RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子與缺氧誘導(dǎo)因子-1α在AtT-20細(xì)胞的表達(dá)☆

何偉楊炎林沈曉黎李敏張焱涂偉祝新根

·論 著·

RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子與缺氧誘導(dǎo)因子-1α在AtT-20細(xì)胞的表達(dá)☆

何偉*楊炎林*沈曉黎*李敏*張焱*涂偉*祝新根*

目的研究RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME）調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）對(duì)AtT-20細(xì)胞侵襲的影響。方法通過氯化鈷模擬小鼠垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞的缺氧環(huán)境，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RSUME、HIF-1α的mRNA和蛋白水平的改變；然后運(yùn)用HIF-1α小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染小鼠垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RSUME的mRNA和蛋白水平的改變；運(yùn)用RSUME siRNA及陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染小鼠垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HIF-1α的mRNA和蛋白水平的改變；并用Transwell及MTT法檢測(cè)AtT-20細(xì)胞侵襲的改變。結(jié)果氯化鈷作用AtT-20細(xì)胞后，細(xì)胞中RSUME的蛋白（P=0.003）和HIF-1α的蛋白（P=0.002）水平明顯升高；HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染的AtT-20細(xì)胞中RSUME mRNA（P=0.162）及蛋白（P=0.668）水平表達(dá)無明顯變化；RSUME siRNA轉(zhuǎn)染的AtT-20細(xì)胞中HIF-1α蛋白水平表達(dá)明顯降低（P＜0.001），而mRNA水平未見明顯改變（P=0.136）；RSUME siRNA轉(zhuǎn)染組AtT-20細(xì)胞侵襲率較RSUME陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組低(侵襲抑制率=26.2%±8.4%)。結(jié)論缺氧可誘導(dǎo)RSUME的表達(dá)，RSUME可調(diào)控HIF-1α的蛋白水平的作用影響AtT-20細(xì)胞的侵襲。

RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子 缺氧誘導(dǎo)因子1α AtT-20腫瘤侵襲

腫瘤快速生長(zhǎng)往往伴隨腫瘤血供的不足，易產(chǎn)生缺氧的微環(huán)境，而缺氧的微環(huán)境會(huì)加快腫瘤的生長(zhǎng)速度，增加腫瘤的侵襲能力。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）在腫瘤侵襲的過程中扮演著重要角色，HIF-1α可通過促進(jìn)血管新生增加腫瘤侵襲性，然而HIF-1α在常氧環(huán)境下極易被降解。近期研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在腫瘤的穩(wěn)定表達(dá)需依賴RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME）的調(diào)控[1]。侵襲性垂體腺瘤能對(duì)周圍組織結(jié)構(gòu)侵襲，其侵襲生長(zhǎng)依賴HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)，因此RSUME在侵襲性垂體腺瘤中的作用至關(guān)重要。但RSUME在垂體腺瘤侵襲過程中扮演什么角色目前尚未報(bào)道。本研究通過小鼠垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞為對(duì)象，通過體外建立缺氧模型，并應(yīng)用HIF-1α、RSUME基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染，研究RSUME與HIF-1α在AtT-20細(xì)胞的表達(dá)，以及對(duì)腫瘤侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象AtT-20細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。細(xì)胞用含10%胎牛血清、5%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hy?clone公司）置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2～3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。試劑與儀器：Lipofectamine 2000購(gòu)自Life生物有限公司；引物由上海生物工程公司合成；RIPA裂解液、總RNA抽提試劑Trizol、Taq PCR Mix，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠（二抗）、化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；RSUME、HIF-1α基因序列的特異性小干擾RNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成；SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ購(gòu)自Takara公司；RWDD3兔抗人、兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)nvous公司，HIF-1α兔抗人、兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自cell signaling生物有限公司；Transwell小室及Matrigel膠購(gòu)自北京樂博生物科技有限公司。

1.2 氯化鈷模擬腫瘤缺氧環(huán)境取生長(zhǎng)良好的AtT-20細(xì)胞，移至15 mL離心管后充分吹打，置于低速離心機(jī)中1000r/min離心5 min，棄置上清液，加入適量培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。將懸浮細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，生長(zhǎng)至融合度約60%時(shí)換液，加入含有100μmol/L氯化鈷的培養(yǎng)液。培養(yǎng)過程中用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3 RSUME siRNA和HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染小鼠垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞AtT-20細(xì)胞接種12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1×105個(gè)/孔，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipo?fectamine 2000說明書進(jìn)行。RSUME siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分：空白對(duì)照組、siRNA negative control（NC）組和RSUME siRNA轉(zhuǎn)染組。HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分：空白對(duì)照組、siRNA negative control（NC）組和HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染組。RSUME siRNA序列為5'GGACTTGTGGGTGAGGATG 3'，陰性對(duì)照序列為5'GGATGGGAC TGGTTGGATG 3'；HIF-1α siRNA序 列 為 5’CCAACCTCAGTGTGGGTAT 3’，HIF-1α siRNA陰性對(duì)照序列為5’CCAT?GTAG-GCGCAGTCTAT 3’由上海吉瑪公司純化合成。轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡下觀察含有紅色熒光的AtT-20細(xì)胞數(shù)，若含熒光細(xì)胞比例占50%以上，用于行實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)RSUME、HIF-1α的mRNA表達(dá)使用總RNA抽提試劑，提取上述AtT-20細(xì)胞總RNA，各組AtT-20細(xì)胞取1×106個(gè)；配制PCR反應(yīng)液：2μL cDNA，上下游引物各1μL，SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ10μL，添加去離子水使總體積達(dá)到20μL。RSUME上游引物：5'GAGAGCGAG?GACTAAATATGTC 3'， 下 游 引 物 ：5' CATTTTCTCTTTGCATTTCTTTC 3'；HIF-1α上游引物：5'TACTGAGTTGATGGGTTATGA 3'，下游引物：5'AAGGCAGCTTGTATCCTC 3'；β-actin上游引物：5'GTGACGTTGACATCCGTAAAGA 3'；下游引物：5'GCCGGACTCATCGTACTCC 3'。進(jìn)行Re?al Time PCR反應(yīng):95℃預(yù)變性30s；95℃5s，60℃30s循環(huán)40次。根據(jù)公式ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin和ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對(duì)照組統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.5 Western blot檢測(cè)RSUME、HIF-1α蛋白的表達(dá)按照RIPA裂解液試劑盒說明書提取AtT-20的總蛋白，利用生物分光光度計(jì)比色分析總蛋白含量，取蛋白質(zhì)40μg/孔進(jìn)行電泳。80mV，在10%SDS-PAGE電泳2 h，蛋白膠條移至PVDF膜，250mA轉(zhuǎn)膜80min。5%脫脂奶粉封閉液室溫下封閉2 h，TBST洗膜3次。分別加入RWDD3、HIF-1α兔抗人多克隆抗體（1：1000稀釋）、β-actin鼠抗人多克隆抗體(1∶5000稀釋)一抗，4℃過夜孵育；洗膜3次后加入二抗(1∶5000稀釋)。依據(jù)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（Enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒操作說明進(jìn)行顯影、定影。利用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行灰度掃描和凈光密度值分析。結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參的IOD比值表示。

1.6 Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲試驗(yàn)將Tran?swell小室放入24孔板，50mg/L的Matrigel膠用無血清培養(yǎng)基1：8稀釋，包被8μm孔徑的Transwell上室的底部表面；用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約1×105個(gè)/mL，各組取200μL加入上室，下室加10%胎牛血清培養(yǎng)液500μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h（每組設(shè)3個(gè)重復(fù)小室）。AtT-20為懸浮細(xì)胞，直接遷移至下室培養(yǎng)基中。將下室培養(yǎng)基輕輕吹打混勻后行MTT法比較存活細(xì)胞數(shù)量。

1.7 MTT法檢測(cè)垂體腺瘤AtT-20侵襲細(xì)胞數(shù)量將進(jìn)行了Transwell侵襲試驗(yàn)的24孔板中加入500μL含0.5mg/mLMTT溶液，37℃孵育4h后加入500 μL DMSO，振蕩10min，充分吹打混勻后加到96孔板中（每組設(shè)5個(gè)副孔），酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。結(jié)果以侵襲抑制率表示。侵襲抑制率（%）=（OD空白組-OD轉(zhuǎn)染組）/OD空白組。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS19.0進(jìn)行分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，檢測(cè)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 氯化鈷模擬腫瘤缺氧環(huán)境能上調(diào)RSUME及HIF-1α的表達(dá)氯化鈷缺氧處理小鼠垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞后，提取細(xì)胞的總mRNA及蛋白，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，RSUME mRNA表達(dá)水平明顯升高（F=156.251，P＜0.001），而HIF-1α mRNA的表達(dá)水平無明顯改變（F=1.050，P= 0.363）；運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)總蛋白，結(jié)果顯示，RSUME蛋白的表達(dá)水平明顯升高（F=44.351，P=0.003），HIF-1α蛋白的表達(dá)水平也明顯升高（F=46.610，P=0.002）。見表1，圖1。

2.2 HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)RSUME的表達(dá)無影響HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染AtT-20細(xì)胞后，提取細(xì)胞的總mRNA及蛋白，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)，結(jié)果行單因素方差分析及SNK法：與空白對(duì)照組及NC組相比，HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染組的mRNA（F=471.476，P＜0.001）及蛋白水平明顯下降（F=25.403，P＜0.001）；然而RSUME mRNA（F= 2.502，P=0.162）和蛋白（F=0.379，P=0.668）表達(dá)水平在三組之間均無明顯變化。見圖2，表2。

圖1 各組AtT-20細(xì)胞中RSUME、HIF-1α的蛋白表達(dá)水平，1：空白對(duì)照組；2：CoCl2處理組

圖2 HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染后AtT-20細(xì)胞中RSUME、HIF-1α的蛋白表達(dá)水平，1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：siRNA轉(zhuǎn)染組

表1 AtT-20細(xì)胞中RSUME、HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)水平

表2 HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染后垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞中RSUME、HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)

2.3 RSUME siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)HIF-1α的蛋白表達(dá)RSUME siRNA轉(zhuǎn)染AtT-20細(xì)胞后，提取細(xì)胞總mRNA及蛋白，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果行單因素方差分析及SNK法：與空白對(duì)照組及NC組相比，RSUME siRNA轉(zhuǎn)染組的mRNA水平明顯下降（F=80.435，P＜0.001），HIF-1α mRNA的表達(dá)水平三組之間無明顯變化（F=2.839，P=0.136）；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組及NC組相比，RSUME siRNA轉(zhuǎn)染組的蛋白水平明顯下降（F= 63.929，P＜0.001），HIF-1α蛋白的表達(dá)水平也隨著相應(yīng)下降（F=96.345，P＜0.001）。見圖3、表3。

2.4 RSUME siRNA轉(zhuǎn)染后抑制垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞的侵襲 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)后收集下室細(xì)胞，行MTT法檢測(cè)侵襲細(xì)胞數(shù)量，測(cè)得OD值分別為：未轉(zhuǎn)染對(duì)照組（0.395±0.049），siRNA陰性對(duì)照組（0.385±0.058），RSUME siRNA轉(zhuǎn)染組0.293± 0.061。RSUME siRNA轉(zhuǎn)染組對(duì)AtT-20細(xì)胞侵襲的抑制與空白對(duì)照組及NC組不全相等（F=67.023，P＜0.001），進(jìn)一步行SNK法檢驗(yàn)示，siRNA轉(zhuǎn)染組的光密度值與空白對(duì)照組及NC組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其侵襲抑制率（26.2%±8.4%）。

3 討論

垂體腺瘤約占顱內(nèi)腫瘤的10%～15%[2]，其侵襲能力是患者預(yù)后的主要因素。約有35%垂體腺瘤能對(duì)周圍組織結(jié)構(gòu)侵襲被定義為侵襲性垂體腺瘤[2]，目前垂體腺瘤的生長(zhǎng)及侵襲的分子機(jī)制尚不清楚。關(guān)于垂體腺瘤的研究中，認(rèn)為HIF-1的高表達(dá)為垂體腺瘤侵襲的重要因素。HIF-1是一種主要由分子量120kD的HIF-1α和分子量91～94 kD的HIF-1β兩個(gè)亞基組成的異源性二聚體，其中HIF-1α是其主要的活性單位[3]。缺氧能誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，并且HIF-1α能通過調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，參與腫瘤生成及侵襲的作用。眾所周知，缺氧是腫瘤生長(zhǎng)的基本特征，腫瘤的快速生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部缺血缺氧，同時(shí)HIF-1α的表達(dá)也隨之升高。本研究通過應(yīng)用CoCl2模擬缺氧環(huán)境進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示缺氧可誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)。隨著腫瘤侵襲的增加，為保持腫瘤血供，腫瘤血管生存的能力將極大提高，而HIF-1α的靶因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)是該過程主要的調(diào)控因子[4]。然而正常氧濃度下HIF-1α很快會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的氧依賴性泛素蛋白酶結(jié)合，通過作用其泛素位點(diǎn)Lys391和Lys477，降解HIF-1α蛋白[5]。

圖3 RSUME siRNA轉(zhuǎn)染后AtT-20細(xì)胞中RSUME、HIF-1α的蛋白表達(dá)水平，1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：siRNA轉(zhuǎn)染組

表3 RSUME siRNA轉(zhuǎn)染后垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞中RSUME、HIF-1α mRNA及蛋白的表達(dá)

小泛素化相關(guān)因子1（small ubiquitin related modifiers-1，SUMO-1）擁有與泛素分子相似的結(jié)構(gòu)，能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HIF-1α泛素化位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制泛素化阻斷蛋白質(zhì)的泛素化-蛋白酶體降解途徑，增加HIF-1α的穩(wěn)定性[6]。SUMO化及作用首先需被E1激活酶激活，再轉(zhuǎn)至E2結(jié)合酶，通過E3連接酶使SUMO羧基末端與HIF-1α的Lys殘基通過異肽鏈連接，從而使HIF-1α SUMO化，穩(wěn)定HIF-1α的作用[7]。但是SUMO化所需底物大部分都在細(xì)胞核內(nèi)，RSUME可表達(dá)與SUMO的E2結(jié)合酶結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)蛋白，幫助SUMO-1與HIF-1α的泛素化位點(diǎn)結(jié)合，形成底物的SUMO化[8]，而缺氧誘導(dǎo)能進(jìn)一步誘導(dǎo)SUMO化的作用，由此可見缺氧為垂體腺瘤侵襲的重要因素之一。因此我們?cè)诖送茰y(cè)缺氧是否為RSUME的誘導(dǎo)因素？本研究通過模擬體外缺氧環(huán)境，結(jié)果顯示RSUME mRNA及蛋白的表達(dá)水平明顯升高，證實(shí)缺氧為RSUME的誘導(dǎo)因素之一。

同時(shí)缺氧調(diào)控HIF-1α激活的分子機(jī)制中，部分學(xué)者認(rèn)為HIF-1α在轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)控[9]，部分學(xué)者認(rèn)為HIF-1α在轉(zhuǎn)錄時(shí)進(jìn)行調(diào)控[10]。在氯化鈷模擬體外缺氧環(huán)境的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)：缺氧環(huán)境狀態(tài)下的HIF-1α mRNA表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，而蛋白水平卻明顯升高，這個(gè)結(jié)果與Kuiper學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，證明缺氧調(diào)控HIF-1α發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后。然而RSUME和HIF-1α之間的相互作用機(jī)制尚不清楚。

為了闡明垂體腺瘤中RSUME對(duì)HIF-1α的調(diào)控作用，本研究繼續(xù)通過運(yùn)用siRNA下調(diào)RSUME和HIF-1α的表達(dá)，結(jié)果顯示通過抑制HIF-1α的表達(dá)，RSUME無論在mRNA的表達(dá)水平，還是在蛋白的表達(dá)水平上均未見明顯改變。但當(dāng)運(yùn)用siRNA抑制RSUME表達(dá)，HIF-1α的mRNA表達(dá)水平無明顯改變，但HIF-1α蛋白的表達(dá)水平明顯下降。由此可見，RSUME可調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)影響垂體腺瘤的生長(zhǎng)及侵襲，同時(shí)進(jìn)一步證明RSUME在垂體腺瘤中對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)的影響主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后。

RSUME最先由Carbia-Nagashima等[11]發(fā)現(xiàn)，并在小腦、垂體、心、腎、肝、胃、胰腺、前列腺和脾中檢測(cè)出有較高的表達(dá)。Carbia-Nagashima等[14]曾提出，RSUME可成為腫瘤治療新的靶點(diǎn)，但未進(jìn)行相關(guān)研究。本研究通過siRNA抑制RSUME的表達(dá)，檢測(cè)垂體腺瘤細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示：RSUME siRNA轉(zhuǎn)染的AtT-20細(xì)胞的侵襲能力有所抑制，侵襲抑制率（%）=26.2%±8.4%。

垂體腺瘤的侵襲受多方面因素的影響，缺氧導(dǎo)致新生血管的形成為垂體腺瘤侵襲的主要因素，而HIF-1α在此過程尤其重要。然而HIF-1α僅僅為腫瘤侵襲過程中重要因素之一，因此垂體腺瘤的基因治療需要進(jìn)一步了解其作用機(jī)制，本研究證明RSUME可通過穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)垂體腺瘤血管新生，影響腫瘤侵襲性。

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2015-01-25）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.06.009

☆ 江西省自然科學(xué)基金（20142BAB205032）；江西省教育廳科學(xué)基金（編號(hào)：GJJ14064）；江西省科技廳科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：20133BBG70072）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30760258）

* 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（南昌330006）