青蒿素對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵和微生物氮素微循環(huán)的影響

王洪榮，秦韜，王超

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

青蒿素對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵和微生物氮素微循環(huán)的影響

王洪榮1，秦韜1，王超2

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

0 引言

青蒿素為菊科植物青蒿的主要活性成分之一，具有高效低毒的抗瘧、抗腫瘤和抗血吸蟲等功效。青蒿是中國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一,它主要生長(zhǎng)在西南地區(qū)。青蒿素類藥是中國(guó)科學(xué)家利用傳統(tǒng)中草藥自主研制的抗瘧特效藥。它也是一種天然綠色的提取物，其自身具有抗寄生蟲、提高免疫力的功能。青蒿素也可以作為一種綠色飼料添加劑應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。近年來，在動(dòng)物生產(chǎn)上將它主要用作抗寄生蟲藥物[1]，在家禽飼養(yǎng)上主要用于抗球蟲。戴和斌等報(bào)道高劑量或中劑量青蒿素對(duì)球蟲有高效的抗性[2]。潘存霞等研究表明，在兔日糧中添加青蒿提取物能明顯提高幼兔的生長(zhǎng)速度[3]。秦韜等在國(guó)內(nèi)首次采用人工瘤胃法研究了青蒿素對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)、原蟲數(shù)量及產(chǎn)氣量的影響，發(fā)現(xiàn)青蒿素可調(diào)控瘤胃中原蟲數(shù)量和氨態(tài)氮濃度[4]。目前，中國(guó)在發(fā)展反芻動(dòng)物生產(chǎn)中，一方面受到蛋白質(zhì)飼料資源緊缺的限制，另一方面也存在反芻動(dòng)物對(duì)含氮資源利用效率偏低的問題。因此，通過瘤胃調(diào)控最大限度地提高反芻動(dòng)物體內(nèi)氮素利用效率，減少飼料中氮源隨動(dòng)物糞、尿的排出數(shù)量，提高動(dòng)物對(duì)飼料蛋白的利用效率是反芻動(dòng)物生產(chǎn)的重要課題。鑒于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)茶皂素、絲蘭皂苷等植物提取物作為反芻動(dòng)物的瘤胃調(diào)控劑進(jìn)行了許多研究[5-7]，但對(duì)青蒿素在反芻動(dòng)物中應(yīng)用研究很少，而它又是一種非常有潛力的瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑。因此，本研究探討青蒿素對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵、瘤胃內(nèi)環(huán)境及其瘤胃微生物蛋白質(zhì)循環(huán)等影響。確定青蒿素對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵調(diào)控作用的效果和適宜添加量，為青蒿素作為一種新的提高飼料蛋白質(zhì)利用效率的瘤胃調(diào)控劑在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2010年4月在揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

選用4只健康、體重為（23.3±0.6）kg安裝永久性瘤胃瘺管的成年徐淮白山羊羯羊，統(tǒng)一驅(qū)蟲，單圈飼養(yǎng)，每日按體重的2%干物質(zhì)量給料，每日8:00和20:00分兩次等量飼喂，自由飲水。飼喂由用玉米和豆粕為主要原料組成的混合精料，以羊草為粗飼料，按精粗比為2∶8配制飼糧，具體配方為玉米11.05%，豆粕5.95%，羊草80%，石粉0.7%，磷酸氫鈣0.8%，食鹽0.5%，添加劑1%；日糧的營(yíng)養(yǎng)水平為粗蛋白質(zhì)9.25%，粗脂肪3.38%，中性洗滌纖維47.21%，代謝能14.13 MJ·kg-1。青蒿素購(gòu)買自上海泰鑫精細(xì)化工公司，采用萃取法制成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用4×4拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，整個(gè)試驗(yàn)分4期，每期預(yù)試期15 d，正試期10 d。預(yù)試期內(nèi)動(dòng)物自由采食，測(cè)定每天的采食量；在正試期內(nèi)，根據(jù)預(yù)試期測(cè)定的采食量，以調(diào)節(jié)到維持飼養(yǎng)水平的1.2倍。在基礎(chǔ)日糧中添加3個(gè)水平的青蒿素，其中A為對(duì)照組，不添加青蒿素；B組添加0.2%的青蒿素；C添加0.4%的青蒿素，D組添加0.6%的青蒿素。

1.2.2 樣品的采集

在正試期間，在每一期的正試期的第3天開始采集瘤胃液，在晨飼前通過瘤胃瘺管，利用自制真空負(fù)壓裝置，從4只山羊瘤胃內(nèi)分別采取瘤胃液各250 mL，經(jīng)過4層紗布過濾，濾液裝于事先通有CO2的滅菌生理鹽水瓶中，混合均勻，39℃水浴保溫。在飼喂前（0 h），飼喂后2、4、6、8、10和12 h分別采集瘤胃液30 mL，連續(xù)采集3 d，每次取樣15～20 mL，采樣后立即測(cè)定pH和原蟲計(jì)數(shù)，然后將其余樣品置于-20℃冷凍保存。

1.2.3 吞噬試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

1.2.3.1 無菌瘤胃液制備

對(duì)每期每只試驗(yàn)羊采集瘤胃食糜，離心（29000×g，20 min），收集上清瘤胃液并分別編號(hào)，4℃保存，一周內(nèi)使用。

1.2.3.2 熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌的制備

1）采集瘤胃液，過2 μm 濾布，濾液離心（22 000×g，15min），收集沉淀，用滅菌生理鹽水清洗和離心各兩遍，然后懸浸于滅菌生理鹽水中；2）加1.5～2 mL三氯三嗪基氨基熒光素（5- ([4,6-Dichlorotriazin-2-yl]amino) fluorescein hydrochloride，DTAF）染料進(jìn)行染色，60℃水浴2 h；3）離心（22000×g，15 min），將上層DTAF 溶液倒出，再用滅菌生理鹽水洗滌和離心各3遍；之后懸浸于與取樣同體積的滅菌生理鹽水中，-20℃保存，每期試驗(yàn)采樣期內(nèi)使用；4）用時(shí)解凍并離心（22000×g，15 min）后，分別用對(duì)應(yīng)編號(hào)的無菌瘤胃液懸浸制成2倍濃度的熒光標(biāo)記細(xì)菌（FLB）懸液。

1.2.3.3 操作步驟

1）采集瘤胃液，80目濾布過濾瘤胃液；2）濾液離心（150×g，10 min），并用無菌生理鹽水洗滌原蟲2次，用樣品一半體積相應(yīng)編號(hào)的無菌瘤胃液懸浸；3）將樣品置于培養(yǎng)瓶中，設(shè)置盡量與瘤胃內(nèi)一樣的條件（39℃水浴、厭氧、50 r/min搖床）恢復(fù)培養(yǎng)30 min；4）吞噬實(shí)驗(yàn)：加等體積相應(yīng)編號(hào)的2倍濃縮的FLB開始試驗(yàn)。在攝食后2、5、10、15、20、25、30、35、40和50 min用微型吸管分別吸取少量液體滴在載玻片上，加等量的甲醛固定，蓋蓋玻片馬上鏡檢；5）先在普通顯微鏡下（100～400×）觀察原蟲形態(tài)，然后在1000×油鏡下轉(zhuǎn)置熒光背景對(duì)原蟲體內(nèi)的FLB 計(jì)數(shù)，觀察原蟲的總個(gè)體為6個(gè)，取平均值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)另外設(shè)3個(gè)平行對(duì)照組，再取平均值。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.4.1 pH測(cè)定

用便攜式pH 計(jì)（pHS-3C，上海雷磁試驗(yàn)設(shè)備廠）于采樣后立即測(cè)定。

1.2.4.2 氨態(tài)氮（NH3-N）濃度的測(cè)定

采用酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測(cè)定[9]。瘤胃液經(jīng)1000 r/min離心5 min，取上清測(cè)定。A試劑（苯酚試劑）：稱取苯酚9.975 g，亞硝基鐵氰化鉀50.65 mg，溶于H2O中，定容至1000 mL，放于棕色瓶中；B試劑（次氯酸鈉試劑）：稱取NaOH 5 g，溶于水中，待其冷卻后加入20 mL次氯酸鈉，混勻，定容至1000 mL。取瘤胃液4000 g離心10 min，取其50 μL上清液于10 mL試管中，依次加入A試劑和B試劑各3 mL，混合均勻，于60℃水浴10 min，冷水冷卻，在紫外分光光度計(jì)546 nm比色，同時(shí)，用NH4Cl標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)上述步驟，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度測(cè)定

用日本島津GC-9A氣相色譜儀按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定[10]。瘤胃液處理：瘤胃液經(jīng)10000×g離心10 min后取上清液1 mL加0.2 mL 20%含60 mmol·L-1巴豆酸的偏磷酸，混勻后高速離心取上清液0.4 μL進(jìn)樣分析。測(cè)定條件：毛細(xì)管柱CP-WAX（長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1 μm）；氣化室溫度200℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度200℃；柱溫采用程序升溫法，初溫100℃，末溫150℃，升溫速率3℃·min-1，靈敏度為101，衰減為25，以巴豆酸為內(nèi)標(biāo)物。

1.2.4.4 微生物蛋白（MCP）的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]的方法，取分離微生物樣品經(jīng)22000×g，離心10 min，棄上清液加入5 mL 10%三氯乙酸（TCA），混勻后置室溫30 min，離心（6000×g，10 min），棄上清液再加入5 mL 5%NaOH混勻溶解后，離心（6000×g，10 min），取上清液用756型紫外光分光度計(jì)測(cè)定OD280nm和OD260nm值。

計(jì)算公式：MCP（mg·mL-1）=（1.45×OD280-0.740×OD260）×D。式中D為稀釋倍數(shù)。

1.2.4.5 可溶性蛋白（SP）的測(cè)定

采用考馬斯亮蘭法（bradford法）取4 mL瘤胃液，于SKL快速混勻器振蕩1 min后，經(jīng)4℃ 20000×g離心（HitachiHimac SCR 20BC）20 min后，取上清液3 mL加入終濃度為0.15 mol·L-1高氯酸，靜置20 min，再經(jīng)4℃ 20000×g離心20 min，取沉淀用3 mL 2 mol·L-1NaOH水解，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)可溶性蛋白[13]。

1.2.4.6 瘤胃液肽含量的測(cè)定

根據(jù)Chen等[8,14]改進(jìn)的方法將瘤胃液樣品解凍、混勻，取出1 mL于10 mL試管中，加入3 mL10% TCA，混勻后靜置15 min，3500 r/min 離心15 min，取上清液1 mL，加雙縮脲試劑5 mL，充分混勻，室溫靜置30 min，540 nm測(cè)定吸光度值。

1.2.4.7 原蟲計(jì)數(shù)

用細(xì)滴管取少量新鮮瘤胃液均勻地涂在血球計(jì)數(shù)板上，以MFS染液（NaCl 8 g，甲基綠0.6 g，福爾馬林溶液100 mL，定容至1000 mL）染色，將血球計(jì)數(shù)板放在普通顯微鏡的光鏡下計(jì)數(shù)（100×，400×）。很據(jù)不同屬的原蟲形態(tài)特征進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。計(jì)算公式：原蟲數(shù)個(gè)/mL= N/4×D×16×10×1000 = N×D×4×104。中，N：計(jì)數(shù)的4個(gè)中方格的總數(shù)；D：稀釋倍數(shù)。

1.2.4.8 細(xì)菌計(jì)數(shù)

以結(jié)晶紫溶液染色和做倍比稀釋，用計(jì)數(shù)板在油鏡下計(jì)數(shù)（1000×）。計(jì)算公式：細(xì)菌數(shù)個(gè)/mL=N/S×D×16×10×1000=N/S×D×16×104。式中，N：計(jì)數(shù)方格的總數(shù)；S：計(jì)數(shù)方格數(shù)；D：稀釋倍數(shù)。

1.2.4.9 細(xì)菌真蛋白和原蟲真蛋白的測(cè)定方法

取瘤胃液加等體積生理鹽水39℃水浴震蕩（125 r/min）培養(yǎng)60 min，并輔以攪拌；再經(jīng)4層紗布過濾，濾液離心（150×g，10 min），收集沉淀為原蟲，用生理鹽水洗滌兩次后用生理鹽水懸浮，-20℃貯存待測(cè)。收集離心后上清液，再經(jīng)過冷凍高速離心（22000×g，15 min），收集沉淀為細(xì)菌。將離心收集的細(xì)菌和原蟲分開制成凍干樣品，然后用全量凱氏定氮法測(cè)定氣真蛋白含量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)分4個(gè)處理，4頭動(dòng)物進(jìn)行4期有重復(fù)測(cè)定的方差分析，若處理間差異顯著，再采用Duncan’s法分別在0.05和0.01水平進(jìn)行差異顯著性多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同添加水平的青蒿素對(duì)瘤胃液pH的影響

不同添加水平的青蒿素對(duì)瘤胃液pH的影響見表1。由表1可見，A、B、C、D 4組pH值的變化范圍分別是6.85～7.16、6.92～7.13、6.87～7.13和6.91～7.14。各試驗(yàn)組與對(duì)照組的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律相似，采食2 h后各組的pH值都下降，除A組在4 h繼續(xù)有小幅下降，其余各組緩慢回升，各組在4 h后都呈上升趨勢(shì)，到12 h時(shí)基本都與飼喂前的水平相近。且在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組之間差異都不顯著（P>0.05）。從pH的均值來看，A、B、C、D的均值分別為6.93、6.99、6.99和7.00，添加青蒿素組與對(duì)照組相比具有提高瘤胃pH的趨勢(shì)，但各組之間差異都不顯著（P>0.05）。

2.2 不同添加水平青蒿素對(duì)瘤胃液NH3-N濃度的影響

不同添加水平青蒿素對(duì)瘤胃液NH3-N濃度的影響見表2。由表2可見，A、B、C、D組NH3-N濃度的變化范圍為10.27～14.64、10.10～13.63、8.65～13.39和9.66～13.26 mg·100 mL-1。從NH3-N濃度的平均值來看，各組間差異都不顯著（P>0.05），但各試驗(yàn)組的NH3-N濃度都低于對(duì)照組，B、C、D組分別比對(duì)照組下降了3.4%、11%和7%。平均值A(chǔ)verage 11.67±0.66 11.27±0.59 10.41±0.72 10.90±0.59從不同時(shí)間NH3-N濃度的變化圖1可以看出，各試驗(yàn)組與對(duì)照組的變化趨勢(shì)大體一致。A、B、C、D組NH3-N濃度均在采食2 h時(shí)達(dá)到最高，然后呈下降回升波動(dòng)的趨勢(shì)，在12 h時(shí)又有所回升。其中，6 h時(shí)后C組極顯著低于A組和B組（P<0.01），D組顯著低于B組（P<0.05）；在8 h時(shí)C組和D組顯著低于A組（P<0.05）。

2.3 不同添加水平青蒿素對(duì)瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量及乙酸/丙酸的影響

不同添加水平青蒿素對(duì)瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量百分含量及乙酸/丙酸的影響見表3。試驗(yàn)組乙酸比例的平均值與對(duì)照組相比，隨著青蒿素的增加，乙酸比例呈下降的趨勢(shì)，B、C兩組顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；從丙酸比例的平均值來看，B組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），C、D組高于對(duì)照組，且差異極顯著（P<0.01）。試驗(yàn)組的丁酸比例，C、D組顯著低于A、B組（P<0.05）。青蒿素對(duì)乙酸/丙酸比值影響從乙酸/丙酸的平均值來看，試驗(yàn)組都低于對(duì)照組，其中B組顯著低于A組，C、D組極顯著低于A組（P<0.01）。

2.4 不同添加水平青蒿素對(duì)瘤胃液可溶蛋白濃度和微生物蛋白的影響

不同添加水平青蒿素對(duì)瘤胃液可溶蛋白濃度、微生物蛋白的影響見表4。由表4可知，添加青蒿素可降低瘤胃培養(yǎng)液中可溶蛋白量，且C、D組與A、B組之間差異極顯著（P<0.01），B與A組差異顯著（P<0.05）。B、C、D組比對(duì)照組A組分別提高14.5%、23.4%和27.1%。由表5可見，原蟲蛋白含量均隨青蒿素添加量的增加而減少，其中B組比A組減少了0.08 mg·mL-1，差異顯著（P<0.05）。C、D兩組比A組都減少了0.19 mg·mL-1、差異極顯著（P<0.01）。另外還可見，添加青蒿素可提高瘤胃中的細(xì)菌蛋白，對(duì)照組的細(xì)菌蛋白為0.56 mg·mL-1，各試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，分別提高了細(xì)菌蛋白產(chǎn)量，其中B、C兩組比對(duì)照組都提高了25%，差異顯著（P<0.05）。D組比對(duì)照組A組提高34%，差異極顯著（P<0.01）。對(duì)照組的MCP為1.34 mg·mL-1，低于B組。

2.5 青蒿素對(duì)山羊瘤胃主要種屬原蟲結(jié)構(gòu)的影響

青蒿素對(duì)山羊瘤胃主要種屬原蟲結(jié)構(gòu)的影響見表5，隨著青蒿素添加量的增加，細(xì)菌總數(shù)增加，而原蟲總數(shù)逐漸減少，其中內(nèi)毛蟲和雙毛蟲的數(shù)量降低，而等毛蟲的數(shù)量增加。B組原蟲數(shù)顯著低于A組（P<0.05），C、D兩組極顯著低于A組（P<0.01）。C、D兩組的內(nèi)毛蟲數(shù)量顯著低于A組（P<0.05），而雙毛蟲與等毛蟲的比例顯著高于A組（P<0.05），B組的內(nèi)毛蟲、雙毛蟲和等毛蟲與其他各組相比差異均不顯著（P>0.05）。從表2中可以見添加青蒿素組的內(nèi)毛蟲比例顯著降低（P<0.05），使雙毛蟲和等毛蟲比例顯著提高（P<0.05）。

2.6 不同青蒿素添加量對(duì)山羊瘤胃原蟲的細(xì)菌吞噬速率和微生物蛋白循環(huán)影響

由表6可知標(biāo)記10 min以后，原蟲的吞噬速率開始降低，此時(shí)原蟲已經(jīng)開始消化細(xì)菌，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，瘤胃原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬速率會(huì)與消化速率保持平衡，甚至吞噬速率會(huì)低于消化速率，通過數(shù)據(jù)處理與分析，綜合考慮后將原蟲的吞噬速率計(jì)算時(shí)間定到25 min，以減少原蟲消化帶來的誤差。如表6所示在25 min內(nèi)吞噬量逐漸上升，尚未達(dá)到下滑期，此時(shí)在該時(shí)間段之內(nèi)吞噬試驗(yàn)結(jié)果的可靠性較高。

對(duì)原蟲的吞噬量與時(shí)間進(jìn)行25 min內(nèi)線形回歸分析，兩組回歸方程分別為：

A組：Y=2.05+5.301X（R=0.99）；B組：Y=0.5+5.224X（R=0.99）；C組：Y=-1.716+5.112X（R=0.99）；D組：Y= 0.7+4.624X（R=0.99）。式中：Y為原蟲吞噬細(xì)胞量，X為吞噬時(shí)間。

由回歸直線方程可計(jì)算原蟲的吞噬速率A組、B組、C組、D組分別為：320.11、313.94、305.00、278.14cells/（cell·h）。

2.7 不同青蒿素添加量對(duì)原蟲吞噬細(xì)菌后瘤胃微生態(tài)的影響

瘤胃液中原蟲的密度見表7，青蒿素添加量為0.6%時(shí)，D組最低，而對(duì)照組最高；在本試驗(yàn)中，各組原蟲密度隨著青蒿素添加量的增加而減少，瘤胃液中細(xì)菌的密度在青蒿素添加量為0.6%時(shí)，D組最高，在不添加時(shí)，對(duì)照組A組密度最小。A、B、C、D四組吞噬速率分別為：320.11、313.94、305.00和278.14 cells/（cell·h）。當(dāng)添加0.2%的青蒿素時(shí)，差異不顯著（P>0.05），當(dāng)添加0.4%和0.6%的青蒿素時(shí)，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）。根據(jù)原蟲的密度計(jì)算原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬量結(jié)果（見表7），以D組最低，為386.84×105cells/（cell·h），A組最高為752.26×105cells/（cell·h）。結(jié)合細(xì)菌的密度再計(jì)算由于原蟲吞噬造成的細(xì)菌蛋白循環(huán)的周轉(zhuǎn)時(shí)間和周轉(zhuǎn)率，結(jié)果表明：以D組周轉(zhuǎn)率最低為1.1%（每小時(shí)約有1.1%的細(xì)菌被原蟲吞噬），周轉(zhuǎn)時(shí)間最長(zhǎng)為96.03 h（即原蟲吞噬經(jīng)過96.03 h細(xì)菌可周轉(zhuǎn)更新一輪）；以A組周轉(zhuǎn)率最高為2.6%，周轉(zhuǎn)時(shí)間最短為39.08 h。

不同青蒿素添加量對(duì)原蟲吞噬細(xì)菌引起瘤胃內(nèi)MCP微循環(huán)發(fā)生變化。瘤胃原蟲的密度以A組最高，D組最低；A、B、C、D四組吞噬速率分別為：320.11、313.94、305.00和278.14 cells/（cell·h）。根據(jù)原蟲的密度計(jì)算原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬量分別為：752.26×105、586.13×105、442.26×105和386.84×105cells/（mL·h）。

由此可以計(jì)算得出A組、B組、C組、D組吞噬N速率分別為：1.729、1.695、1.647和1.502 pg N/（cell·h），即是原蟲在瘤胃內(nèi)循環(huán)中對(duì)細(xì)菌N的吞噬速率。每天每頭羊因原蟲的吞噬細(xì)菌N量估計(jì)為：A組：82.97 mg N/（d·頭）；B組：81.37 mg N/（d·頭）；C組：79.06 mg N/（d·頭）；D組：72.09 mg N/（d·頭）。如換算為微生物蛋白后，A組、B組、C組、D組微生物蛋白內(nèi)循環(huán)量分別為：518.58、508.58、494.11和450.59 mg Pr/（d·頭）。

3 討論

3.1 青蒿素對(duì)瘤胃發(fā)酵和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)的影響

評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵效率一般采用瘤胃液中酸度、氨氮濃度、瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量和微生物蛋白產(chǎn)量等內(nèi)環(huán)境指標(biāo)。pH是一項(xiàng)反映瘤胃發(fā)酵水平的綜合指標(biāo)，是維持瘤胃微生物正常生長(zhǎng)繁殖的重要條件。它受日糧性質(zhì)、唾液分泌及瘤胃內(nèi)酸、堿性物質(zhì)排出、吸收的影響[15-16]。pH的正常變動(dòng)范圍為6.5～7.5，當(dāng)pH低于下限時(shí)，瘤胃內(nèi)的微生物活力降低，數(shù)量減少或完全被酸性環(huán)境殺死，酸度升高將增加瘤胃酸中毒的機(jī)會(huì)，對(duì)機(jī)體生理機(jī)能有很大的影響[17]。一般情況下，采食后瘤胃pH下降，而后逐漸升高，瘤胃pH呈波動(dòng)和變化，pH的波動(dòng)曲線反映集聚的有機(jī)酸和產(chǎn)生唾液的變化。一般在飼喂后2～6 h達(dá)到最低值。本試驗(yàn)中，A、B、C、D4組瘤胃液pH的日變化范圍分別是6.85～7.16、6.92～7.13、6.87～7.13和6.91～7.14，pH均在正常的變化范圍5.5～7.5內(nèi)，說明添加青蒿素能穩(wěn)定瘤胃的內(nèi)環(huán)境。青蒿素對(duì)原蟲起直接抑制作用，而不是通過改變瘤胃內(nèi)pH來實(shí)現(xiàn)的。瘤胃液NH3-N水平反映了飼糧中蛋白質(zhì)含量、飼糧的蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)降解的特性、能量供應(yīng)和微生物蛋白質(zhì)的合成狀況。

瘤胃NH3-N水平受諸多因素影響，如氮進(jìn)食量，飼料蛋白降解率，瘤胃微生物合成速度，瘤胃對(duì)氨的吸收和內(nèi)源含氮物質(zhì)的周轉(zhuǎn)和能量水平以及蠕蟲感染等因素的影響。氨是瘤胃內(nèi)飼料真蛋白質(zhì)和非蛋白氮分解的中間代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是瘤胃微生物合成微生物蛋白的氮源，微生物生長(zhǎng)需要一個(gè)合適的水平，其最佳NH3-N濃度為6.3～27.5 mg·100 mL-1[18-19]，本試驗(yàn)4組NH3-N的平均濃度在8.65～14.164 mg·100mL-1，在正常范圍內(nèi)。本試驗(yàn)各組的NH3-N濃度均在飼喂2 h后達(dá)到最高，之后開始下降，在下一次飼喂之前又開始回升，符合實(shí)際情況。從NH3-N濃度的平均值來看，青蒿素添加組的值都低于對(duì)照組，說明青蒿素能夠降低瘤胃液中的NH3-N濃度，從而減少了蛋白以NH3-N形式的損失，此結(jié)果與體外試驗(yàn)結(jié)果相符合[4]。

瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸（VFA）是反芻動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的主要能量來源之一，其提供的能量占反芻動(dòng)物所需能量的70%～80%左右[20]，瘤胃VFA的產(chǎn)量和組成比例是評(píng)述瘤胃發(fā)酵方式和能量轉(zhuǎn)化的直接指標(biāo)。瘤胃發(fā)酵類型即乙酸/丙酸比也明顯地影響著能量的利用率和能量?jī)?chǔ)存部位。乙酸是反芻動(dòng)物脂肪合成的主要前體，丙酸則是反芻動(dòng)物重要的葡萄糖前體，因此丙酸型發(fā)酵能為機(jī)體提供更多的能量，丙酸發(fā)酵可降低甲烷的生成從而降低因噯氣引起的能量消耗，有利于肉用家畜增重。本試驗(yàn)中添加一定量的青蒿素能使瘤胃產(chǎn)生相對(duì)較多的VFA，這說明該水平下瘤胃微生物活性較強(qiáng)，與對(duì)照組相比，更有利于瘤胃發(fā)酵。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同處理組的山羊瘤胃TVFA濃度隨時(shí)間點(diǎn)的不同而呈現(xiàn)一定的規(guī)律性變化，即采食后TVFA濃度在2 h內(nèi)迅速上升，各組在2 h達(dá)到最大值，隨后呈波動(dòng)狀，而后迅速下降。從各組的平均值來看，各試驗(yàn)組的乙酸、丙酸及TVFA濃度都比對(duì)照組有所提高，添加量為0.6%的D組最高，此試驗(yàn)結(jié)果表明青蒿素能夠增加揮發(fā)性脂肪酸的濃度，使發(fā)酵產(chǎn)生了更多滿足動(dòng)物需要的能量。試驗(yàn)組的乙丙比都低于對(duì)照組，且隨著青蒿素的增加，乙丙比呈下降趨勢(shì)，其中添加量為0.2%組顯著低于對(duì)照組，添加量為0.4%和0.6%的組與對(duì)照組差異極顯著。本研究證明，青蒿素能夠改善瘤胃發(fā)酵類型，可大幅度降低瘤胃內(nèi)原蟲數(shù)量，而原蟲數(shù)量減少時(shí)瘤胃發(fā)酵類型主要為高丙酸發(fā)酵類型。這種作用可能是由于青蒿素抑制纖毛蟲時(shí)瘤胃內(nèi)產(chǎn)丙酸菌占優(yōu)勢(shì)，如產(chǎn)生琥珀酸的細(xì)菌數(shù)量增多，琥珀酸經(jīng)三羧酸循環(huán)而產(chǎn)生丙酸的緣故。乙/丙比值的下降，降低了細(xì)菌利用H2和CO2產(chǎn)生甲烷的能力，大大減少了飼料轉(zhuǎn)化過程中能量的浪費(fèi)，同時(shí)減少了大氣中甲烷的含量，對(duì)生態(tài)環(huán)境的改善具有重要的意義。

3.2 青蒿素對(duì)瘤胃微生物種群結(jié)構(gòu)和微生物蛋白產(chǎn)量的影響

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)棲居有大量的微生物，其中主要包括厭氣性細(xì)菌、原蟲和厭氣性真菌三大類。原蟲可捕食瘤胃細(xì)菌作為自身生長(zhǎng)底物，在原蟲大量存在時(shí)，細(xì)菌密度降低，細(xì)菌蛋白減少。目前，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都致力于用植物次生代謝產(chǎn)物來控制瘤胃原蟲的數(shù)量，從而增加細(xì)菌數(shù)量和細(xì)菌蛋白。Lu等研究指出，添加0.2%和0.4% 苜蓿皂素時(shí)，其瘤胃原蟲數(shù)量分別降低34%和66%[21]；Navas等研究發(fā)現(xiàn)，豆科皂苷物質(zhì)可使瘤胃原蟲數(shù)量降低，但不會(huì)徹底去除原蟲。并且在瘤胃原蟲當(dāng)中，纖毛蟲對(duì)于豆科皂苷物質(zhì)最為敏感[22-23]。本試驗(yàn)添加青蒿素后，山羊瘤胃中原蟲數(shù)量減少，青蒿素對(duì)原蟲具有抑殺作用。試驗(yàn)各組原蟲數(shù)均比對(duì)照組小，B組原蟲數(shù)量顯著低于A組（P<0.05），其中C、D組極顯著低于A組（P<0.01），效果最為明顯。對(duì)原蟲的抑殺效果最好。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)添加青蒿素后瘤胃原蟲的各種屬比例也發(fā)生了一定的變化，總的表現(xiàn)為內(nèi)毛蟲比例下降，雙毛蟲和等毛蟲的比例上升，與體外研究的結(jié)果也一致，可能與青蒿素對(duì)原蟲的抑殺具有一定種屬選擇性有關(guān)。原蟲不能利用氮源合成自身所需要的氨基酸，其生長(zhǎng)必需靠吞噬細(xì)菌獲得氨基酸。原蟲通過自溶作用進(jìn)行代謝，而這種自溶作用產(chǎn)生的NH3不能被再次利用，這樣造成了氮的無效循環(huán)。這種無效循環(huán)使微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量下降，驅(qū)除原蟲以使MCP的產(chǎn)量提高，增加了過瘤胃蛋白質(zhì)的數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加青蒿素可以降低原蟲蛋白產(chǎn)量，提高細(xì)菌蛋白產(chǎn)量及提高微生物蛋白總產(chǎn)量。添加0.4%和0.6%時(shí)，與對(duì)照組差異極顯著；添加0.2%時(shí)與對(duì)照組差異極顯著，細(xì)菌蛋白最高，微生物總蛋白最高。添加青蒿素使MCP產(chǎn)量增加的可能是因?yàn)榱鑫冈x與細(xì)菌之間存在拮抗作用，添加青蒿素可以降低原蟲的數(shù)量，減弱原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬作用，由此使得細(xì)菌數(shù)增加，微生物蛋白產(chǎn)量提高。

3.3 青蒿素對(duì)原蟲吞噬細(xì)菌后瘤胃微生態(tài)和微生物氮微循環(huán)的影響

瘤胃內(nèi)原蟲與細(xì)菌之間存在著吞噬與被吞噬的關(guān)系，因?yàn)樵x不能利用氨，只能靠吞噬細(xì)菌來獲得氮源，原蟲的存在增加了微生物氮的無效循環(huán)。本研究中添加青蒿素后，試驗(yàn)組比對(duì)照組的原蟲密度降低，細(xì)菌密度增高，最終引起了原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬速率的降低，吞噬量的減少。也因此帶來了低的周轉(zhuǎn)率和長(zhǎng)的周轉(zhuǎn)時(shí)間。其中D組的周轉(zhuǎn)率最低，周轉(zhuǎn)時(shí)間最長(zhǎng)。分別為：1.1%和95.83 h，即在此青蒿素添加量條件下需96.03 h才可使細(xì)菌因被原蟲吞噬而周轉(zhuǎn)一次。估算菌體蛋白循環(huán)量結(jié)果表明該組循環(huán)量為450.59 mg/（d·頭）。相比而言，A組由于沒有添加青蒿素，原蟲活力較高，密度較高，并且吞噬速率最高，因此該組吞噬量最高，其細(xì)菌周轉(zhuǎn)率最高為2.6%，被更新一次僅39.08 h。對(duì)該組菌體蛋白循環(huán)的估算為518.08 mg/（d·頭），因此D添加組能夠較好的減少M(fèi)CP的循環(huán)量，在添加青蒿素的條件下原蟲的吞噬更容易影響MCP產(chǎn)量和宿主蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。本研究中徐淮山羊瘤胃原蟲吞噬細(xì)菌速率的測(cè)定結(jié)果在通常認(rèn)為的瘤胃原蟲吞噬速率102～104cells/（cell·h）范圍內(nèi)，與王夢(mèng)芝等研究的瘤胃原蟲的吞噬速率接近[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加青蒿素后使原蟲的活力降低，從而使它對(duì)細(xì)菌的吞噬量減少。隨著青蒿素添加水平提高，平均原蟲數(shù)呈下降趨勢(shì)，說明青蒿素具有殺原蟲作用和抑制原蟲活性的作用；隨著青蒿素的不斷增加，原蟲吞噬細(xì)菌的速率和吞噬細(xì)菌的量也不斷下降，印證了青蒿素具有能夠降低原蟲活性、抑殺原蟲的作用。本研究中確定添加0.6%青蒿素水平可顯著抑制原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬作用，從而使山羊瘤胃原蟲吞噬速率和微生物氮循環(huán)量減少。其主要機(jī)理可能是青蒿素通過抑制原蟲的活性使它對(duì)細(xì)菌的吞噬量減少。但青蒿素對(duì)于原蟲的抑制機(jī)理還不清楚；有關(guān)青蒿素對(duì)飼料蛋白質(zhì)利用效率和對(duì)機(jī)體氮代謝的影響有待今后繼續(xù)深入研究。

4 結(jié)論

4.1 青蒿素對(duì)山羊瘤胃內(nèi)微生態(tài)環(huán)境指標(biāo)有一定影響。對(duì)pH無顯著影響，而有降低瘤胃內(nèi)NH3-N濃度的趨勢(shì)；同時(shí)它能夠增加總揮發(fā)性脂肪酸的濃度，顯著降低乙酸/丙酸的比例而改善瘤胃發(fā)酵模式。

4.2 青蒿素對(duì)山羊瘤胃中細(xì)菌總數(shù)、原蟲總數(shù)及其不同種屬的百分比例有顯著調(diào)控作用。添加青蒿素不僅會(huì)使瘤胃細(xì)菌總數(shù)增加，使原蟲總數(shù)降低，而且使原蟲種屬比例改變，即內(nèi)毛蟲比例顯著降低，使雙毛蟲和等毛蟲比例顯著提高。

4.3 青蒿素會(huì)抑制瘤胃內(nèi)原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬作用。青蒿素降低了原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬速率和微生物氮循環(huán)量，以日糧中添加0.6%青蒿素的效果最顯著。同時(shí)，添加0.6%青蒿素可顯著降低山羊瘤胃內(nèi)菌體蛋白的微循環(huán)，從而提高飼料中蛋白質(zhì)在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的利用效率。

摘編自《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)》2014年第24期：4904～4914頁，圖、表、參考文獻(xiàn)已省略。