表皮生長因子膜對皮膚切口愈合的影響研究

趙 麗 梁曉龍 李 創(chuàng) 牛家慧 張彩喬

瘢痕是創(chuàng)傷愈合的一種產(chǎn)物，其形成是組織損傷修復(fù)的一個正常過程。多年來人們一直在探尋一條能快速恢復(fù)組織原有的結(jié)構(gòu)和功能，減少瘢痕形成的途徑。研究表明，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)對傷口愈合具有促進(jìn)作用，而其中的透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)含量的提高可使瘢痕形成減少。為此，本研究根據(jù)EGF理化性質(zhì)，做成表皮生長因子膜，旨在探討外源性EGF的應(yīng)用在傷口愈合中所起的作用、EGF膜促進(jìn)皮膚切口的愈合以及減少瘢痕的作用機(jī)制，為獲取臨床抑制瘢痕的新思路提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心供給的36只4月齡雄性健康的SD大鼠(醫(yī)動字第04057號)，體質(zhì)量為350～400 g，采用隨機(jī)分組法將其分為治療組和對照組，每組18只，分別在同一環(huán)境、同一食物分籠飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2 儀器與試劑

MDF-382型超低溫冰箱(日本三洋公司)；OLYMPUS AX-60型多功能照相顯微鏡(日本)；表皮生長因子(上海大江股份有限公司生物制藥公司)。

1.3 表皮生長因子膜的制備

分析天平稱量表皮生長因子、聚乙烯醇。采用無菌生理鹽水在超凈實驗臺內(nèi)，制取聚乙烯醇溶液，完全溶解后置入表皮生長因子，玻璃棒攪拌成均勻凝膠，平鋪于玻璃板上，低溫干燥箱干燥后制備成表皮生長因子膜，切割成長5.5 cm×1.0 cm的膜，移入無菌儲槽備用，同樣制備聚乙烯醇空白膜。

1.4 樣本收集方法

對兩組大鼠背部剪毛，脫毛。第2 d腹腔注射2%戊巴比妥鈉4～5 mg/100 g，有效麻醉后，消毒鋪無菌巾，以大鼠背部脊柱正中為中心旁開1 cm處，兩側(cè)各預(yù)備一條長約5 cm的縱切口，深達(dá)肌層，縫合。治療組傷口用無菌生理鹽水浸濕表皮生長因子膜外敷，對照組傷口用無菌生理鹽水浸濕聚乙烯醇空白膜外敷，包扎；兩組均每日換膜1次，共14 d，分別于術(shù)后3 d、5 d、7 d、9 d、14 d及21 d時隨機(jī)各取3只實驗動物，6個切口，以切口為中軸分別取距切口兩側(cè)0.5 cm的標(biāo)本，標(biāo)本包含全層皮膚及皮下組織，制取后斷頸方法處死大鼠。全層皮膚標(biāo)本用10%甲醛溶液固定備組織學(xué)檢查。

1.5 光學(xué)顯微鏡觀察

經(jīng)10%甲醛固定的標(biāo)本，石蠟包埋，制備成6 μm切片，采用常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色法染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 HA免疫組化染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫下孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)浸泡5 min，0.1 mol枸櫞酸緩沖液(pH值6.0)行抗原修復(fù)，溫度保持在98 ℃，20 min。滴加按1∶75比例稀釋的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(hyaluronate binding protein，HABP)在4 ℃條件下孵育過夜。使用PBS沖洗3次，每次5 min。標(biāo)本滴加1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(PBS稀釋)，置于37 ℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min后用PBS沖洗3次，每次5 min。滴加DAB顯色劑顯色5 min。自來水充分沖洗，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水后封片，進(jìn)行組織學(xué)觀察。陰性對照不加抗體，其余步驟同上。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)陽性(棕黃色)；陽性(黃色)；弱陽性(淺黃色)；陰性(不顯色)。采用平均陽性染色面積百分比(average positive staining area percentage，APSAP)法，光學(xué)顯微鏡下按等距抽樣原則每張切片隨機(jī)挑選10個視野，以陽性面積為測量指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對各組陽性面積率進(jìn)行單因素方差分析和多個樣本均數(shù)的比較，兩組比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后第3 d對照組部分傷口有血跡，結(jié)痂，創(chuàng)周紅腫；治療組傷口清潔，滲出少，表皮愈合傾向明顯。術(shù)后第5 d對照組傷口縫線處反應(yīng)較重；治療組傷口清潔，滲出少，表皮愈合傾向明顯。術(shù)后第7 d對照組可見少許傷口處仍有血痂，較重縫線反應(yīng)；治療組傷口愈合良好，表面清潔干凈，部分縫線脫落。術(shù)后第9 d、14 d及21 d對照組傷口愈合良好，肉眼可見明顯的愈合線；治療組傷口愈合情況良好，未見明顯的愈合線。

2.2 HE染色觀察

(1)術(shù)后第3 d光學(xué)顯微鏡下觀察。術(shù)后第3 d對照組切口兩側(cè)表皮完整性差，可見炎性滲出物及成纖維細(xì)胞，真皮層裂隙較大；治療組表皮層愈合，棘細(xì)胞層增生，真皮層少部分愈合，成纖維細(xì)胞較多(如圖1、圖2所示)。

圖1 對照組術(shù)后第3 d表皮未愈合(×100)

圖2 治療組術(shù)后第3 d表皮愈合(×100)

(2)術(shù)后第5 d光學(xué)顯微鏡下觀察。術(shù)后第5 d對照組仍可見裂隙、增生的成纖維細(xì)胞，炎細(xì)胞浸潤，表皮層愈合，角化層形成，棘細(xì)胞層增生，真皮少部分愈合；治療組表皮已經(jīng)愈合，真皮層基本愈合，可見較多增生的成纖維細(xì)胞。術(shù)后第7 d治療組、對照組的表皮層均已愈合，但對照組真皮未完全愈合，成纖維細(xì)胞成分層聚集排列；治療組真皮層基本愈合，成纖維細(xì)胞胞體較對照組小，較規(guī)則疏松排列。術(shù)后第9 d對照組表皮呈凹陷，膠原纖維較粗，按一定方向排列；治療組表皮較平坦，膠原纖維排列接近正常組織。術(shù)后第14 d和21 d對照組角化明顯，膠原纖維垂直于切口，致密束狀排列；治療組角化不如對照組明顯，表皮層較平接近正常，膠原纖維疏松排列(如圖 3、圖4所示)。

圖3 對照組術(shù)后第14 d瘢痕粗大(×100)

圖4 治療組術(shù)后第14 d瘢痕纖細(xì)(×100)

2.3 HA免疫組化染色觀察

(1)術(shù)后第3 d光學(xué)顯微鏡下觀察。術(shù)后第3 d對照組在皮膚表皮層HA染色不顯色，真皮層顯淺黃色；治療組表皮層和真皮層染色均顯示黃色。

(2)術(shù)后第5 d光學(xué)顯微鏡下觀察。術(shù)后第5 d對照組表皮層HA染色不顯色，真皮層呈淺黃色；治療組表皮層呈淺黃色，真皮層顯棕黃色(如圖5、圖6所示)。

圖5 對照組術(shù)后第5 d表皮層HA的表達(dá)呈陰性真皮層弱陽性(×200)

圖6 治療組術(shù)后第5 d表皮層HA的表達(dá)呈弱陽性真皮層強(qiáng)陽性(×200)

(3)術(shù)后第7 d和第9 d對照組表皮層上層HA染色不顯色，基底層和真皮染黃色；治療組表皮層染色由淺黃色轉(zhuǎn)為不顯色，真皮層染色為黃色。傷口兩側(cè)HA免疫組化染色圖像分析結(jié)果顯示，兩組治療3 d、5 d、7 d和9 d后治療組中HA的分布面積顯著高于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.8959，t=6.0212，t=6.8839，t=7.3367；P＜0.05)(見表1)。

3 討論

傷口的快速無瘢痕愈合一直是外科醫(yī)生積極追求的目標(biāo)，1971年，Burrington[1]首先提出“無瘢痕愈合”概念，認(rèn)為高濃度的HA是無瘢痕愈合的主要原因，但是文獻(xiàn)報道，外用HA的使用具有延遲傷口愈合和減少瘢痕形成的雙重作用[2]。而含有HA和EGF的細(xì)胞支架則可明顯促進(jìn)多種組織如皮膚、角膜和胃腸道的創(chuàng)傷愈合[3-4]。

EGF是由53個氨基酸殘基構(gòu)成的單鏈多肽，具有促進(jìn)細(xì)胞的遷移、分裂及合成間質(zhì)蛋白的能力，從而促進(jìn)各類受損創(chuàng)面的愈合[5]。研究表明，EGF與EGF受體(EGFR)的結(jié)合是其發(fā)揮生物學(xué)作用的必要條件[6-7]。傷口中外源性EGF的加入可以加速細(xì)胞產(chǎn)生透明質(zhì)酸合成酶2和酶3，有利于表皮層的增殖和細(xì)胞分化[8-9]。同時該酶對HA的合成有利[10]。有研究證實，EGF可誘導(dǎo)上皮角化細(xì)胞形成3～5倍HA外衣[11]。傷口中遷移的表皮基底細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44是HA在表皮基底細(xì)胞層的主要受體，HA與CD44結(jié)合可以加速基底細(xì)胞的遷移、增殖及分化。研究認(rèn)為，EGF可以加速細(xì)胞表面CD44的表達(dá)，促進(jìn)HA在細(xì)胞表明的粘附[12]。HA可通過聚集水分制造“離子通道”優(yōu)先遷移途徑，可以延緩生長因子的分解，促進(jìn)細(xì)胞的遷移，從而有利于促進(jìn)傷口恢復(fù)[13]。表皮的再生過程并不僅僅是在基底層一個平面展開，外源性EGF的加入使得單位時間內(nèi)修復(fù)的面積與深度增加，形成明顯的修復(fù)效應(yīng)[14]。

在正常成人皮膚可見EGF于外毛根鞘細(xì)胞、皮脂腺外層細(xì)胞，汗腺細(xì)胞輕度表達(dá)，表皮基底層呈輕到中度表達(dá)，EGF的表達(dá)在創(chuàng)傷皮膚初期稍低于正常皮膚表達(dá)，創(chuàng)傷第5 d時觀測EGF的表達(dá)上升[15]。因此，本研究在創(chuàng)傷早期外用EGF膜，以觀察其對傷口愈合的影響。本研究采用EGF聚乙烯醇膜，避免了內(nèi)源性酶對EGF的降解，可以持續(xù)的維持創(chuàng)面EGF含量。術(shù)后第3 d時，表皮層對照組未愈合而治療組完全愈合，表明外源性EGF的應(yīng)用可以快速滲透入組織，提高傷口中EGF的水平，并促進(jìn)損傷的早期迅速愈合。術(shù)后第9 d、14 d及21 d，對照組可見到明顯的愈合線，而治療組的愈合線不明顯，表明外源性EGF的應(yīng)用與無瘢痕愈合密切關(guān)聯(lián)。免疫組化染色結(jié)果證實，術(shù)后第3 d對照組在皮膚表皮層HA染色陰性，真皮層弱陽性；治療組表皮層和真皮層染色均顯示陽性。術(shù)后第5 d對照組表皮層HA染色陰性，真皮層弱陽性；治療組表皮層弱陽性，真皮層強(qiáng)陽性。術(shù)后第7 d和9 d對照組表皮層上層HA染色陰性，基底層和真皮層陽性；治療組表皮層染色由弱陽性轉(zhuǎn)為陰性，真皮層染色陽性。對照組表皮層HA免疫組化染色在第3 d、5 d、7 d、9 d均為陰性，真皮層染色在第3 d、5 d弱陽性，在第7 d和9 d漸變?yōu)殛栃裕恢委熃M表皮層HA免疫組化染色在第3 d、5 d、7 d及9 d由陽性逐漸轉(zhuǎn)為弱陽性和陰性，真皮層基本上保持陽性和強(qiáng)陽性。傷口兩側(cè)HA免疫組化染色圖像分析結(jié)果表明，術(shù)后不同時間點治療組HA免疫組化陽性面積率均顯著高于對照組。本研究顯示，治療組在表皮層和真皮層HA的表達(dá)顯著高于對照組，表明EGF膜可釋放EGF并促進(jìn)皮膚合成HA，有利于傷口的快速無瘢痕愈合。

表1 兩組SD大鼠術(shù)后不同時間點HA免疫組化陽性面積率比較(%)

4 結(jié)語

本研究結(jié)果證實，創(chuàng)傷早期應(yīng)用外源性EGF聚乙烯醇膜，可以提高傷口中EGF的濃度，從而促進(jìn)傷口的迅速愈合；同時EGF還可以刺激創(chuàng)傷組織中HA的合成，而傷口中高濃度的HA可減少組織愈合過程中瘢痕的形成。本次研究未能將聚乙烯醇膜中EGF的含量進(jìn)行分級比較，故有待在進(jìn)一步的實驗中找到聚乙烯醇膜中EGF的最適濃度，將其為臨床應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

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