補(bǔ)腎利濕法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清MMP-7影響的實(shí)驗(yàn)研究

姜德友 ，鄒 麗，隋方宇，陳 飛，喬 羽，李富震，李文昊，韓潔茹

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040)

痛風(fēng)是因嘌呤代謝紊亂及尿酸排泄障礙導(dǎo)致血尿酸升高，尿酸鹽結(jié)晶沉著于關(guān)節(jié)及其他組織而引起病損及炎癥反應(yīng)的一種疾?。?-3］。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎則是由于血清及體液中尿酸升高，至尿酸鹽結(jié)晶沉著于各種間葉組織中，當(dāng)關(guān)節(jié)受累時而發(fā)?。?］。本研究采用尿酸鈉聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，分別用痛風(fēng)舒片、秋水仙堿片、補(bǔ)腎利濕法中藥復(fù)方進(jìn)行干預(yù)，測量急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清MMP-7含量，探索補(bǔ)腎利濕法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎防治機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性SD大鼠84只，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK(黑)2013004，飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，相對濕度:40%-45%，通風(fēng)良好，環(huán)境適宜。補(bǔ)腎利濕法處方為姜德友教授經(jīng)驗(yàn)方(熟地、山茱萸、懷牛膝等)［5］，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房一次性選購。痛風(fēng)舒片(車前子、澤瀉、防己、牛膝)購于湖北綠金子藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號:140301。秋水仙堿片購于西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號140807。氧嗪酸鉀鹽購于美國 Sigma公司，批號:CAS2207-75-2。微晶尿酸鈉結(jié)晶購于美國 Sigma公司，批號:CAS1198-77-2。大鼠血清UA、MMP-7 Elisa試劑盒購于北京誠森生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號:201501。電子天平(梅特勒公司，型號:AL204)、高速臺式離心機(jī)(貝克曼公司，型號:X-22R)、恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒，型號:DHG-9140A)、酶標(biāo)儀(基因有限公司，型號:synergyH7)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液制備 尿酸鈉懸濁液制備:將微晶尿酸鈉結(jié)晶加入滅菌注射用水，配制成0.1 g/mL尿酸鈉懸濁液。氧嗪酸鉀溶液制備:將3 g的氧嗪酸鉀晶體溶解于97 mL的滅菌注射用水中，加熱攪拌，配制成3%氧嗪酸鉀溶液［6］。秋水仙堿混懸液的制備:將秋水仙堿片研末，配置成0.028 mg/mL的秋水仙堿混懸液，4℃保存?zhèn)溆?。痛風(fēng)舒混懸液制備:將痛風(fēng)舒片研末，配置成0.029 g/mL的痛風(fēng)舒片混懸液，4℃保存?zhèn)溆?。補(bǔ)腎利濕法中藥復(fù)方溶液制備:補(bǔ)腎利濕法中藥復(fù)方藥液由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，于60℃水浴中濃縮成含生藥1、2、4 g/mL藥液，高溫消毒裝瓶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組及給藥方法 將84只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為7組:空白組、模型組、中藥對照組、西藥對照組、中藥復(fù)方低、中、高劑量組，每組12只［7］。以每100 g大鼠體質(zhì)量灌胃1 mL為標(biāo)準(zhǔn)?？瞻捉M、模型組分別灌胃生理鹽水;中藥對照組灌胃痛風(fēng)舒混懸液;西藥對照組灌胃秋水仙堿混懸液;中藥復(fù)方低、中、高劑量組分別灌胃補(bǔ)腎利濕法中藥復(fù)方溶液(含生藥劑量依次為10、20、40 g/kg);每日1次，連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃1 h后造模。

2.3 造模方法 空白組按3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射生理鹽水，15 min后用BD針將0.2 mL生理鹽水從大鼠右膝關(guān)節(jié)外側(cè)以30°～40°向內(nèi)斜插入并注入膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。其余各組用3%氧嗪酸鉀溶液按3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射，15 min后用BD針在大鼠右膝關(guān)節(jié)外側(cè)以30°～40°向內(nèi)斜插入至膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，將0.2 mL尿酸鈉溶液注入到膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)［8］。

2.4 標(biāo)本采集及測量 血清指標(biāo)采集及測定:各組造模4 h后眶下取血，隨即處死。全血室溫靜置1 h后，4 000 r/min離心10 min，分離血清。按ELISA試劑盒說明書測定大鼠血清中UA及MMP-7含量。病理組織檢測:取大鼠右膝關(guān)節(jié)滑膜組織，95%乙醇溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察滑膜組織病理變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 17.0軟件分析，若數(shù)據(jù)屬于正態(tài)分布、方差相齊則采用單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn);否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示。

3 結(jié)果

3.1 病理組織觀察 空白組滑膜細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊。模型組滑膜組織內(nèi)見有尿酸鹽結(jié)晶體，其周圍見大量中性粒細(xì)胞浸潤，滑膜組織明顯水腫、炎性滲出;與空白組比較，模型組大鼠血尿酸水平明顯升高(P＜0.01)，提示造模成功。中藥對照組滑膜組織仍見水腫、壞死、大量中性粒細(xì)胞浸潤，但滲出減輕。西藥對照組滑膜組織仍見有輕度炎性滲出及水腫，但有血管增生。中藥低劑量組滑膜組織仍有水腫與炎性滲出，大量中性粒細(xì)胞浸潤。中藥中劑量組滑膜組織有水腫，但無滲出及炎細(xì)胞浸潤。中藥高劑量組滑膜組織有炎細(xì)胞浸潤，水腫減輕，滲出減輕(見圖1)。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)報(bào)告(HE染色，×400)

3.2 MMP-7含量測定 模型組與空白組比較大鼠血清MMP-7含量水平顯著升高(P＜0.01);中藥對照組，西藥對照組，復(fù)方中藥低、中、高劑量組大鼠血清MMP-7含量均較模型組顯著降低(P＜0.01)，提示各組藥物均可降低其含量;復(fù)方中藥中劑量組與中藥對照組、復(fù)方中藥低、高劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但與西藥對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

表1 不同治療方法對各組大鼠血清中MMP-7水平影響(珋x±s，n=11)

4 討論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是尿酸鹽在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織沉積后引起的急性炎癥反應(yīng)［9］。我國目前關(guān)于其致病指標(biāo)主要以白介素、前列腺素等居多，雖然MMP-7作為一個常規(guī)的腫瘤研究指標(biāo)［10］，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生也有緊密聯(lián)系。MMP-7是一種基質(zhì)溶解素，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞中，在正常黏膜上皮細(xì)胞中為弱表達(dá)或不表達(dá)，在基質(zhì)細(xì)胞中則不表達(dá)［11］，為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)成員之一。在生物學(xué)行為上，MMPs與炎癥、基質(zhì)降解、細(xì)胞生長、血管新生、腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲等都有密切關(guān)系［12］。此外，MMPs家族成員一般由5個功能不同的結(jié)構(gòu)域組成［13］，其中的類血紅蛋白結(jié)合區(qū)與酶的底物特異性有關(guān)。與其他的MMPs相比，由于MMP-7缺乏C-末端血紅素樣結(jié)構(gòu)，不含類血紅素結(jié)合區(qū)，因而具有更為廣泛的底物特異性和基質(zhì)降解功能。在正常軟骨中，軟骨細(xì)胞會把合成的大量II型膠原、蛋白多糖(PG)等物質(zhì)分泌到細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中，構(gòu)成細(xì)胞外纖維網(wǎng)架，給細(xì)胞提供支持與保護(hù)［14］，而這些物質(zhì)最終在基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的作用下降解。當(dāng)病變時，病變滑膜分泌大量的蛋白酶(包括基質(zhì)金屬蛋白酶等)，而MMP-7是促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的重要酶類，因其具有強(qiáng)大的底物降解功能，它的增多導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨MMPs/TIMPs平衡遭到破壞，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。同時MMPs在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中介導(dǎo)了炎癥細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)。并據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，MMP-7主要由腺上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等分泌。而腺上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞是參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)的主要部分之一。據(jù)報(bào)道，這些炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎性體在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用。并且有研究表明，MMP-7可參與宿主自身的防御，促使迅速釋放腫瘤壞死因子，從而啟動了間質(zhì)炎癥反應(yīng)［11］。本研究結(jié)果可以看到模型組大鼠血清MMP-7濃度明顯高于空白組(P＜0.01)，提示MMP-7可能參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期的發(fā)病過程，所以推測其作為一個炎性指標(biāo)與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有著緊密聯(lián)系。且大鼠血清中MMP-7的含量變化，與病理組織炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)性。

中醫(yī)學(xué)將痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎歸屬于“歷節(jié)病”“熱痹”“白虎病”等范疇。臨床表現(xiàn)為發(fā)病急驟、受累關(guān)節(jié)明顯紅腫熱痛、晝輕夜重、疼痛劇烈難忍、足不能履地。本病病機(jī)為素體感受風(fēng)濕熱邪，郁而化熱，或飲食不節(jié)，偏嗜高粱厚味［15］，導(dǎo)致濕熱內(nèi)盛，壅滯經(jīng)絡(luò)，流注關(guān)節(jié)，使關(guān)節(jié)紅腫熱痛。目前臨床大多采用秋水仙堿或其他糖皮質(zhì)激素類藥物進(jìn)行治療，但此類藥物的運(yùn)用常伴有惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道等不良反應(yīng)。姜德友教授根據(jù)自身多年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎以腎虛為本，濕邪為標(biāo)，乃本虛標(biāo)實(shí)之證，因此確立了補(bǔ)腎利濕法治療本病。補(bǔ)腎利濕法中藥復(fù)方重用熟地黃以補(bǔ)血滋腎，益精填髓;山茱萸入肝腎二經(jīng)，氣溫而主補(bǔ)，味酸而主斂，故精氣益而腰膝強(qiáng)也。且山茱萸既可補(bǔ)陰又可補(bǔ)陽，為平補(bǔ)肝腎之品，與熟地合用，取肝腎同源之說;山藥，脾腎同補(bǔ)，補(bǔ)腎固精，且補(bǔ)脾以助后天生化之源。清末張錫純對此藥更是推崇備至，在其醫(yī)學(xué)專著《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中曾屢用山藥。其言:“山藥之性，能滋陰又能利濕，能滑潤又能收澀。是以能補(bǔ)肺、補(bǔ)腎、兼補(bǔ)脾胃?！笔斓攸S、山茱萸、山藥三藥相伍，肝脾腎同補(bǔ)，起到“三陰并補(bǔ)”之效。澤瀉，利濕泄?jié)?，并防熟地之滋膩。在《藥鑒》中曾記載:“澤瀉……主分利小水之捷藥也。又能除濕……仲景八味丸用之，亦不過接引諸藥歸于腎經(jīng)耳?！避蜍叩瓭B以利濕，《本草疏證》謂其“能排臟腑、廓肌膚之諸水”。萆絯有祛風(fēng)利濕之效。《藥品化義》:“萆絯，性味淡薄，長于滲濕，帶苦亦能降下，主治風(fēng)寒濕痹?！芭Ｏト⊙a(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，活血通經(jīng)引血下行，利尿通淋之效，可使諸藥引經(jīng)下行于關(guān)節(jié)處?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》:“牛膝，原為補(bǔ)益之品，而善引氣血下注，是以用藥欲其下行者，恒以之為引經(jīng)。故善治腎虛腰疼腿疼，或膝疼不能屈伸，或腿痿不能任地?！贝藥孜端幬锖嫌?，共奏補(bǔ)腎利濕，通絡(luò)化瘀之功。血脈通，濕氣除，則筋脈得以舒養(yǎng)，故對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有很好的防治作用。

［1］林懋賢.風(fēng)濕病診療手冊［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:125.

［2］羅明，萬雷，賴圓圓，等.黃宏興教授治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎［J］.吉林中醫(yī)藥，2014，34(1):26-28.

［3］潘靜，馬威，管競環(huán).歸經(jīng)當(dāng)歸拈痛湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎［J］.吉林中醫(yī)藥，2013，33(12):1240-1242.

［4］鄭志永，齊雨.中醫(yī)辨證治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎 72例［J］.吉林中醫(yī)藥，2003，23(3):21.

［5］姜德友，王鈞，解穎，等.補(bǔ)腎利濕法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清 IL-18、TNF-α的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2013(11):2186-2187.

［6］韓潔茹，解穎，高恩宇，等.補(bǔ)腎利濕法防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］.四川中醫(yī)，2011，29(4):26-28.

［7］姜德友，劉爽，韓潔茹，等.補(bǔ)腎利濕法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠VEGF表達(dá)水平的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013(24):236-239.

［8］姚麗，劉樹民，于書儀.痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型的改良［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2009(3):210-212，248.

［9］嚴(yán)立平，周正球.清熱利濕方治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎38例臨床觀察［J］.吉林中醫(yī)藥，2012，32(6):600-601.

［10］LI Y J，WEI Z M，MENG Y X，et al.B-catenin up-regulates the expression of cyclinD1，c-myc and MMP-7 in human pancreatic Cancer:relationships with carcinogenesis and metastasis［J］.World Journal of Gastroenterology:WJG，2005(11):2117-2123.

［11］MORI M，BARNARD G F，MIMORI K，et al.Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas［J］.Cancer，1995，75(6):1516-1519.

［12］II M，YAMAMOTO H，ADACHI YASUSHI，et al.Role of matrix metalloproteinase-7(matrilysin)in human Cancer invasion，apoptosis，growth，and angiogenesis［J］.Experimental Biology and Medicine(Maywood，N.J.)，2006，231(1):20-27.

［13］陳華江，王杰軍.基質(zhì)金屬蛋白酶的結(jié)構(gòu)及其調(diào)節(jié)機(jī)制［J］.國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊)，2001，01(1):20-23.

［14］Pelletier.Selective inhibition of inducible nitric oxide syndiase in experimental oateoarthritis is asso-ciated with reduction in tissue levels of catabolic factors［J］.Rheum atol 190(26):2002-2014.

［15］潘朝榮，付波.四妙姜虎湯治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床觀察［J］.吉林中醫(yī)藥，2012，32(8):812-813.