寄主和棲境揮發(fā)物對花絨寄甲的嗅覺反應(yīng)及GC-MS分析

高　悅，李虹兵，曹　霞，解春霞，巨云為，徐福元

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇　南京　211153;2.南京森林警察學(xué)院，江蘇　南京　210023;3.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇　南京　210037)

寄主和棲境揮發(fā)物對花絨寄甲的嗅覺反應(yīng)及GC-MS分析

高悅1，李虹兵2，曹霞3，解春霞1，巨云為3，徐福元1

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇南京211153;2.南京森林警察學(xué)院，江蘇南京210023;3.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇南京210037)

摘要:在實(shí)驗室條件下，利用四臂嗅覺儀測定了源于3種寄主以及2種寄主棲境健康和蛀道組織的不同質(zhì)量濃度提取液對花絨寄甲的嗅覺反應(yīng)。分別用二氯甲烷和乙醚對3種寄主揮發(fā)性化合物抽提濃縮液進(jìn)行GC-MS分析。結(jié)果表明:松褐天牛揮發(fā)物提取液質(zhì)量濃度為25，50 mg/mL時，花絨寄甲在處理區(qū)的滯留時間顯著高于對照;青楊天牛揮發(fā)物提取液質(zhì)量濃度為25，50 mg/mL時，花絨寄甲在處理區(qū)的滯留時間和進(jìn)入次數(shù)都顯著高于對照;大麥蟲揮發(fā)物提取液質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，花絨寄甲在處理區(qū)的滯留時間和進(jìn)入次數(shù)都顯著高于對照。花絨寄甲對寄主棲境蛀道組織比健康組織的嗅覺反應(yīng)更顯著，花絨寄甲對黑松比對毛白楊寄主棲境的嗅覺反應(yīng)更顯著。3種寄主揮發(fā)性化合物抽提液中含有多種活性成分，在10～40 min的保留時間峰值較集中，活性物質(zhì)的主要成分為C21～C36的直鏈烷烴以及脂肪酸及其衍生物、萜烯類、醇酮類和苯酚類化合物。

關(guān)鍵詞:花絨寄甲;松褐天牛;青楊天牛;大麥蟲;嗅覺反應(yīng);GC-MS

Olfactory response of Dastarcus helophoroides Sharp to the volatiles emitted from hosts，their habitat，and volatile component analysis by GC-MS

GAO Yue1，LI Hong-bing2，CAO Xia3，XIE Chun-xia1，JU Yun-wei3，XU Fu-yuan1

(1.Forestry Academy of Jiangsu，Nanjing 211153，China;2.Nanjing Forest Police College，Nanjing 210023，China; 3.Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China)

Abstract:The olfactory response of Dastarcus helophoroides Sharp to different volatiles from 3 species hosts and 2 species hosts’habitats，both healthy and bored，was measured by using a four-armed olfactometer in the laboratory.By gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)，we analyzed the volatiles from 3 hosts＇extraction with dichloromethane and ether.The results indicated that the retention time of D.helophoroides in the treatment area with 25 or 50 mg/mL volatile from Monochamus alternatus was significantly longer than that in CK;Its retention time and entry number in the treatment area with both 25 and 50 mg/mL volatile from Saperda populnea were significantly more than those in CK，but significantly more than those in CK with only 50 mg/mL volatile from Zophobas morio.Its olfactory response to the hosts’bored habitat was shown preferably，with more inclination to hosts’Pinus thunbergii than Populus tomentosa habitat.GC-MS analysis showed many active components in the volatiles，with main peak values from 10 to 40 min at GC-MS graph，including linear paraffins(C21～C36)，aliphatic acids and their derivatives，terpenes，alcohols，ketones and phenols.

Key words:Dastarcus helophoroides;Monochamus alternatus;Saperda populnea;Zophobas morio;Olfactory response;GC-MS

揮發(fā)性信息化合物是聯(lián)系植物-寄主-天敵3重營養(yǎng)關(guān)系的重要媒體。植物所釋放的揮發(fā)性物質(zhì)在寄主棲境定位中起作用［1］，但其暗示寄主存在的可信性相對較低［2］。寄主自身所釋放的揮發(fā)物是較

為可靠的信息，在寄主定位中起著重要作用［3］。研究揮發(fā)性化合物對昆蟲行為調(diào)控機(jī)理，可以揭示其間的化學(xué)通訊關(guān)系，將天敵昆蟲的行為學(xué)機(jī)理研究引向深入。

花絨寄甲(Dastarcus helophoroides Sharp)是天牛類蛀干昆蟲的主要天敵，目前對花絨寄甲的研究多以防治利用為主，并已大面積成功應(yīng)用于多種林木的生物防治上［4－5］。筆者前期進(jìn)行了花絨寄甲對不同寄主蛹的選擇性和非選擇性試驗，發(fā)現(xiàn)花絨寄甲對寄主的嗜好存在顯著差異［6］，但目前對其寄主搜尋行為以及他感物成分尚無研究。為此，本文研究了源于寄主和寄主棲境不同質(zhì)量濃度提取液對花絨寄甲的嗅覺反應(yīng)，并對寄主揮發(fā)物抽提濃縮液進(jìn)行了GC-MS分析，以探討花絨寄甲對寄主搜尋行為的特點(diǎn)，分析影響其搜尋行為的他感物成分，為更深入研究花絨寄甲與植物、寄主之間的3重營養(yǎng)關(guān)系和花絨寄甲的行為學(xué)機(jī)理研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試?yán)ハx供試的花絨寄甲成蟲由江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院天敵繁育中心提供。供試的松褐天牛(Monochamus alternatus)采自溧陽市天目湖風(fēng)景區(qū)病死的黑松(Pinus thunbergii Parl.)枝條內(nèi);供試的青楊天牛(Saperda populnea)采自山西被蛀毛白楊(Populus tomentosa Carr.)枝條內(nèi);供試大麥蟲(Zophobas morio)購自南京市夫子廟花鳥魚蟲市場。以上各供試?yán)ハx每只單獨(dú)放入指形管中，試驗前在4～6℃冷庫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2嗅覺儀測試用寄主體表揮發(fā)物的抽提參考萬方浩等［7］對寄主揮發(fā)物進(jìn)行抽提。粗提液為松褐天牛、青楊天牛和大麥蟲幼蟲的正己烷提取液(實(shí)驗室收集寄主成蟲，用正己烷在4℃條件下浸泡24 h，冷凝回流并過濾，濾后的成分再加入20 mL正己烷，70℃回流10 h，合并冷提取和回流抽提的濃縮液為粗提液，再將粗提液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上分別濃縮為10，25，50 mg/mL，置于4℃冰箱中保存)，對照為純?nèi)軇?，每個質(zhì)量濃度梯度作為1個處理。

1.1.3嗅覺儀測試用寄主棲境揮發(fā)物的抽提寄主棲境揮發(fā)物的粗提液為松褐天牛幼蟲和青楊天牛幼蟲棲息于黑松和毛白楊的陳蛀屑正己烷提取液，以及未被危害的黑松和毛白楊的健康組織正己烷提取液，提取方法相同，再將粗提液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上分別濃縮為25，50 mg/mL 2個質(zhì)量濃度，對照為純?nèi)軇?，每個質(zhì)量濃度梯度作為1個處理。

參考文獻(xiàn)1.1.4GC-MS測試用寄主體表揮發(fā)物的抽提直接浸提法［7］，將松褐天牛、青楊天牛和大麥蟲幼蟲分別放入250 mL三角瓶中，用200 mL二氯甲烷或200 mL乙醚浸提24 h后過濾，再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，分別得到C1，C2，C3和M1，M2，M3質(zhì)量濃度為50 mg/mL的6種提取液。

1.2方法

1.2.1嗅覺反應(yīng)測定參考白樹雄等［8］的方法并加以改進(jìn)。利用四壁嗅覺儀進(jìn)行花絨寄甲對不同揮發(fā)性粗提液的行為測定。經(jīng)過預(yù)試驗后，確定合適的氣流流量為400 mL/min。試驗時每次引入1頭花絨寄甲，做出選擇的標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)花絨寄甲爬至超過某臂的1/3處，并持續(xù)1 min以上者，就記為該花絨寄甲對該臂的氣味源作出選擇，記錄滯留時間和進(jìn)入次數(shù)(停留5 s以上記作1次)。如該蟲引入3 min仍不做出選擇，則停止觀察。每組測試后，用95%乙醇擦洗內(nèi)、外壁，烘干后調(diào)換位置再測，測試儀置于暗光條件。每處理重復(fù)30次。

1.2.2GC-MS分析參考王勇等［9］的方法，對寄主揮發(fā)物的二氯甲烷、乙醚抽提濃縮液進(jìn)行分析，彈性石英毛細(xì)管柱規(guī)格為25 m×200 μm×0.33 μm。升溫程序:初始溫度50℃，保持1 min，8℃/min升至120℃保留5 min，10℃/min升至220℃保留10 min。氣室溫度為280℃，載氣為氦氣，流速1 mL/min，無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。電離源為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描范圍30～500質(zhì)量單位。揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)GC-MS分析后，所得圖譜利用計算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖譜(NIST98)，并輔以人工識別確定化合物，以質(zhì)譜離子峰面積百分?jǐn)?shù)表示各成分相對含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，用配對法T測驗檢測花絨寄甲在四壁嗅覺儀2對角區(qū)域中是否呈假設(shè)檢驗H0∶μ1=μ2的分布理論，計算相應(yīng)顯著水平。

2　結(jié)果與分析

2.1花絨寄甲對寄主體表揮發(fā)物提取液的嗅覺反應(yīng)

寄主揮發(fā)物提取液對花絨寄甲的嗅覺反應(yīng)結(jié)果顯示(見表1)，不同質(zhì)量濃度的寄主揮發(fā)物提取液

對花絨寄甲的嗅覺反應(yīng)影響明顯不同。25，50 mg/mL的松褐天牛揮發(fā)物提取液對花絨寄甲有明顯的吸引作用，花絨寄甲在處理區(qū)的滯留時間都顯著高于對照區(qū)，并且在25 mg/mL時，花絨寄甲在處理區(qū)的進(jìn)入次數(shù)也明顯高于對照區(qū)。25，50 mg/mL的青楊天牛揮發(fā)物提取液對花絨寄甲都有明顯的吸引作用，花絨寄甲在處理區(qū)的滯留時間和進(jìn)入次數(shù)都顯著高于對照區(qū)。50 mg/mL的大麥蟲揮發(fā)物提取液對花絨寄甲才有明顯的吸引作用，花絨寄甲在處理區(qū)的滯留時間和進(jìn)入次數(shù)都顯著高于對照區(qū)。

表1　花絨寄甲對不同質(zhì)量濃度寄主體表揮發(fā)物的嗅覺反應(yīng)

所以，寄主體表揮發(fā)物提取液對花絨寄甲的滯留時間影響大于對其進(jìn)入次數(shù)的影響;不同寄主揮發(fā)物提取液對花絨寄甲的嗅覺反應(yīng)影響有所不同;同一種寄主不同質(zhì)量濃度體表揮發(fā)物提取液對花絨寄甲的嗅覺反應(yīng)也有影響。

2.2寄主棲境揮發(fā)物提取液對花絨寄甲嗅覺反應(yīng)的影響

寄主棲境不同質(zhì)量濃度揮發(fā)物提取液對花絨寄甲嗅覺反應(yīng)結(jié)果(見表2)顯示，花絨寄甲對黑松和毛白楊蛀道組織的揮發(fā)物提取液的嗅覺反應(yīng)顯著高于對黑松和毛白楊健康組織的揮發(fā)物提取液?；ńq寄甲對黑松健康組織揮發(fā)物50 mg/mL提取液的嗅覺反應(yīng)高于其對25 mg/mL提取液的反應(yīng)，但不顯著。在黑松健康組織揮發(fā)物50 mg/mL提取液時，花絨寄甲在處理區(qū)的進(jìn)入次數(shù)顯著高于對照。質(zhì)量濃度為25，50 mg/mL的黑松蛀道組織揮發(fā)物提取液對花絨寄甲都有明顯的吸引作用，花絨寄甲在處理區(qū)的滯留時間和進(jìn)入次數(shù)顯著高于對照區(qū)?；ńq寄甲對2個質(zhì)量濃度的毛白楊健康組織均無顯著嗅覺反應(yīng)。質(zhì)量濃度為25 mg/mL的毛白楊蛀道組織揮發(fā)物提取液對花絨寄甲有明顯的吸引作用，花絨寄甲在處理區(qū)的滯留時間顯著高于對照區(qū)，而提取液在50 mg/mL質(zhì)量濃度時，花絨寄甲對其嗅覺反應(yīng)不顯著。

表2　花絨寄甲對不同質(zhì)量濃度寄主棲境揮發(fā)物的嗅覺反應(yīng)

花絨寄甲在揮發(fā)物質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，對黑松比毛白楊蛀道組織的嗅覺反應(yīng)影響更顯著。所以，寄主蛀道組織比健康組織對花絨寄甲嗅覺反應(yīng)的影響更大。

2.3寄主體表揮發(fā)物抽提濃縮液的GC-MS分析

對3種寄主揮發(fā)物的二氯甲烷和乙醚的抽提濃縮液進(jìn)行GC-MS分析結(jié)果(見圖1)顯示，提取的濃縮液中含有多種活性組分，主要峰值的保留時間在10～40 min之間。進(jìn)一步的GC-MS鑒定得到，2種提取濃縮液中均分離到C21～C36的直鏈烷烴活性成分，另有其他化合物成分見表3，二氯甲烷提取液成分中主要含有脂肪酸及其衍生物和萜烯類化合物。乙醚提取液成分中除含有脂肪酸及其衍生物和萜烯類，還有醇酮類和苯酚類化合物。2種提取液中提取到相同的組分相對含量大于0.5%的物質(zhì)除了直鏈烷烴，還有辛酸、棕櫚酸、β-蒎烯、反式角鯊烯、油酸等，但各組分在提取液中的相對含量不同。

圖1　寄主揮發(fā)物提取濃縮液的GC-MS掃描圖譜

表3　寄主揮發(fā)物提取濃縮液成分的GC-MS鑒定

3　討論

寄主及其棲境一般由多種生物組成，天敵昆蟲必須借助與寄主有關(guān)的信號進(jìn)行搜索［10］。本試驗通過應(yīng)用四臂嗅覺儀對花絨寄甲的嗅覺反應(yīng)測定，表明寄主及棲境揮發(fā)物在花絨寄甲搜尋寄主過程中起著相當(dāng)重要的作用，花絨寄甲對寄主及棲境揮發(fā)物的趨性可能與揮發(fā)物質(zhì)量濃度有關(guān)，過高或過低的揮發(fā)物質(zhì)量濃度可能對昆蟲的嗅覺反應(yīng)均不顯著［11］。Wei等［12］推測(R)-(+)-檸檬烯可能是花絨寄甲成蟲搜索過程中利它素的重要組成部分。本研究通過GC-MS分析，檢驗出用二氯甲烷或乙醚為提取液時對3種寄主揮發(fā)性化合物的相關(guān)組分，可能使花絨寄甲搜索過程中利它素的研究更為豐富。但驅(qū)使花絨寄甲產(chǎn)生趨性的有效活性物質(zhì)，還應(yīng)采用EAG技術(shù)從已檢測出的活性成分中進(jìn)行觸角電

位生理測定加以佐證。另外，揮發(fā)性化合物有效成分的比例對昆蟲的趨性也有很大影響［13］。雖然花絨寄甲的視覺退化嚴(yán)重，但視覺因素也有可能對昆蟲在定位寄主和交配時產(chǎn)生影響［14］。隨著單細(xì)胞記錄技術(shù)(SCR)［15］和分子生物學(xué)的發(fā)展，筆者認(rèn)為對于花絨寄甲搜索寄主行為和化學(xué)通訊的研究，應(yīng)繼續(xù)從超微結(jié)構(gòu)、電生理反應(yīng)及化學(xué)感受基因［16］等層面進(jìn)行更深入探討。

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作者簡介:高悅(1981－)，男，遼寧鳳城人，回族，助理研究員，在讀博士，研究方向:森林保護(hù)學(xué)。

基金項目:江蘇省林業(yè)三新工程項目“松材線蟲病生物防控技術(shù)集成與示范”“LYSX［2013］20;江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院青年基金項目“花絨寄甲對寄主的搜尋行為及影響因子分析”(JAF-2012-6)

收稿日期:2015-04-04;修回日期:2015-04-09

文章編號:1001－7380(2015) 03－0012－05

中圖分類號:S763.301

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1001－7380.2015.03.003