小鼠。

1.6 模型評(píng)價(jià)指標(biāo)

生存情況:感染動(dòng)物以死亡為評(píng)價(jià)指標(biāo)。接種后，每天觀察小鼠兩次，連續(xù)觀察14 d。當(dāng)發(fā)現(xiàn)下列情況中任何兩項(xiàng)時(shí)，安樂死小鼠，以減少對(duì)其的疼痛和應(yīng)激。①弓背、被毛松亂;②體重下降超過起始體重的20%;③體溫降低，觸之冰冷;④活動(dòng)明顯減少;⑤不能進(jìn)食;⑥斜頸或原地打轉(zhuǎn)。在進(jìn)行生存觀察時(shí)，將安樂死小鼠死亡時(shí)間記錄到下一天。一般采用生存曲線對(duì)感染小鼠的生存情況進(jìn)行描述，采用Log-rank test 統(tǒng)計(jì)方法對(duì)生存曲線進(jìn)行比較分析，P ＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［5］。

靶器官載菌量檢測(cè):在染菌后的第2 天、4 天和6 天，每組至少取3 只小鼠，采集心、肝、脾、肺、腎和腦，稱重后加入1 mL 無菌生理鹽水研磨成勻漿液，進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇適當(dāng)?shù)南♂対舛?，?.2 mL接種于YPD 固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。菌落數(shù)在30 ～300 之間的勻漿液稀釋度有效。計(jì)算組織的載菌量log CFU/g。CFU/g=3 個(gè)培養(yǎng)基的CFU 的平均數(shù)×5×勻漿液體積(mL)× 稀釋倍數(shù) ÷ 組織重量(g)

病理組織學(xué)檢測(cè):取小鼠主要靶器官心、肝、脾、肺、腎和腦，中性福爾馬林溶液固定后，進(jìn)行常規(guī)病理切片，行HE 和PAS 染色。

2 結(jié)果

2.1 菌體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

以CP 菌為例，從－80℃冰箱取出的菌種經(jīng)培養(yǎng)，鏡檢顯示，CP 菌的形態(tài)處于酵母型，未見假菌絲的出現(xiàn)(圖1)。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色鏡檢，顯示90%的菌體為活菌體。

圖1 C.parapsilosis 形態(tài)觀察(酵母型菌體形態(tài))Fig.1 Morphologic observation of the C.parapsilosis (yeast type)

2.2 菌株保存穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

經(jīng)過7 個(gè)月的測(cè)試，CaR、CaS、CaDel、CaCoM-A和CaCoM-B 5 個(gè)菌株的活菌數(shù)一直保持穩(wěn)定狀態(tài)，見圖2 所示。

圖2 菌株保存穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果Fig.2 Results of strains preservation stability test

2.3 免疫抑制結(jié)果

正常小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)約為(7 ～8)×109個(gè)/L，小鼠注射CY 后第1 天開始，外周血白細(xì)胞總數(shù)出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，注射后第4 天降至最低點(diǎn)約1.6 ×109個(gè)/L。第5 天開始小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)開始回升，至注射后第8 ～12 天，基本恢復(fù)到正常水平，見圖1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇免疫抑制后白細(xì)胞計(jì)數(shù)最低點(diǎn)(CY 給藥后第4 天)進(jìn)行念珠菌接種。

2.4 生存情況

圖3 小鼠接種CY 后外周血白細(xì)胞總數(shù)變化Fig.3 Total leukocyte counts in the cyclophosphamide-treated mice

采用生存曲線對(duì)感染小鼠的生存情況進(jìn)行描述和分析。選擇相同接種劑量(1.0 ×105CFU/mL)，CaR、CaDel，CaCoM-A 和CaCoM-B 四個(gè)菌株引起小鼠死亡情況相近，中位生存間分別是7、8、7 d 和6 d。采用log-rank test 統(tǒng)計(jì)方法對(duì)生存曲線進(jìn)行比較分析，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果說明在相同接種劑量下，4 個(gè)菌株對(duì)小鼠的毒力無差異。見圖4所示。

圖4 小鼠接種CaR、CaDel、CaCOM-A 和CaCOMB 四個(gè)菌株后的生存情況Fig.4 Survival curves of the mice after inoculation of CaR，CaDel，CaCOM-A and CaCOM-B strain Candida

2.5 組織載菌量

在系統(tǒng)性真菌感染小鼠模型，腎臟是真菌感染的主要靶器官。以SC5314 為例，接種劑量為1.0 ×104CFU/mL，小鼠感染后第2 ～4 天組織載菌量達(dá)高峰，以腎臟載菌量最高，可達(dá)到106～108CFU/g，其他臟器如肝臟、腦、脾臟和肺臟等組織載菌量一般在104CFU/g，隨著感染時(shí)間延后，各組織載菌量逐漸下降，見圖5 所示。

2.6 組織病理變化

圖5 小鼠接種SC5314 后各臟器組織載菌量變化Fig.5 Dynamic changes of tissue fungal burdens after SC5314 inoculation in the mice

病理組織學(xué)觀察顯示以腎臟為靶器官，多器官?gòu)浬⑿哉婢腥镜牡湫筒±斫M織學(xué)改變。除腎臟外，心臟、腦、肺、肝和脾亦可見真菌浸潤(rùn)病灶，見圖6 所示。

3 討論

念珠菌形態(tài)學(xué)上的雙向性與其毒力密切相關(guān)。在念珠菌彌散性感染小鼠模型建立過程中，菌體形態(tài)是重要的質(zhì)控要素。白色念珠菌和近平滑念珠菌(C.parapsilosis)均屬于雙向型真菌，在不同營(yíng)養(yǎng)因素、化學(xué)因素或其他物理因素的作用下，可以由一種形態(tài)(酵母相)轉(zhuǎn)變成另一種形態(tài)(菌絲相)，當(dāng)念珠菌從酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相后，其毒力明顯增強(qiáng)［6］。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予免疫抑制小鼠接種1.0×106個(gè)/mL 菌絲型C.parapsilosis 菌，可造成小鼠48 h 內(nèi)全部死亡;當(dāng)給予免疫抑制小鼠接種相同劑量的酵母型菌，則小鼠全部死亡時(shí)間推遲為8 天。菌絲型菌毒力明顯增強(qiáng)，能使動(dòng)物快速死亡，不適合建立動(dòng)物模型。因此，嚴(yán)格進(jìn)行菌體培養(yǎng)條件的質(zhì)控，使注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的菌體為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母型菌，是模型成功的關(guān)鍵。

真菌感染的發(fā)生是病原體、宿主及環(huán)境間相互作用的結(jié)果，念珠菌侵入人體后是否發(fā)病不僅取決于病原體的數(shù)量、毒力及入侵途徑，也取決于宿主自身的免疫防御能力及各種外界因素的綜合影響。臨床上彌散性念珠菌病患者均處于不同程度的免疫缺陷狀態(tài)［7，8］。因此，為了模擬臨床致病條件，在念珠菌彌散性感染小鼠模型的建立過程中首先要實(shí)現(xiàn)小鼠的免疫抑制。實(shí)驗(yàn)用形成免疫抑制的方法有多種，主要有抗腫瘤藥阿糖胞苷，免疫抑制劑及激素可的松等。我們采用給小鼠注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(CY)，這種免疫抑制方式表現(xiàn)為白細(xì)胞數(shù)量下降，特別是嗜中性粒細(xì)胞的下降，不僅有利于念珠菌入侵感染，還有效地模擬了臨床上較多見的嗜中性粒細(xì)胞下降引起的彌散性真菌病的病例。

圖6 小鼠接種C.parapsilosis 后組織器官病理改變Fig.6 Histological changes in the organs of mice infected with C.parapsilosis

菌株制備過程的質(zhì)量控制是影響模型穩(wěn)定性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。只有保證每批次實(shí)驗(yàn)小鼠接種的菌液濃度一致，才能保證模型的可重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)室采用一次性制備足夠量的菌液，確定一個(gè)較高的菌液濃度(例如5.0 ×107CFU/mL)后進(jìn)行分裝，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ院竺看螌?shí)驗(yàn)取出1 支菌液，解凍后置于30℃培養(yǎng)箱中復(fù)蘇1 h，按照預(yù)計(jì)接種濃度對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋。這樣就可以保證每批次開展實(shí)驗(yàn)使用相同濃度的菌液。本保存方法經(jīng)過半年的測(cè)試，保存的活菌數(shù)一直保持穩(wěn)定狀態(tài)。

靜脈接種亦是影響模型重復(fù)性和穩(wěn)定性的重要因素之一。真菌菌體較大，具有一定的重量，菌液放置一定時(shí)間后，菌體會(huì)自然下落并在容器下方沉積成叢。因此接菌時(shí)，每次抽取菌液前都要將菌液搖勻(至少10 s)，這樣才能保證每次吸入的菌液濃度一致。通常采用1 mL 注射器，經(jīng)小鼠尾靜脈接種菌液進(jìn)行感染，常用接種劑量為0.2 mL。當(dāng)小鼠體重相差較大時(shí)，需要根據(jù)體重確定每只小鼠的接種劑量。靜脈注射前可采用光照或涂擦酒精的方法使小鼠尾部血管擴(kuò)張，以方便進(jìn)針，注射完成后，按壓注射位點(diǎn)約30 s，防止菌液倒流。注射時(shí)，如因針頭進(jìn)入位置不當(dāng)，偏離血管，則推注時(shí)阻力較大，并且出現(xiàn)注射部位皮膚變白，此時(shí)應(yīng)立即停止注射，拔出針頭，重新調(diào)整注射位置注射，一定要確保菌液完全接種入靜脈。

系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型建立過程中，除了需要考慮上述影響因素外，還要考慮感染菌株的致病性。具體實(shí)驗(yàn)中，由于選擇的念珠菌種類不同，毒力不同，注射的菌量也不同。例如同樣是利用念珠菌進(jìn)行毒力研究，選擇白色念珠菌CaR 和近平滑念珠菌CP 分別接種小鼠，要求接種后2 周內(nèi)小鼠死亡率達(dá)90%以上，則兩個(gè)菌株的實(shí)際接種劑量分別為1 ×105CFU/mL 和4.5 ×105CFU/mL，兩者相比較，CP 菌的毒力較低，達(dá)到相同實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枰慕臃N劑量要高。而感染菌株為SC5314 時(shí)，1 × 105CFU/mL 接菌劑量可使小鼠在接種后5 d 內(nèi)全部死亡。因此，針對(duì)不同菌株我們都需要預(yù)先摸索不同接種劑量對(duì)動(dòng)物的影響，并根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇合適的接種劑量。

質(zhì)量控制是決定動(dòng)物模型成功建立的根本所在，忽略任何一個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)影響模型的穩(wěn)定性。本文從免疫抑制、菌株制備、靜脈接種、劑量選擇及模型評(píng)價(jià)等多個(gè)方面對(duì)系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型建立過程進(jìn)行了逐一描述，指出影響模型質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及質(zhì)控方法。系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型主要表現(xiàn)以下特點(diǎn):感染動(dòng)物可出現(xiàn)死亡;靜脈接種后短期內(nèi)腎臟、心臟、腦及肺臟等多個(gè)臟器出現(xiàn)載菌量高峰，隨后下降;病理組織學(xué)顯示腎臟為靶器官，多器官?gòu)浬⑿哉婢愿腥镜牡湫筒±斫M織學(xué)改變。該模型可應(yīng)用于系統(tǒng)性念珠菌感染的致病機(jī)理，免疫防御及抗真菌藥物篩選等研究領(lǐng)域。

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