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      豬SsBHMT基因的原核表達(dá)及條件優(yōu)化

      2015-02-02 01:17:48余愛(ài)麗趙晉鋒張晏萌郭二虎
      生物技術(shù)進(jìn)展 2015年2期
      關(guān)鍵詞:原核載體菌株

      余愛(ài)麗, 趙晉鋒, 張晏萌, 張 正, 郭二虎

      1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所, 山西 長(zhǎng)治 046011;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071001

      BHMT(betaine-homocysteine methyl transferase)基因存在于動(dòng)物和微生物體內(nèi),用于編碼甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,能夠催化甜菜堿的甲基轉(zhuǎn)移到高半胱氨酸上,形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸[1]。甲硫氨酸是合成蛋白質(zhì)的必需氨基酸,是構(gòu)成蛋白質(zhì)的“骨架”氨基酸,甲硫氨酸含量不足將影響其他氨基酸的利用效率,從而影響蛋白質(zhì)的合成[2]。甲硫氨酸是合成腺苷甲硫氨酸(SAM)的底物,SAM是生物體內(nèi)的重要甲基供體。甲基代謝在生物體內(nèi)具有十分重要的意義,很多生物大分子的合成代謝需要甲基的供給,多個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控需要甲基參與[3,4],如:蛋白質(zhì)、脂類的代謝,DNA、RNA的甲基化等。為此本研究在克隆了豬BHMT基因和構(gòu)建其原核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上, 對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)分析和表達(dá)條件的優(yōu)化, 為進(jìn)一步目的蛋白的純化和表達(dá)研究提供素材。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 pET30a-SsBHMT原核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。大腸桿菌(Esherichiacoli)菌株ER2566、BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。

      1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品 蛋白Marker、SDS、丙烯酰胺、胰蛋白胨、酵母提取物等化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工生物工程公司;IPTG購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;Ni-NTA Resin購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

      1.2 方法

      1.2.1外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 菌種的活化: 取實(shí)驗(yàn)室保存的菌株,在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上“之”字劃線,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。自平板挑取單菌落,轉(zhuǎn)接于含卡那的液體培養(yǎng)基中,200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

      取樣: 取培養(yǎng)過(guò)夜的菌液,按照1∶100比例轉(zhuǎn)接于含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min培養(yǎng)2~3 h,當(dāng)其OD值達(dá)0.6~0.8時(shí),取2 mL菌液作對(duì)照,記作0 h;剩余菌液分別加入IPTG至終濃度0.4 mmol/L,37℃,200 r/min繼續(xù)培養(yǎng),誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h、10 h,各取2 mL,12 000 r/min離心1 min,去其上清,保存于-20℃。

      樣品制備: 取所收集菌體,分別加入100 μL 10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0),2% β-巰基乙醇2 μL,重懸細(xì)胞沉淀;冰浴條件下,超聲處理10 min,4℃,12 000 r/min離心15 min,分別取上清和沉淀物。沉淀中加入100 μL 10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0),2%β-巰基乙醇2 μL,重懸細(xì)胞沉淀。

      分析:SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白。

      1.2.2誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化 不同菌株的篩選:將重組載體分別導(dǎo)入菌株ER2566、BL21進(jìn)行表達(dá)分析,具體方法同1.2.1。

      目的蛋白表達(dá)量最多的株系的篩選:從平板上挑取8個(gè)單菌落,IPTG濃度為0.4 mmol/L,進(jìn)行篩選,具體方法同1.2.1。

      IPTG濃度的優(yōu)化:取篩選得到的目的蛋白表達(dá)量最多的菌株,分別加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L和1.0 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo),具體方法同1.2.1。

      IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化:取篩選得到的目的蛋白表達(dá)量最多的菌株,在IPTG誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h和10 h取樣,具體方法同1.2.1。

      超聲時(shí)間的優(yōu)化:設(shè)定冰浴超聲處理時(shí)間分別為5 min、10 min、15 min和20 min,方法同1.2.1。

      1.2.3目的蛋白的純化 經(jīng)優(yōu)化條件誘導(dǎo)后,離心收集菌體,加入裂解液,超聲破碎,離心收集上清沉淀,沉淀用8 mol/L尿素溶解后,用Ni2+親和柱純化(參照說(shuō)明書(shū)),SDS-PAGE 鑒定。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

      含有外源基因菌株ER2566(pET30a-SsBHMT)和不含外源基因菌株ER2566(pET30a)在37℃,經(jīng)過(guò)IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h和10 h后,SDS-PAGE分析見(jiàn)圖1和圖2,結(jié)果表明:沉淀和上清中,在蛋白Marker的45 kDa與66 kDa的條帶之間有一條明顯的條帶,與預(yù)測(cè)目的蛋白條帶的分子量(約為51 kDa)相吻合;沉淀中的目的蛋白的表達(dá)量明顯高于上清;目的蛋白以可溶性蛋白和包涵體兩種形式表達(dá),但主要以包涵體的形式存在。

      2.2 不同菌株對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

      將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET30a-SsBHMT分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)和ER2566菌株,分析結(jié)果如圖3,目的蛋白在ER2566中明顯表達(dá),且在沉淀中的表達(dá)量明顯高于上清液中的表達(dá)量。但目的蛋白在BL21中不表達(dá)或表達(dá)不明顯,說(shuō)明不同菌株也影響目的蛋白的表達(dá)。

      圖1 目的蛋白在沉淀中的表達(dá)分析Fig.1 Analysis of target protein expression in precipitation.1.ER2566(pET30a)誘導(dǎo)6 h; 2.蛋白Marker; 3~8.ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h.

      圖2 上清中目的蛋白的表達(dá)分析Fig.2 Analysis of target protein expression in supernatant.1.ER2566(pET30a)誘導(dǎo)6 h; 2.蛋白Marker; 3~8.ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h.

      圖3 SsBHMT在大腸桿菌BL21(DE3)和ER2566菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of SsBHMT protein in E.coli BL21(DE3)and ER2566.M.蛋白Marker;1.ER2566(pET30a-SsBHMT)沉淀;2.ER2566(pET30a-SsBHMT)上清;3.ER2566(pET30a-SsBHMT)未誘導(dǎo);4.ER2566(pET30a)沉淀;5.ER2566(pET30a)上清;6.BL21(pET30a-SsBHMT)沉淀;7.BL21(pET30a-SsBHMT)上清

      2.3 同一菌株不同株系對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

      從平板上隨機(jī)挑8個(gè)單菌落,IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)誘導(dǎo)2 h以后,分析結(jié)果表明:4號(hào)菌株在沉淀中目的蛋白表達(dá)量最多(圖4);上清中除5號(hào)菌外,2、4號(hào)菌表達(dá)量略低,其余目的蛋白表達(dá)量接近(圖5)。

      2.4 IPTG濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

      沉淀中目的蛋白表達(dá)量最多的菌株,不同濃度的IPTG(0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1.0 mmol/L)誘導(dǎo)2 h,分析結(jié)果表明:在未加IPTG時(shí),沒(méi)有目的蛋白的表達(dá);在IPTG濃度為0.3 mmol/L時(shí),目的蛋白表達(dá);在IPTG濃度為0.4 mmol/L時(shí),目的蛋白的表達(dá)量微量上調(diào),之后隨IPTG濃度的增大,目的蛋白的表達(dá)量減少(圖6)。所以0.4 mmol/L為此菌株的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

      圖4 篩選在沉淀中表達(dá)最優(yōu)的菌株Fig.4 Screening optimal bacteria expressed in precipitation.M:蛋白Marker;1~8:從平板上挑的8個(gè)單菌落

      圖5 篩選在上清中表達(dá)最優(yōu)的菌株Fig.5 Screening optimal bacteria expressed in supernatant.M:蛋白Marker; 1~8:從平板上挑的8個(gè)單菌落

      圖6 不同IPTG濃度對(duì)目的蛋白在沉淀中表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of IPTG concentration on the recombinant protein expressed in precipitation.M:蛋白Marker;1~9. IPTG濃度分別為0 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1.0 mmol/L

      2.5 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

      沉淀中目的蛋白表達(dá)量最大的菌株,加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L,經(jīng)過(guò)不同時(shí)間誘導(dǎo)后,結(jié)果表明:沉淀中,IPTG誘導(dǎo)2 h時(shí),目的蛋白開(kāi)始表達(dá);并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)量明顯增加;IPTG誘導(dǎo)10 h時(shí),目的蛋白的表達(dá)量最大(圖7)。上清中目的蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間變化無(wú)明顯變化(圖8)。

      圖7 不同IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白在沉淀中表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of induction time on the target protein expression in precipitation.1.ER2566(pET30a)誘導(dǎo)6 h; 2.蛋白Marker; 3~8. ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h

      圖8 不同IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白在上清中表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of induction time on the target protein expression in supernatant.1.ER2566(pET30a)誘導(dǎo)6 h;2.蛋白Marker;3~8.ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h.

      2.6 超聲時(shí)間對(duì)目的蛋白提取量的影響

      沉淀中目的蛋白表達(dá)量最多的菌株,0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h后,經(jīng)不同的冰浴超聲破碎時(shí)間5 min、10 min、15 min、20 min破碎,結(jié)果見(jiàn)圖9,超聲5 min時(shí),沉淀中目的蛋白提取量略大;上清中目的蛋白表達(dá)量變化不明顯(圖10)。

      圖9 不同超聲時(shí)間對(duì)目的蛋白在沉淀中提取量的影響Fig.9 Effects of different ultrasonic time on the target protein extraction in precipitation.1.ER2566(pET30a)對(duì)照;2~5.超聲5 min、10 min、15 min、20 min;M.蛋白Marker

      圖10 不同超聲時(shí)間對(duì)目的蛋白在上清中提取量的影響Fig.10 Effects of different ultrasonic time on the target protein extraction in supernatant.M.蛋白Marker; 1.ER2566(pET30a)對(duì)照; 2~5.超聲5 min、10 min、15 min、20 min

      2.7 目的蛋白的純化

      上清和沉淀的純化結(jié)果如圖11所示,沉淀純化結(jié)果明顯,在45~66 kDa之間有一條帶,無(wú)雜蛋白,但上清純化無(wú)結(jié)果。

      圖11 SsBHMT蛋白的純化Fig.11 Purification of SsBHMT protein.1.ER2566(pET30a-SsBHMT)沉淀純化;2.ER2566(pET30a-SsBHMT)沉淀;3.蛋白Marker; 4.ER2566(pET30a-SsBHMT)上清;5.ER2566(pET30a-SsBHMT)上清純化

      3 討論

      原核細(xì)胞表達(dá)體系是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng),它具有真核表達(dá)體系無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn),成本低廉、外源基因表達(dá)量大等[5]。原核表達(dá)載體系統(tǒng)pET功能非常強(qiáng)大,可通過(guò)目的蛋白的特點(diǎn)、IPTG濃度的調(diào)節(jié)等方法來(lái)調(diào)控目的蛋白的表達(dá)水平,通過(guò)載體上的His-Tag標(biāo)簽純化蛋白,特別適用于那些以包涵體形式表達(dá)的蛋白,使蛋白純化過(guò)程變得簡(jiǎn)單高效。為此本研究中選用pET載體對(duì)外源基因BHMT進(jìn)行表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)BHMT基因在原核細(xì)胞BL21(DE3)中不表達(dá)或表達(dá)不明顯,在ER2566中主要以包涵體的形式表達(dá),而且在不同ER2566(pET30a-SsBHMT)株系中表達(dá)量不同。前期實(shí)驗(yàn)28℃和37℃兩個(gè)誘導(dǎo)溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,溫度對(duì)目的蛋白的表達(dá)差異不大(未列出),于是進(jìn)行了IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化,結(jié)果表明篩選到的沉淀中目的蛋白表達(dá)量最多的菌株,在37℃,IPTG濃度為0.4 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間為10 h時(shí),沉淀中的表達(dá)量最多,但仍主要以包涵體的形式表達(dá),分析其原因可能與菌株有關(guān)[6],也可能與pH、溫度[7~9]、真核生物密碼子偏愛(ài)性及氨基酸的組成等有關(guān)[10]。本研究結(jié)果與已有研究結(jié)果一致,表明不同重組載體的最佳表達(dá)條件不同,不同重組載體在同一菌株的最適條件也不相同,每種重組載體的最適表達(dá)條件都需要進(jìn)行特定的優(yōu)化[11~15],如黑山羊基因MSTN[BL21-pET-32a(+)-MSTN69]的最優(yōu)表達(dá)條件為31℃,IPTG 0.8 mmol/L誘導(dǎo)5 h[12]; 番茄谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因ShGSTU1在大腸桿菌BL21(pET28a)中的最佳表達(dá)條件為37℃,1 mmol/LIPTG誘導(dǎo)4 h;在BL21(pET32a)中最佳表達(dá)條件為30℃,1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h[15]。另外對(duì)不同超聲破碎時(shí)間分析發(fā)現(xiàn),超聲時(shí)間對(duì)目的蛋白的純化影響不大。本研究?jī)?yōu)化了目的基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的條件,使得目的基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)量明顯增加,為進(jìn)一步純化目的蛋白、制備抗體奠定了基礎(chǔ)。

      [1] Garrow T A. Purification, kinetic properties, and cDNA cloning of mammalian Betaine homocysteine methyl-transterase[J]. J. Biol. Chem., 1996, 271: 22831-22838.

      [2] 麻益良,何瑞國(guó).飼料添加劑蛋氨酸在養(yǎng)禽業(yè)中的應(yīng)用[J].山東家禽,1999,2:25-28

      [3] Amir R. Current understanding of the factors regulating methionine content in vegetative tissues of higher plants[J]. Amino Acids, 2010, 39:917-931

      [4] 蘇 玉, 王 溪, 朱衛(wèi)國(guó).DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)調(diào)控及主要生物學(xué)功能[J].遺傳,2009,31(11): 1087-1093

      [5] Sambrook J,F(xiàn)ritsch E F,Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual[M](3rdeds). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2002,934

      [6] 張秀香,袁子國(guó),李景文,等.LTB-MOMP融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在原核細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2008,21(6):449-451,456.

      [7] 葉 姣,陳長(zhǎng)華,夏 杰,等.溫度對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)及外源蛋白表達(dá)的影響[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2002,28(2):364-367.

      [8] Donovan R S, Robinson C W, Glick B R. Review:optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac promoter[J]. J. Ind. Microbiol., 1996,16(3):145-154.

      [9] Carte R P, Kelley R F, Rodrigues M L,etal.. High levelEscherichiacoliexpression and production of a bivalent humanized antibody fragment [J]. Biotechnology , 1992,10:163-167.

      [10] Peter E V.E.coliGene Expression Protocols [M]. Totowa, New Jersey: Humana Press Inc., 2003,335-338.

      [11] 張雪利,魯義善,謝吉國(guó),等. 紅笛鯛重組激活基因rag1原核表達(dá)條件的優(yōu)化及純化[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(1):11-16.

      [12] 石照應(yīng),曲月秀,陳 蓉,等.貴州黑山羊MSTN基因原核表達(dá)條件優(yōu)化及蛋白純化[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,25(6):2343-2346.

      [13] 呂 彤,劉 揚(yáng),趙 青,等. 烯酮還原酶基因的克隆與優(yōu)化表達(dá)[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2011,17(1): 87-90.

      [14] 孫 濤,申 寧,白 羽,等. 海棲熱袍菌極耐高溫木聚糖酶基因xynB64在大腸桿菌中的融合表達(dá)[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2011,38(7):1090-1097.

      [15] 裴冬麗,張紅巖,李 萌,等.番茄抗白粉病必需基因ShGSTU1原核表達(dá)條件優(yōu)化[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014,44(2):202-207.

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