基于高通量測序的宏基因組學(xué)技術(shù)在動(dòng)物胃腸道微生物方面的研究進(jìn)展

吳 森, 張鶯鶯, 昝林森,2*

1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 陜西 楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心, 陜西 楊凌 712100

植物是自然界中普遍存在的重要可再生資源，且存量巨大，但大多數(shù)是人類不能直接利用的。草食性動(dòng)物及雜食性動(dòng)物具有其他動(dòng)物所沒有的能力——消化植物纖維，將植物纖維轉(zhuǎn)化為肉、蛋、奶等產(chǎn)品供人類利用。這種轉(zhuǎn)化作用主要為草食性動(dòng)物胃及腸道寄生微生物對(duì)植物細(xì)胞壁中復(fù)雜碳水化合物的降解作用，包括對(duì)木聚糖、果膠、纖維素等的降解作用。揭示動(dòng)物胃腸道中主要微生物的作用機(jī)理，對(duì)人工干預(yù)和提高植物源性資源向動(dòng)物產(chǎn)品轉(zhuǎn)化的效率，促進(jìn)動(dòng)物科學(xué)精準(zhǔn)飼養(yǎng)，以及植物源性材料的人工發(fā)酵等具有重要意義。

隨著技術(shù)的發(fā)展，基于高通量測序技術(shù)的宏基因組技術(shù)，通過提取特定環(huán)境中的微生物總DNA、構(gòu)建文庫，可以獲得大量微生物群落種類、豐度及相關(guān)生物學(xué)信息。相對(duì)于傳統(tǒng)微生物研究方法的分離、培養(yǎng)，更能獲得大量的不可培養(yǎng)的微生物信息，是目前研究特定環(huán)境微生物的重要技術(shù)手段。本文綜述了常見Roche 454、Illumina基因分析和ABI SOLiD測序三大高通量測序平臺(tái)的宏基因組技術(shù)在動(dòng)物胃腸道微生物的研究應(yīng)用進(jìn)展，旨在為動(dòng)物科學(xué)生產(chǎn)及微生物發(fā)酵等相關(guān)領(lǐng)域的研究工作提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 基于高通量測序的宏基因?qū)W技術(shù)在反芻動(dòng)物胃部微生物方面的應(yīng)用研究

大多數(shù)哺乳動(dòng)物缺乏消化植物細(xì)胞壁(纖維素、半纖維素、果膠、β-葡聚糖、低聚糖和木質(zhì)素等)的酶，而反芻動(dòng)物等草食動(dòng)物可通過瘤胃降解消化植物，利用在瘤胃中微生物的厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，以獲得所需的大部分營養(yǎng)，約是動(dòng)物所需營養(yǎng)的60%～80%，其余20%左右的能量在大腸部位消化吸收[1]。由于胃腸道微生物種類繁多、豐度不一、作用多樣，常規(guī)分離提取培養(yǎng)等方法難以全面了解這些微生物發(fā)酵的分子機(jī)理。隨著現(xiàn)代DNA、RNA測序技術(shù)和生物學(xué)信息分析技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代宏基因組學(xué)為人們研究反芻動(dòng)物胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)功能提供了新的思路與方法。

1.1 甲烷排放相關(guān)研究

牛、羊等反芻動(dòng)物的瘤胃是一個(gè)巨大的微生物資源庫，擁有豐富的菌種。主要有細(xì)菌、古菌、原蟲和真菌，是迄今為止已知的分解纖維物質(zhì)能力最強(qiáng)的天然發(fā)酵罐，可在厭氧條件下將纖維、果膠、淀粉和蛋白質(zhì)等降解為短鏈脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)供機(jī)體吸收。瘤胃中的真菌對(duì)發(fā)酵作用影響顯著，相對(duì)于纖維素，其能更有效地降解木質(zhì)素[2]。反芻動(dòng)物瘤胃中含量較少的古菌主要是甲烷菌屬，且甲烷產(chǎn)量可以作為衡量瘤胃對(duì)日糧利用效率的重要指標(biāo)[3]。但是，甲烷氣體是引起溫室效應(yīng)的主要因素之一，畜牧業(yè)中的甲烷排放對(duì)引起全球變暖的溫室效應(yīng)有著不可推卸的責(zé)任。畜牧生產(chǎn)中甲烷氣體主要是植物在反芻動(dòng)物瘤胃的厭氧環(huán)境下由甲烷菌屬的相關(guān)產(chǎn)甲烷菌發(fā)酵后產(chǎn)生的[4]。由于產(chǎn)甲烷菌群落組成復(fù)雜，難以完全鑒定，特別是在動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境中[5]。傳統(tǒng)檢測反芻動(dòng)物胃腸的甲烷菌是通過針對(duì)已知的甲基輔酶M還原酶a亞基(methyl coenzyme-M reductase A，mcrA)或SSU(small-subunit)rRNA數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物，qPCR擴(kuò)增檢測特定類群微生物數(shù)量；或者用一些化學(xué)標(biāo)記物檢測產(chǎn)甲烷菌代謝附屬物，來分析產(chǎn)甲烷古菌的代謝情況[6]。但因?yàn)閿?shù)據(jù)庫更新慢、引物特異性低和代謝附屬物易受體內(nèi)其他條件影響等因素，造成檢測精度低、獲得的信息量少。例如，Tymensen[7]用5種常用SSU rRNA引物擴(kuò)增檢測黑安格斯牛瘤胃液中的古菌，結(jié)果之間有一些偏差。但高通量測序技術(shù)以其高輸出量和高解析度的優(yōu)點(diǎn)，可更加全面的檢測反芻動(dòng)物瘤胃復(fù)雜微生物環(huán)境中古菌的生物學(xué)信息。Snelling等[8]運(yùn)用傳統(tǒng)Sanger 16S rRNA基因擴(kuò)增及Illumina平臺(tái)高通量16S rRNA基因測序，分析了蘇格蘭高地綿羊瘤胃中產(chǎn)甲烷的甲烷短桿菌、甲烷桿菌及甲烷球菌，對(duì)比測序結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)Illumina平臺(tái)高通量的V6-V8 16S rRNA基因測序能更高效用于檢測瘤胃古菌群落的研究。

1.2 植物降解相關(guān)研究

瘤胃對(duì)植物的降解作用，主要是瘤胃中原蟲、真菌及細(xì)菌微生物發(fā)酵產(chǎn)生可降解植物的相關(guān)酶類。傳統(tǒng)研究反芻動(dòng)物瘤胃微生物對(duì)植物降解作用的方法，需要對(duì)瘤胃內(nèi)容物提取、分離后培養(yǎng)鑒定，方法繁瑣，獲得數(shù)據(jù)量少，且有大量不可培養(yǎng)的微生物流失。運(yùn)用高通量測序的宏基因組技術(shù)可獲得大量與植物降解相關(guān)的微生物信息。例如，Singh等[9]對(duì)印度水牛瘤胃中的微生物做高通量測序后，獲得137 270個(gè)contigs(contiguous sequences)。鑒定后有2 614個(gè)具有編碼降解酶功能的contigs，包括聚糖水解酶類(glycoside hydrolases，GH: 1943 contigs)、糖結(jié)合模塊(carbohydrate binding module，CBM: 23 contigs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferase，GT: 373 contigs)、糖類酯酶(carbohydrate esterases，CE: 259 contigs)及多聚糖裂解酶類(polysaccharide lyases，PE: 16 contigs)；Rosewarne等[10]對(duì)飼喂無芒虎尾草的印度閹牛采用瘤胃瘺管法采集瘤胃食糜后，以Roche 454平臺(tái)16S rRNA基因高通量測序，對(duì)瘤胃微生物生物信息分析發(fā)現(xiàn)，有50多個(gè)顯著的多聚糖利用作用位點(diǎn)(sus-like polysaccharide utilization loci，PULs)，且這些位點(diǎn)在草食動(dòng)物中廣泛存在，主要起降解植物的作用；Wang等[11]通過高通量測序?qū)α鑫改举|(zhì)纖維素降解相關(guān)細(xì)菌檢測后，鑒定出了大量木質(zhì)纖維素特異降解性細(xì)菌；Sarubbi等[12]采用基于高通量測序的宏基因組技術(shù)分析了奶牛瘤胃微生物對(duì)高粱、玉米青貯的降解作用，對(duì)關(guān)鍵性纖維素分解微生物及木聚糖分解相關(guān)微生物的豐度、組成測序后，關(guān)聯(lián)日增重與產(chǎn)奶量后發(fā)現(xiàn)瘤胃對(duì)兩者的降解能力相同，無顯著差異，從而得知高粱、玉米青貯可互替代。應(yīng)用高通量測序的宏基因組技術(shù)能夠方便的獲得大量植物降解相關(guān)微生物的生物學(xué)信息，為動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)等提供參考。

1.3 與抗病致病基因篩選相關(guān)的研究

動(dòng)物體內(nèi)微生物與動(dòng)物健康、人類食品安全密切相關(guān)。盡管大部分牛瘤胃腸道微生物都已經(jīng)鑒定出來，但是少有整個(gè)群落基因的功能性研究，特別是關(guān)于抗病、致病性微生物的研究?；诟咄繙y序技術(shù)的宏基因組學(xué)研究，在單方面獲得微生物多樣性信息的同時(shí)，可以從整個(gè)微生物環(huán)境的層面來獲得與抗病、致病相關(guān)的微生物信息。如2012年，Singh等[13]對(duì)印度水牛瘤胃內(nèi)容物進(jìn)行了高通量宏基因組測序分析，在獲得瘤胃微生物多樣性信息的同時(shí)，研究其抗菌素耐藥性及細(xì)菌毒力時(shí)發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果中有6.44%的基因序列為病毒相關(guān)基因，與抗生素抵抗和毒素生成有關(guān)，且這一數(shù)據(jù)高于肉雞盲腸微生物的5.39%和奶牛瘤胃微生物的4.43%；為研究瘤胃微生物與細(xì)菌及抗菌素抗性之間的關(guān)系，Reddy等[14]對(duì)飼喂青、干粗飼料的印度水牛瘤胃液及食糜中的微生物應(yīng)用高通量測序宏基因組技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在門水平，所有組中擬桿菌門和厚壁菌門分別占各組微生物的第一和第二，且瘤胃液、固體食糜中，關(guān)于氧化性應(yīng)激應(yīng)答和抗病性功能基因序列基本相同，但抗氟喹諾酮、多耐藥性外排泵(multiple drug resistance(MDR) efflux pumps)和抗甲氧西林相關(guān)基因的表達(dá)卻交叉分布于11、9、14種細(xì)菌中。另外，細(xì)菌與噬菌體應(yīng)答、包裝及噬菌體原體有關(guān)，鏈球菌噬菌體與擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門細(xì)菌分布有關(guān)。高通量測序的宏基因組技術(shù)不僅可以對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物做出基礎(chǔ)的菌群群落分析，也可相對(duì)定量的做出定性分析。

1.4 日糧組成對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物的影響

瘤胃微生物穩(wěn)態(tài)受多方面的影響，其中不同日糧組成對(duì)瘤胃微生物影響顯著。在日糧組成對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物影響的相關(guān)研究方面，采用基于高通量測序的宏基因組技術(shù)，對(duì)不同日糧處理的反芻動(dòng)物瘤胃樣檢測后，可獲得遠(yuǎn)多于傳統(tǒng)方法的大量微生物的生物學(xué)信息，便于更準(zhǔn)確的分析日糧與瘤胃微生物的關(guān)系。如Pitta等[15]用不同精粗比例的飼料飼喂印度水牛6周后，采集瘤胃食糜、瘤胃液后進(jìn)行高通量測序共獲得333 851 pyrotags。做系統(tǒng)進(jìn)化分析(phylogenetic analysis)后顯示，不同比例粗飼料日糧(50%、75%、100%粗飼料)可引起瘤胃微生物的顯著性差異；不同日糧成分可引起微生物群落組成的不同。在屬水平，日糧的變化會(huì)引起微生物群落組成的顯著差異：在100%粗飼料組中，瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和纖維桿菌屬(Cellulomonas)含量與其他兩組相比顯著增高；在50%粗飼料組中普氏菌屬(Prevotella)含量顯著高于其他組。Patel等[16]以不同青草、干草粗飼料與不同精飼料比例的日糧飼喂水牛，提取瘤胃樣本進(jìn)行高通量宏基因組測序，分析碳水化合物激活酶(carbohydrate active enzymes，CAZymes)，共獲得2 597個(gè)被CAZyme analysis toolkit (CAT)識(shí)別的CAT重疊區(qū)(contigs encoding)；飼喂青草粗飼料的水牛瘤胃中多糖降解細(xì)菌屬(如纖維桿菌屬、普氏菌屬、擬桿菌屬、放線菌屬和瘤胃球菌屬細(xì)菌)豐度顯著高于飼喂干草粗飼料組，且果膠消化酶類(如果膠裂合酶1、膠裂合酶10及多糖降解酶28)顯著高于飼喂干草粗飼料組。相似的，Parmar等[17]對(duì)8頭以青草、干草為粗飼料的水牛瘤胃微生物做高通量宏基因組測序分析后發(fā)現(xiàn)，兩種粗飼料處理水牛瘤胃微生物均是：在門水平上，擬桿菌占主要地位；在屬水平上，普氏菌屬占最多數(shù)。相對(duì)于瘤胃液，固體食糜中厚壁菌門與擬桿菌門微生物比率較高。以干草為粗飼料的牛瘤胃固體食糜中，擬桿菌門數(shù)量隨著粗飼料的增加顯著升高。且在屬水平，隨著粗飼料比例的增加，梭菌(Clostridium)含量顯著增加。另外，對(duì)飼喂青草、干草組的瘤胃液中糖苷水解酶類及碳水化合物激活酶類(cellulosome functional)基因表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中纖維素含量的增加，糖苷水解酶3(GH3)水平升高。Roggenbuck等[18]對(duì)飼喂多葉苜蓿和非洲當(dāng)?shù)責(zé)釒敛莸拈L頸鹿瘤胃液及固體內(nèi)容物進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增及Roche 454平臺(tái)高通量測序后發(fā)現(xiàn)，瘤胃液與內(nèi)容物微生物之間沒有顯著差異；不同飼草飼喂的長頸鹿瘤胃微生物中厚壁菌門及擬桿菌門細(xì)菌均表現(xiàn)出較高豐度，其中普氏菌屬和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)豐度最高；而且在測序結(jié)果中約20%的細(xì)菌序列為首次發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌序列。這些均是調(diào)整日糧后，應(yīng)用高通量測序技術(shù)所得到的豐富詳細(xì)的宏基因組學(xué)信息，極大的方便了學(xué)者對(duì)日糧與動(dòng)物胃部微生物關(guān)系的把握。

1.5 牛不同發(fā)育階段瘤胃微生物的變化研究

反芻動(dòng)物瘤胃微生物對(duì)機(jī)體的生理活動(dòng)非常重要。但是，在以牛為典型代表的反芻動(dòng)物的生長過程中，微生物群落的種類、豐度如何變化呢？Jami等[19]選取了從出生1 d到2歲的成年以色列荷斯坦奶牛，研究宿主年齡變化對(duì)瘤胃微生物群落的影響。其中，6月齡和2歲齡采用70%精料+30%粗飼料飼喂，2月齡斷奶牛飼喂母乳和特定的固體補(bǔ)充精料，初生犢牛6頭僅飼喂初乳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘤胃發(fā)酵整個(gè)過程是一個(gè)從有氧發(fā)酵到無氧發(fā)酵的過程，微生物群落逐漸豐富活躍。其中初生犢牛瘤胃中幾乎沒有成年牛瘤胃中的微生物；6月齡與2歲牛雖然飼喂飼料相同，但瘤胃微生物菌群有著顯著差異；相對(duì)于初生牛，成年牛瘤胃微生物環(huán)境更加均衡、嚴(yán)格，菌群更趨于多樣化，2歲時(shí)瘤胃微生物群落趨于成熟穩(wěn)定；從出生到成年，牛瘤胃中微生物在門水平主要由變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的細(xì)菌組成，占主要地位，且隨著年齡的增長變形菌門細(xì)菌的數(shù)量下降，2月齡后擬桿菌門數(shù)量雖有變化但基本保持一定水平(圖1)；在出生3 d后普氏菌屬、糞球菌屬(Coprococcus)和水解纖維素有關(guān)的瘤胃球菌屬等細(xì)菌逐漸增多并表現(xiàn)出一定豐度，逐漸完善了瘤胃功能(表1)。這一趨勢與一項(xiàng)研究人類嬰兒隨著年齡增長大腸微生物變化的報(bào)道類似：隨著機(jī)體的成熟，消化機(jī)能逐步完善，體內(nèi)微生物種群會(huì)逐漸豐富[20]。Koenig等[21]關(guān)于嬰兒腸道微生物的研究印證了這一點(diǎn)，同時(shí)也指出兒童腸道微生物群落在2.5歲后基本趨于穩(wěn)定。高通量測序的宏基因組技術(shù)為研究各個(gè)發(fā)育階段微生物提供了充足的數(shù)據(jù)支持，使得整個(gè)發(fā)育階段微生物變化脈絡(luò)更加清晰完備，且研究更加簡單易行。

圖1 不同年齡階段牛瘤胃微生物門水平變化[19]Fig.1 Microbial composition in different age stages of bovine rumen at phylum level[19].注:a:各年齡階段牛瘤胃微生物門屬水平分布; b、c、d:不同年齡階段各組變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門微生物所占比例，圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

門屬種1日齡(%)3日齡(%)2月齡(%)6月齡(%)2歲齡(%)擬桿菌門Bacteroidetes普氏菌屬Prevotella3.85±3.3548.88±6.9859.68±5.1556.66±5.28擬桿菌目*Bacteroidales1.48±0.820.34±0.160.52±0.140.27±0.05梭菌屬Clostridium2.16±1.021.81±0.350.86±0.155.24±1.194.60±0.67毛旋菌科*Lachnospiraceae0.08±0.023.58±0.735.02±0.737.02±1.03琥珀酸菌屬Succiniclasticum0.22±0.130.76±0.081.35±0.172.01±0.36糞球菌屬Coprococcus0.13±0.111.24±0.381.68±0.231.88±0.20瘤胃球菌屬Ruminococcus0.20±0.131.30±0.441.50±0.201.60±0.11瘤胃菌科*Ruminococcaceae0.67±0.280.80±0.185.30±1.345.56±0.82丁酸弧菌屬Butyrivibrio1.41±0.862.44±0.619.17±1.66梭菌目*ClostridialesFamilyXIII.IncertaeSedis0.15±0.060.99±0.211.38±0.25厚壁菌門Firmicutes月行單孢菌屬Selenomonas0.13±0.020.27±0.071.03±0.22光崗菌屬M(fèi)itsuokella0.08±0.010.14±0.020.58±0.20真菌屬Eubacterium0.50±0.050.56±0.070.71±0.04羅氏菌屬Roseburia0.06±0.010.22±0.030.41±0.05假丁酸弧菌屬M(fèi)oryella0.15±0.010.10±9.03E-050.38±0.10丹毒絲菌屬Bulleidia0.06±0.020.10±0.020.21±0.05毛螺旋菌屬Lachnobacterium0.08±0.040.11±0.020.16±0.04顫螺旋菌屬Oscillospira0.55±0.160.13±0.020.11±0.02毛螺菌屬Lachnospira0.15±0.060.05±5.31E-050.08±0.02變形菌門Proteobacteria毛螺菌屬Lachnospira0.15±0.060.05±5.31E-050.08±0.02琥珀酸弧菌屬Succinivibrio34.45±9.478.45±2.291.41±0.32總和2.168.4495.5393.8595.23

注：各組各個(gè)年齡段微生物屬水平微生物平均豐度值，未達(dá)屬水平的菌目標(biāo)以*。

2 基于高通量測序的宏基因組學(xué)技術(shù)在動(dòng)物腸道微生物方面的應(yīng)用研究

除了反芻動(dòng)物瘤胃中微生物能消化植物纖維以外，在草食動(dòng)物和雜食動(dòng)物中，大腸是一個(gè)重要的消化器官，機(jī)體所需能量的20%左右是從大腸獲取的[1]。在利用現(xiàn)代宏基因組技術(shù)研究大腸中微生物的消化作用方面，Ilmberger等[22]對(duì)最大的陸地植食性動(dòng)物—亞洲象大腸微生物群落的研究中，選取3周齡和6歲的亞洲象糞便做 Illumina平臺(tái)的高通量宏基因組檢測分析后，分別獲得了380個(gè)和3 000個(gè)可操作單元(operational taxonomic units，OTUs)及1.1 Gb的DNA contigs，并發(fā)現(xiàn)了84個(gè)GH的PULs多屬于擬桿菌門，還包括一些纖維素酶基因。另外，擬桿菌門中，GH5和GH9家族酶表現(xiàn)出較高豐度，可能主要是在亞洲象消化纖維素過程中起作用。

在腸道微生物研究中，應(yīng)用高通量測序技術(shù)可準(zhǔn)確獲得腸道微生物群落的分類、豐度信息，為人類研究腸道營養(yǎng)健康提供支持。Ziemer[23]取豬糞便，加纖維素、果膠木聚糖連續(xù)培養(yǎng)8周后，利用基于高通量測序的宏基因組技術(shù)得到575種細(xì)菌菌株，分屬6門：厚壁菌門(242)、擬桿菌門(185)、變形菌門(65)、梭菌門(55)、放線菌門(23)和互養(yǎng)菌門(5)；與核糖體數(shù)據(jù)庫(ribosomal database project, RDP)比對(duì)后，約有30%的細(xì)菌為不可培養(yǎng)菌，有179株屬于新的菌種或菌屬。其中厚壁菌門主要由毛旋菌科、腸球菌科、葡萄球菌科及梭菌科I(Clostridiaceae I)組成；擬桿菌門以多形擬桿菌屬、卵形擬桿菌屬及B.木聚糖占主導(dǎo)地位；而厚壁菌和擬桿菌中的大部分菌可產(chǎn)生降解植物細(xì)胞壁的酶，參與植物細(xì)胞壁的降解消化，與腸道的消化功能有關(guān)。之后，Ziemer[24]還對(duì)愛荷華州立大學(xué)農(nóng)場的4頭經(jīng)產(chǎn)奶牛糞便取樣，分離細(xì)菌繼續(xù)培養(yǎng)8周后同樣采用高通量測序的宏基因組學(xué)技術(shù)，檢測微生物后并與RDP比對(duì)發(fā)現(xiàn)6門、459種菌屬(厚壁菌門51.9%、擬桿菌門30.9%、變形菌門11.1%、放線菌門3.5%、互養(yǎng)菌門1.5%、梭菌門1.1%)，這也僅占所分離細(xì)菌的近98.5%；厚壁菌門主要有鞭毛菌科、瘤胃菌科、丹毒菌科及梭菌科(Clostridiaceae I)；擬桿菌門主要是卵形多形擬桿菌B.及木聚糖溶解酶B.。類似地，de Oliveira等[25]對(duì)巴西Nelore閹牛瘤胃、小腸、大腸內(nèi)容物做16S rRNA基因高通量測序檢測后也發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和擬桿菌門微生物為各個(gè)組織部位的主要菌群。Ni等[26]對(duì)24條草魚大腸微生物做宏基因組檢測后發(fā)現(xiàn)有116種古菌和1 112種細(xì)菌，且主要為厚壁菌門、變形菌門和梭菌門細(xì)菌。Singh等[27]采用高通量測序?qū)︼暳限D(zhuǎn)化率不同的印度“MY”肉雞糞便中微生物菌群檢測后，與RDP、小分子rRNA數(shù)據(jù)庫(SSU rRNA database)及SEED數(shù)據(jù)庫(SEED database)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，微生物中細(xì)菌占95%以上，其次依次為真核生物(>2%)、古菌(>0.2%)和病毒(>0.2%)；在門水平，兩組微生物中變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門含量依次降低，在高、低飼料轉(zhuǎn)化率肉雞糞便樣品的微生物群落中變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門含量依次為52.04%和78.83%、27.53%和11.97%、17.53%和7.10%。通過高通量測序的宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)動(dòng)物腸道微生物測序，然后比對(duì)數(shù)據(jù)庫，確定這些腸道微生物的主要功能，為后續(xù)動(dòng)物腸道營養(yǎng)健康研究提供了方法。

3 基于高通量測序的宏基因組學(xué)技術(shù)在特定功能微生物篩選中的應(yīng)用

草食動(dòng)物可直接消化利用植物，主要是草食動(dòng)物體內(nèi)微生物在特定條件下可以產(chǎn)生相關(guān)的降解酶類，來消化降解植物細(xì)胞壁。因此，我們可以通過研究動(dòng)物體內(nèi)微生物降解纖維的生物機(jī)理，人工干預(yù)微生物微環(huán)境，調(diào)節(jié)微生物代謝向著人類希望的方向發(fā)展；相似地，我們也可通過對(duì)草食動(dòng)物體內(nèi)微生物的研究，篩選出具有特定功能的微生物應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵等行業(yè)。因此，在應(yīng)用基于高通量測序的宏基因組學(xué)技術(shù)于動(dòng)物研究的同時(shí)，也可用在對(duì)特定功能微生物篩選的研究中。

例如，López-Cortés等[28]在研究牛瘤胃微生物時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種新的木聚糖水解酶——乙?；揪厶酋ッ?；Palackal等[29]在牛腸道微生物中分離出復(fù)合糖基水解酶；Weimer和Stevenson[30]從牛瘤胃中分離出可產(chǎn)乙酸的芽孢桿菌；Liu等[31]應(yīng)用宏基因組學(xué)技術(shù)從中國荷斯坦牛瘤胃中分離鑒定出一個(gè)新的厭氧型、適溫、一氧化碳氧化產(chǎn)氫菌，并從構(gòu)建的宏基因組文庫中獲得2個(gè)新的脂解酶RlipE1和RlipE2基因。Wang等[32]對(duì)牦牛瘤胃內(nèi)容物應(yīng)用高通量測序的宏基因組技術(shù)構(gòu)建宏基因組文庫并測序，篩選出14個(gè)屬于水解酶10家族(GH10)的木聚糖酶蛋白，這些木聚糖酶的氨基酸序列相似度為20.5%～91.3%，并且7個(gè)木聚糖酶基因與木糖苷酶基因有著不同的contigs；Larsbrink等[33]對(duì)奶牛瘤胃微生物宏基因組進(jìn)行高通量測序后得到27 755個(gè)碳水化合物水解酶候選基因，可編譯90種候選蛋白，并且其中57%的候選基因可通過酶促作用，激活抗纖維素底物相關(guān)酶類。Pope等[34]在對(duì)馴鹿瘤胃消化木質(zhì)纖維素相關(guān)微生物的宏基因組學(xué)研究中，除了發(fā)現(xiàn)擬桿菌門和厚壁菌門為主要作用的微生物以外，還鑒定出一種新的擬桿菌分支菌SRM-1，分析后發(fā)現(xiàn)其具有多個(gè)PULs，分泌20種GH和其他多種靶向碳水化合物水解酶，包括木聚糖、果膠和纖維素水解酶類。Gruninger等[35]對(duì)從飼喂青草、干草的奶牛瘤胃內(nèi)容物建立宏基因組文庫后鑒定出一種具有高β-葡萄糖苷酶活性的蛋白Bgxa1(beta-glucosidase/beta-xylosidase/alpha-arabinosidase gene)，Bgxa1可高效抗p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-beta-d-glucopyranoside (pNPG))、纖維二糖(cellobiose)、p-硝基苯基-β-D-木吡喃糖苷(p-nitrophenyl-beta-d-xylopyranoside (pNPX))及p-硝基苯基-α-D-阿拉伯糖苷(p-nitrophenyl-alpha-d-arabinofuranoside (pNPAf))。Bgxa1的動(dòng)力學(xué)分析顯示其對(duì)以上三種糖苷的催化活性高低依次為pNPG>pNPAf>pNPX；Bgxa1的催化活性是β-木糖苷酶和α-阿拉伯糖苷酶的100倍，對(duì)木質(zhì)纖維素材料有較好的糖化作用。Li等[36]對(duì)飼喂中國芒草的肉牛瘤胃微生物運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)，建庫后篩選、克隆、鑒定出一種新的編碼β-糖苷水解酶的基因unglu135B12，該基因編碼一個(gè)779氨基酸的多肽鏈，具有一個(gè)GH3催化位點(diǎn)，最適酶活條件為pH 5.0、38℃。

4 展望

經(jīng)過千百萬年以來的自然選擇和遺傳進(jìn)化，草食性動(dòng)物和雜食性動(dòng)物具有了特有的消化利用植物資源的生理功能，主要是其胃腸道適應(yīng)了寄生微生物，構(gòu)成了一定的微生物穩(wěn)態(tài)。在這種特殊的微生物環(huán)境中，經(jīng)過微生物的發(fā)酵，降解植物纖維為動(dòng)物體所能吸收的營養(yǎng)物質(zhì)，大幅提高了資源的利用率。研究并利用這一特殊的生理特性，使得人工干預(yù)微生物高效利用植物資源成為可能。而且，現(xiàn)今人們已經(jīng)清楚的認(rèn)識(shí)到生物體的生理代謝和生長發(fā)育除了受自身基因的調(diào)控外，還受到多條件的影響調(diào)控，其中就包括機(jī)體中的微生物?；诟咄繙y序的宏基因組技術(shù)的進(jìn)步，使人們能盡可能全面地掃描到一些特殊微生物環(huán)境中的微生物基因，挖掘出更多以前尚未發(fā)現(xiàn)的功能性基因，以及更多的不可培養(yǎng)微生物，在很大程度上豐富了微生物基因庫。另外，隨著現(xiàn)代宏基因組技術(shù)在生物體內(nèi)微生物研究中的應(yīng)用，為人們更加全面掌握生物體機(jī)能代謝、營養(yǎng)調(diào)控以及疾病免疫預(yù)防等，提供了更為方便可靠的技術(shù)支持。而且，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，生物體內(nèi)微生物的相關(guān)研究，也為生物制劑生產(chǎn)、生物發(fā)酵工程等微生物應(yīng)用領(lǐng)域研究提供了幫助。

在生物體相關(guān)微生物的研究中，人類體內(nèi)微生物研究走了最前面，例如在2007年及2008年，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)及歐盟委員會(huì)(European Commission，EC)分別啟動(dòng)了“人類生物組計(jì)劃”(Human Microbiome Project，HMP)和“人類腸道宏基因組學(xué)” (Metagenomics of Human Intestinal Tract，MetaHIT)計(jì)劃，分別資助約1.15億美元和2 770萬美元，由美國、歐盟、中國、日本等多國參與合作，第一階段資助已經(jīng)完成，但由于微生物菌群的復(fù)雜特性及科技制約取得的成果與預(yù)期效果仍有差距。

雖然基于高通量測序技術(shù)的基因組技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)研究微生物的方法而言，在獲得微生物數(shù)據(jù)量、可操作性等方面有了很大進(jìn)步，但仍不夠完善。比如，現(xiàn)在的高通量測序技術(shù)都是將DNA剪切為小片段后，再單個(gè)連接小片段DNA至一定的固相表面單獨(dú)擴(kuò)增后拼接并檢測信號(hào)。DNA拼接越長難度越大，從而完美的片段閾值難以完全控制，存在一定的誤差。另一方面，高通量測序越來越強(qiáng)的測序深度及越來越大的數(shù)據(jù)輸出也導(dǎo)致現(xiàn)有算法難以完全利用如此龐大的數(shù)據(jù)量，不但造成數(shù)據(jù)的浪費(fèi)并在一定程度上這也導(dǎo)致在后期數(shù)據(jù)分析過程中制約了高通量測序技術(shù)在宏基因組學(xué)方面的應(yīng)用。但是，相信隨著科技的進(jìn)一步發(fā)展，下一代優(yōu)化測序技術(shù)的改進(jìn)，或者新研究方法的出現(xiàn)，一定可以使人類對(duì)于微生物研究更加深入、了解的更加透徹，從而幫助人類徹底解決生物體與微生物之間的種種謎題。

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