大豆異黃酮對球囊損傷血管內(nèi)膜增生的影響

牟德堂 邱仁峰

大豆異黃酮對球囊損傷血管內(nèi)膜增生的影響

牟德堂①邱仁峰①

目的：探討大豆異黃酮對球囊損傷模型兔頸動脈后再狹窄的預(yù)防。方法：建立兔右頸動脈球囊損傷模型，實驗分單純球囊損傷組（Inj）、去勢后球囊損傷組（Ovx+Inj）、去勢球囊損傷后補充雌激素組（Ovx+Inj+E2）、去勢球囊損傷后補充大豆異黃酮組（Ovx+Inj+Iso），于28 d行彩超檢查，監(jiān)測損傷動脈內(nèi)-中膜的厚度及內(nèi)膜的光滑程度，后分組等數(shù)分別處死動物，分別計算損傷血管腔內(nèi)膜/中膜面積比值。結(jié)果：Inj組與Ovx+Inj組內(nèi)膜、中膜增厚明顯，管腔狹窄明顯，Ovx+Inj+E2組和Ovx+Inj+Iso組各時段血管形態(tài)學(xué)分析顯示內(nèi)膜增生程度低于Inj組與Ovx+Inj組（P<0.05）。結(jié)論：大豆異黃酮可明顯抑制損傷血管內(nèi)膜增生及中膜平滑肌細胞增殖，發(fā)揮其血管保護作用。

大豆異黃酮； 內(nèi)膜增生； 雌激素； 雌激素受體

經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTCA）是治療冠心病的主要手段之一，近年來廣泛應(yīng)用于臨床，該手術(shù)即刻有效率高達90%以上，但術(shù)后3～6個月再狹窄的發(fā)生率為30%～50%[1]，嚴重影響了該治療方法的遠期效果。研究表明，血管損傷后再狹窄是局部血管的一種修復(fù)反應(yīng)，涉及復(fù)雜病理生理過程，其中最主要機制為血管本身擴張后的彈性回縮、內(nèi)膜增生和中膜平滑肌細胞增值遷移引起的血管重構(gòu)，今年越來越多研究表明，絕經(jīng)前女性心血管發(fā)生率遠遠低于絕經(jīng)后的發(fā)病率[2]，絕經(jīng)后女性心梗后服用雌激素（E2）心衰發(fā)生率明顯減低，這些研究說明雌二醇（E2）對心血管系統(tǒng)具有保護作用[3]，但長時間大量補充雌激素，易引發(fā)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及子宮出血等副作用[4]，大豆異黃酮經(jīng)研究表明具備弱雌激素樣作用，廣泛存在于日常食物中，被稱為植物雌激素（phytoestrogen，PE）[5]。去勢大白兔為本實驗對象，模擬動脈球囊擴張損傷，觀察大豆異黃酮對去勢大白兔血管損傷內(nèi)膜增生的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物和材料 正常成年雌性新西蘭大白兔48只（濰坊醫(yī)學(xué)院動物實驗中心），體重約2～2.2 kg；尼爾雌醇（上海醫(yī)藥集團有限公司華聯(lián)制藥廠）；大豆異黃酮40%（陜西中鑫生物技術(shù)公司）；2.5F導(dǎo)管球囊（強生公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 取成年雌性新西蘭大白兔48只，隨機分為4組，每組12只。單純球囊損傷組（Inj）；去勢后球囊損傷組（Ovx+Inj）：去卵巢后2周實施有頸總動脈球囊擴張術(shù)；去勢球囊損傷后補充雌激素組（Ovx+Inj+E2）：去卵巢后2周實施右頸總動脈球囊擴張術(shù)，給予尼爾雌醇溶液5 mg/Kg灌胃，1次/d；去勢球囊損傷后補充大豆異黃酮組（Ovx+Inj+Iso）：去卵巢后兩周實施右頸總動脈球囊擴張術(shù)，術(shù)后給予大豆異黃酮120 mg/kg灌胃，1次/d。

1.2.2 動物模型的建立 去卵巢術(shù)：用質(zhì)量分數(shù)1%異戊巴比妥（5 mL/kg）自耳緣靜脈注射麻醉大白兔，去毛、消毒皮膚，取腹正中切口，開腹后子宮末端可見到卵巢，呈桑葚樣，切除雙側(cè)卵巢，結(jié)扎斷端，關(guān)腹，肌注青霉素預(yù)防術(shù)后感染。

右頸總動脈球囊擴張術(shù)：兔去勢后2周，麻醉方法同上，消毒，無菌下，分離右側(cè)頸總動脈、頸外、內(nèi)動脈，耳緣靜脈注射肝素（1 mg/kg），頸外動脈于遠心端結(jié)扎，夾閉頸總動脈近端，切開頸外靜脈，向近心端插入2.5F球囊導(dǎo)管約3 cm，用壓力泵注入等滲鹽水向球囊內(nèi)，壓力維持在12 kPa，外拉球囊，反復(fù)3次，拔除導(dǎo)管，頸外動脈結(jié)扎，縫合，青霉素后抗感染（肌肉注射20萬單位/只），連用3 d，1次/d。所有動物正常飲食、飲水[6]。Ovx+Inj+E2組：術(shù)后給予尼爾雌醇溶液5 mg/kg灌胃，1次/d；Ovx+Inj+Iso組：術(shù)后給予大豆異黃酮120 mg/kg灌胃，1次/d。球囊損傷后28 d先行頸動脈彩超檢查，后用空氣栓塞法分組等數(shù)處死模型兔，右頸總動脈留作標(biāo)本，甲醛（濃度10%）固定、制作切片、HE染色，觀察血管內(nèi)膜、中膜。

1.2.3 采用GE LOGIQ 9彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率10 MHz。球囊損傷后第28天彩超監(jiān)測損傷側(cè)兔頸動脈內(nèi)-中膜的變化。方法：兔頸部備皮后涂耦合劑，采取適宜體位固定后，檢測損傷處頸動脈內(nèi)-中膜的厚度、內(nèi)膜的光滑程度及是否有動脈狹窄，并與健側(cè)頸動脈進行比較。

1.2.4 HE染色切片計算動脈內(nèi)膜、中膜面積和內(nèi)膜/中膜面積比值 球囊損傷后第28天空氣栓塞處死動物，取右頸總動脈標(biāo)本，10%甲醛固定，石蠟切片，HE染色，通過光學(xué)顯微鏡和計算機病理圖像分析系統(tǒng)（leica Qwin，德國）測定損傷動脈內(nèi)膜、中膜面積和內(nèi)膜/中膜面積比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗比較兩組均數(shù)，單方向方差分析（One-Way AVOVA）比較多組均數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 彩超檢測兔頸動脈 右頸總動脈球囊擴張術(shù)后彩超可見內(nèi)中-膜厚度較健側(cè)增厚，內(nèi)膜毛糙，動脈狹窄時可見血流束變窄，顏色明亮，且程度Ovx+Inj組和Inj組隨著時間的延長也愈明顯；而Ovx+Inj+Iso組內(nèi)中-膜增厚程度及內(nèi)膜的光滑程度與Ovx+Inj+E2組無明顯差異（P>0.05），但與Ovx+Inj組和Inj組比較有明顯差異（P<0.05）。統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表1。

表1 各組28 d后中膜厚度（±s）

表1 各組28 d后中膜厚度（±s）

*與Inj組和Ovx+Inj組對比，P<0.01

組別 平均厚度（mm）Inj組（n=12） 0.36±0.04 Ovx+Inj組（n=12） 0.35±0.04 Ovx+Inj+E2組（n=12） 0.28±0.03*Ovx+Inj+Iso組（n=12） 0.28±0.03*

2.2 組織形態(tài)學(xué)分析 （10×20）顯微鏡下觀察，正常動脈管壁僅有一層緊貼完整內(nèi)彈力板的內(nèi)側(cè)細胞，中膜見核呈梭形平滑肌細胞。損傷后的內(nèi)膜呈不均一增厚，厚度不均，內(nèi)膜層可見平滑肌細胞及細胞外基質(zhì)，內(nèi)彈力板破壞、斷裂，且有平滑肌連接斷裂處，見中膜損傷并增厚，外膜變厚。Ovx+Inj+Iso組內(nèi)膜增生程度（I/M ratio）與Ovx+Inj+E2組（I/M ratio）無明顯差異（P>0.05），但與Ovx+Inj組（I/M ratio）和Inj組（I/M ratio）有明顯差異（P<0.05）。HE染色圖片見圖1，統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2。

圖1 28 d后血管HE染色切片

3 討論

正常狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細胞是血液與動脈壁細胞的機械屏障，防止血液中損傷因素直接作用于中層平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC），同時內(nèi)皮細胞釋放多種生長抑制因子，使 VSMC處于靜止?fàn)顟B(tài)，對VSMC增殖起抑制，內(nèi)皮細胞損傷后，破壞內(nèi)皮細胞和VSMC平衡，內(nèi)皮細胞和VSMC釋放活性物質(zhì)，導(dǎo)致VSMC遷移、增殖，新生內(nèi)膜形成，內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞及VSMC遷移增殖是動脈粥樣硬化及高血壓和PTCA術(shù)后損傷血管內(nèi)膜后引起再狹窄的重要因素。球囊損傷術(shù)后再狹窄的發(fā)生，在早期表現(xiàn)為血管內(nèi)皮損傷后血小板黏附聚集，血栓形成；晚期表現(xiàn)為血管平滑肌細胞增殖和遷移而發(fā)生內(nèi)膜增生導(dǎo)致血管重塑。大量研究發(fā)現(xiàn)雌激素有顯著改善血管內(nèi)皮功能的作用[7]，絕經(jīng)后婦女的雌激素治療可改善血脂代謝，顯著降低了冠心病的發(fā)生[8]，Bakir等[9]發(fā)現(xiàn)雌激素可加快血管內(nèi)皮修復(fù)，主要通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖引起，從而起到保護血管作用，植物雌激素存在于日常食物中的非甾體類化合物，日常攝入不會引起臨床可見的副作用，研究表明它具有動物雌激素相似結(jié)構(gòu)，具有弱雌激素樣作用，因此，有望成為動物雌激素的替代品，為人們所關(guān)注。周軼琳等[4]研究證實大豆異黃酮具有雌激素樣作用，增加去勢化大鼠的骨密度，可有效防止去勢化大鼠的骨量丟失，未見對子宮有明顯的增生作用，但雌激素可促進子宮增生明顯，對子宮具有顯著刺激作用[3]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮能顯著抑制兔頸動脈球囊損傷后內(nèi)膜增生和中膜平滑肌的增殖。

表2 各組28 d后內(nèi)膜/中膜厚度比

Vargas等在做研究時將不同濃度的含有氚標(biāo)記物的雌二醇的培養(yǎng)液灌注豬冠狀動脈前降支（CAD），發(fā)現(xiàn)在豬CAD外、中、內(nèi)膜細胞的核內(nèi)和胞漿有標(biāo)記物的存在，此實驗證明雌激素可直接與血管細胞作用。雌激素與其特異性受體結(jié)合調(diào)節(jié)一系列的基因表達，實現(xiàn)生理作用。ERα和ERβ不同的基因編碼，具有不同的蛋白質(zhì)和cDNA分子結(jié)構(gòu)，因而發(fā)揮不盡相同的作用[10]。ERα基因遠大于ERβ基因，為不同長度內(nèi)含子所致，ERα基因位于6q25.1區(qū)，由140 kb堿基構(gòu)成，編碼蛋白分子量為66 kDa，由595個氨基酸組成，ERβ由40Kb堿基構(gòu)成，位于14q22.24區(qū)，編碼的蛋白質(zhì)分子量為54.3 kDa，由485個氨基酸組成的。編碼ERα和ERβ的基因均含有8個外顯子，編碼ERα和ERβ的基因均含有8個外顯子，含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)AF1、2區(qū)、DNA結(jié)合域、鉸鏈區(qū)、配體結(jié)合域[11]。

兩種雌激素受體的氨基酸序列在DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域的同源性分別達為96%和53%[12]，但是這兩種雌激素受體結(jié)合的配體并不完全相同。研究顯示ERα和ERβ結(jié)合經(jīng)典的雌激素反應(yīng)元件。在血管平滑肌細胞的胞漿和胞核可觀察到表達雌激素受體免疫反應(yīng)陽性，以核及核周區(qū)域表達最明顯。證實血管平滑肌細胞與內(nèi)膜細胞的細胞核存在雌激素受體[13-14]，只有少數(shù)雌二醇受體存在于胞漿中，血管平滑肌細胞中的雌激素受體具有雌激素依賴性基因激活功能[15]，如何有效防治PTCA術(shù)后再狹窄是目前醫(yī)學(xué)界一大難題，本動物實驗證明大豆異黃酮對抑制動脈內(nèi)膜增生有明顯效果，為臨床實施雌激素替代治療提供客觀依據(jù)。

[1] Mintz G S，Popma J J，Hong M K，et al. Intravasculai ultrasound to discern device soecific efforts and mechanisms of restenosis[J].Am J Cardiol，1996，78（3A）：18.

[2]李斌， 陸國平. 絕經(jīng)后婦女雌激素及孕激素與心血管疾病關(guān)系的綜述 [J]. 美國醫(yī)學(xué)雜志（中文版）， 2011， 14（1）： 47-49.

[3]楊麗娜，段穎，張英福，等.雌激素及植物雌激素對去卵巢大鼠子宮組織VFGF表達和形態(tài)的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2010，25（8）：1041-1044.

[4]周軼琳，趙敏，楊杏芳，等.大豆異黃酮對去勢大鼠類雌激素樣作用的研究[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2011，33（6）：20-23.

[5] Patten R D，Pourati I，Aronovitz M J，et al. 17-estradial reduces cardiomyocyte apoptosis in vivo via activation of phospho-in-ositide-3 kinase/Akt signaling[J]. Circ Res，2010，95（14）：692-699.

[6] Song Ge ，Guangyi Zhou. Anti-atherogenic effects of montelukast associated with reduced MCP-1 expression in a rabbit carotid balloon injury model[J].Atherosclerosis，2010，205（15）：74-79.

[7] Herrington D M，Braden G A，Williams J K，et al.Endothelialdependent coronary responsiveness in postmenopausal women with and estrogen replacement therapy[J].Am J Cardiol，2010，73（54）：951-952.

[8] Haarbo J， Leth-Espensen P，Stender S，et al. Estrogen monotherapy and combined estrogen-progestogen replacement therapy attenuate aoric accumulation of cholesterol in ovariectomized cholesterol-fed rabbits[J].J Clin Invest，2005，87（1）：274-279.

[9] Bakir S，Mori T，Chen Y F，et al.Estrogen-induced vasoprotection is estrogen receptor dependent ：evidence from the balloon-injured rat caiotid mtery model[J].Circulation，2010，101（20）：2342-2344.

[10] Kwon S M， Kim S I， Chud D C， et al. Development of rat prostatitis model by oral administration of isoflavone and its characteristics[J].Yonsei Med D，2010，42（4）：385-404.

[11] Price R H， Butler C A， Webb P，et al. A splice variant of estrogen receptor beta missing exon displays altered subnuclear localization and capacity fortranscriptional activation[J]. Endocrinology， 2006，l42（5）：2039-2049.

[12] Nishihara E， Nagayama Y， Inoue S， et al. Ontogenetic changes in the expression of estrogen receptor alpha and beta in rat pituitary gland detected by immunohistochemistry[J]. Endocrinology，2000，141（2）：615-620.

[13] Kuiper G G，Enmark E，Peho-Huikko M，et al. Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary[J]. Proc Natl AcadSci USA，1999，93（12）：5925-5930.

[14] Christo D，Venkov，Alan B，et a1.Identification of authentic estrogen receptor in cultured endothelial cell.Circulation， 2006， 94（12）：727.

[15] Karas R H，Pattelson B L， Mendelson M E，et a1.Human vascular smooth mils cells contain functional estrogen receptor[J].Circulationl，2010，89（14）：1963.

The People’s Hospital of Shouguang， Shouguang 262700，China

Effect of Isoflavone on Balloon Catheter-Induced Neointimal Hyperplasia in Rabbit Carotid Artery

MOU De-tang，QIU Ren-feng.

Objective：To investigate the effects of phytoestrogen isoflavone on balloon catheter-induced hyperplasia of carotid artery.Method：Forty-eight female New Zealand rabbits were randomly divided into four groups：control （balloon-induced carotid artery injury only）； ovariectomy control （ovariectomy and carotid artery injury），oestrogen （ovariectomy， carotid artery injury and nilestriol， 5 mg/kg daily for 28 days）， and isoflavone （ovariectomy，carotid artery injury and isoflavone 120 mg/kg daily for 28 days）. The arterial wall thickness was assessed by coloured ultrasonography.Rusult：The medial layer thickness in the isoflavone group was less than in the ovariectomy control group（0.28±0.03 vs.0.35±0.04 mm，P<0.01）， and the intimal/medial layer （I/M） ratio was the isoflavone group was also less than in the ovariectomy control group （16.85±3.79 vs.48.94±8.92，P<0.01）.There was no statistically significant difference in the medial layer thickness or I/M ratio between the isoflavone and the oestrogen groups. Conclusion：Soybean isoflavones can play a role of protecting blood vessels to inhibit neointimal hyperplasia and the proliferation of vascular smooth muscle cell in Vascular injury .

Soy isoflavones； Endometrial hyperplasia； Estrogen； Estrogen receptors

//Medical Innovation of China，2015，12（02）：004-007

①山東省壽光市人民醫(yī)院 山東 壽光 262700

邱仁峰

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.02.002

2014-08-06） （本文編輯：陳丹云）