青蒿素對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎臟蛋白激酶C移位活化的抑制作用

張麗坤，張建勇，周鳳嬌，蘇彥君，安志霞

（河北省石家莊市第二醫(yī)院，石家莊 050051）

青蒿素對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎臟蛋白激酶C移位活化的抑制作用

張麗坤，張建勇，周鳳嬌，蘇彥君，安志霞

（河北省石家莊市第二醫(yī)院，石家莊 050051）

高糖環(huán)境引起腎臟細(xì)胞蛋白激酶C（PKC），從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，即PKC發(fā)生移位活化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1（AP-1）和核因子-κB（N-κB）等磷酸化激活，使其調(diào)控的下游基因表達(dá)上調(diào)，大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子產(chǎn)生增加，引起糖尿病腎病（DN）的發(fā)病及其病情發(fā)展[1-3]。在DN的發(fā)生發(fā)展中，PKC的移位活化起關(guān)鍵作用[3-4]。如何通過(guò)調(diào)控PKC的移位活化以阻止DN的發(fā)病成為目前研究的焦點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)采用青蒿素對(duì)糖尿病大鼠模型行腹腔注射，并監(jiān)測(cè)其對(duì)腎臟PKC活性的影響，旨在為臨床尋找防治DN的有效干預(yù)措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 動(dòng)物分組及模型制備

36只雄性SD大鼠，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，體質(zhì)量180～220 g，將大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（A組）、糖尿病非治療組（B組）及糖尿病青蒿素治療組（C組），每組12只大鼠。B組、C組利用大鼠單劑量腹腔注射STZ（購(gòu)自Sigma公司）65 mg/kg建立糖尿病大鼠模型。A組只腹腔注射等劑量檸檬酸緩沖液。72 h后經(jīng)尾靜脈采血，使用達(dá)優(yōu)血糖儀（廣州達(dá)優(yōu)醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)）檢測(cè)大鼠血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型制備成功。

1.2 動(dòng)物給藥

A組以青蒿素（購(gòu)自成都偉輝生物科技有限公司）溶于二甲基亞砜（DMSO）中，自糖尿病大鼠模型成功當(dāng)天起腹腔注射，青蒿素劑量300 mg/（kg·d）。A組與B組大鼠分別給予等劑量DMSO溶液腹腔注射。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均自由進(jìn)食、飲水，不使用任何降糖藥物。

1.3 收集標(biāo)本

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第3周、第6周時(shí)，各組分別宰殺6只大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。大鼠宰殺前1 d收集24 h尿液后分別取6 mL，測(cè)尿肌酐、UAER。宰殺后稱大鼠質(zhì)量；取血5 mL，測(cè)定血肌酐、尿素氮及血糖；取雙腎稱質(zhì)量，取右腎部分皮質(zhì)放于10%甲醛溶液中浸泡、固定，以備光學(xué)顯微鏡檢查；另外，取右腎部分皮質(zhì)放液氮中保存，測(cè)腎組織細(xì)胞膜及細(xì)胞漿的PKC活性。

1.4 測(cè)定腎組織細(xì)胞膜及細(xì)胞漿的PKC活性

1.4.1 提取細(xì)胞膜及細(xì)胞漿蛋白產(chǎn)物

在冰上進(jìn)行所有操作以保持PKC活性剪碎所保存的腎組織后放于其5倍體積的緩沖液A（pH 7.5，20 mmol/L Tris/HCl，2 mmol/LEDTA，0.25 mmol/L Sucrose，10 mmol /L EGTA）中，用組織勻漿器制作勻漿，4℃環(huán)境中100000 g加速度離心1 h，所得上清液即為腎細(xì)胞漿蛋白成分，其內(nèi)含有細(xì)胞漿中的PKC。將其沉淀物中加入1 mL緩沖液B（緩沖液A中加入1% TritonX-100），抽提30 min，每間隔10 min震蕩1次，在4℃環(huán)境下100000 kg加速度離心1 h，所得的上清液即為腎組織細(xì)胞膜蛋白成分，其中含有細(xì)胞膜PKC。

1.4.2 測(cè)定腎組織細(xì)胞膜及細(xì)胞漿的PKC活性

應(yīng)用ELISA方法測(cè)定腎組織細(xì)胞膜及細(xì)胞漿的PKC活性（試劑盒購(gòu)自Promege公司），操作步驟均按照說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.5 檢測(cè)生化指標(biāo)

采用放免法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠尿白蛋白含量。用日產(chǎn)奧林巴斯AU400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)所有生化指標(biāo)，并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率（CCr），其結(jié)果用大鼠體質(zhì)量進(jìn)行校正。

1.6 腎組織病理學(xué)檢查

常規(guī)制作光鏡切片后做HE染色，并行六胺銀及PAS染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖、腎臟質(zhì)量、體質(zhì)量及腎臟系數(shù)的變化

大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素后72 h血糖≥16.7 mmol/L，表明糖尿病大鼠模型制備成功。同期各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相比，B組大鼠體質(zhì)量均明顯低于對(duì)照組（P<0.05或0.01），并隨時(shí)間延長(zhǎng)體質(zhì)量逐漸下降，腎臟系數(shù)、腎臟質(zhì)量均逐步增加，與A組比較有明顯差異（P<0.05）。C組大鼠體質(zhì)量均明顯高于B組（P<0.05），腎臟系數(shù)、腎質(zhì)量均低于糖尿病非治療組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組UAER及腎功能比較

B組大鼠血尿素氮、內(nèi)生肌酐清除率及UAER 明顯高于同期A組大鼠（P<0.05或0.01）。C組大鼠上述數(shù)據(jù)與同期非治療組大鼠相比明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠腎組織細(xì)胞PKC活性變化的比較

與A組相比較，B 組大鼠腎臟組織細(xì)胞膜PKC活性逐步上升，而其胞漿PKC活性明顯下降，2組比較均有顯著性差異（P<0.05或0.01）。相關(guān)分析表明，B組大鼠腎組織細(xì)胞膜PKC活性的增加與UAER、腎臟系數(shù)均呈顯著相關(guān)（r=0.613，P<0.01；r=0.975，P<0.05）。C組大鼠腎臟組織細(xì)胞膜PKC活性與對(duì)照組大鼠相比明顯增加（P<0.01），但較同期B組大鼠明顯下降（P<0.01）。見(jiàn)表3。

2.4 各組腎組織病理學(xué)變化

PAS及六胺銀染色切片表明：B組大鼠腎小球PAS紅色染色區(qū)及銀染區(qū)均逐步增大。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，腎小球基底膜逐漸增厚，系膜區(qū)逐漸增寬，證明腎小球病變呈進(jìn)行性進(jìn)展。C組大鼠腎臟病變較同期B組明顯改善。

3 討論

PKC是一組絲/蘇氨酸蛋白激酶，在人體各種組織細(xì)胞內(nèi)廣泛存在。PKC是細(xì)胞內(nèi)信息網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的重要組成部分，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于的核心位置，廣泛調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理生化功能，并在糖尿病腎病的發(fā)病及病情進(jìn)展處于關(guān)鍵位置。PKC在各種組織細(xì)胞漿中以非活性形式存在，其發(fā)揮作用時(shí)需以活性形式從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，此即PKC的移位活化。高糖環(huán)境最終引起腎臟組織細(xì)胞PKC由細(xì)胞漿到細(xì)胞膜的移位活化，進(jìn)而磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1和NF-κB，最終啟動(dòng)其調(diào)控的下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，這樣就使腎細(xì)胞產(chǎn)生大量生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，啟動(dòng)糖尿病腎病的發(fā)病及病情發(fā)展[3-4]。所以在糖尿病腎病的發(fā)生及病情進(jìn)展中，PKC移位活化處于核心位置。

近年來(lái)大量研究證實(shí)青蒿素藥理作用廣泛，主要包括抗腫瘤、抗炎、抗纖維化、抗氧化等作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)證明青蒿素能減輕糖尿病大鼠腎小球肥大，改善糖尿病大鼠腎臟功能，降低UAER，減輕糖尿病腎病早期腎臟病理病變，這主要通過(guò)抑制糖尿病大鼠腎臟組織細(xì)胞蛋白激酶C從胞漿到胞膜的移位活化得以實(shí)現(xiàn)。且青蒿素的上述腎臟保護(hù)作用與代謝因素?zé)o關(guān)，是因?yàn)樘悄虿》侵委熃M大鼠與青蒿素治療組大鼠血糖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。總之，糖尿病大鼠腹腔注射青蒿素可有效抑制糖尿病大鼠腎臟組織細(xì)胞PKC由胞漿到胞膜的移位活化，從而顯著改善糖尿病大鼠早期腎臟病理學(xué)改變，為臨床成功防治糖尿病腎病提供了翔實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及可靠的研究手段。

摘編自《現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志》2014年第18期：1964～1966頁(yè)，圖、表、參考文獻(xiàn)已省略。