抗白色念珠菌海洋真菌的篩選及抑菌活性初探

王勇勇，蒙春蕾，蔡 爽，黃 敏，孟慶恒，孫建華

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

抗白色念珠菌海洋真菌的篩選及抑菌活性初探

王勇勇1，蒙春蕾1，蔡 爽1，黃 敏1，孟慶恒2*，孫建華2

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

實驗以白色念珠菌為對象，對從渤海灣不同站位分離獲得的55株海洋絲狀真菌進(jìn)行了抗真菌活性菌株的篩選。從中篩選得到了BH431、BH515、BH531和BH09721 4株抑菌活性較高的菌株，并進(jìn)一步對不同濃度發(fā)酵液的抑菌活性及代謝物性質(zhì)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，4株海洋真菌對野生型白色念珠菌SC5314均具有較強(qiáng)抑菌活性，其最小抑菌濃度分別為65 g/mL、19 g/mL、54 g/mL、23 g/mL；其中BH431和BH515菌株還顯示出對基因敲除型菌株RM1000的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為32 g/mL、39 g/mL。4株海洋真菌所產(chǎn)生的活性代謝物具有較好的酸堿適應(yīng)性，活性物質(zhì)分子質(zhì)量＜6 000 u；其中BH431菌株的活性代謝物還具有良好的熱穩(wěn)定性。

絲狀海洋真菌；白色念珠菌；抑菌活性；篩選

從海洋生物中尋找新型生物活性物質(zhì)和高效菌株是近年來關(guān)注的熱點。已報道的天然代謝產(chǎn)物顯示出結(jié)構(gòu)新穎、活性強(qiáng)，開發(fā)前景好的特性[1-2]。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，已報道的895個新型海洋微生物天然產(chǎn)物中有576個來源于海洋真菌[3]，這些代謝產(chǎn)物在抗腫瘤、抗病毒等生物活性方面有突出的表現(xiàn)[4-6]。盡管在海洋真菌抗菌活性的研究方面也取得了一定的進(jìn)展，但多集中在抗細(xì)菌、抗放線菌活性的研究，抗真菌代謝物的研究還不多見[4]，尤其是有關(guān)抗白色念珠菌活性的研究更為少見[7-10]，而白色念珠菌不僅是一種典型的單細(xì)胞真菌，也是人畜共患的臨床上的條件病原真菌[11-12]。ZHANG Y等[13]從褐藻囊藻（Colpomenia sinuosa）分離到真菌Aspergillus niger EN-13、WEN L等[14]從臺灣紅樹林分離到真菌Paecilomyces sp.Tree1-7、HUANGZ等[15]從采自海南東寨港的紅樹林植物（Excoecaria agallocha）分離得到一株內(nèi)生真菌Phomopsis sp.ZSU-H76、WANGW 等[16]從中國青島曬鹽場的海泥分離到耐鹽真菌Alternaria raphani及LIUF等[17]從采集自中國珠海的紅樹植物（Kandelia candel）中分離得到一株內(nèi)生真菌Talaromyces sp.ZH-154，均對白色念珠菌有一定程度的抑制活性。因此，從海洋真菌中尋找新型抗白色念珠菌活性代謝物具有其特殊的意義[18]。

據(jù)此，本研究以從渤海灣不同站位分離獲得的55株海洋絲狀真菌為出發(fā)菌株，以白色念珠菌為對象，進(jìn)行了抗真菌活性菌株的篩選，并對篩選出的活性菌株發(fā)酵液抗白色念珠菌的效果和代謝物的性質(zhì)做了初步的分析，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用海洋來源真菌的新型抗真菌藥物或先導(dǎo)化合物提供新的菌種來源和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

海洋真菌：渤海灣不同站位點分離的55株絲狀真菌，由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室分離保存。

靶標(biāo)指示菌：白色念珠菌（Canidia albicans）野生型菌株SC5314和缺陷型菌株RM1000。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

土豆培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮土豆 200 g/L；葡萄糖20 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；瓊脂15 g/L；pH自然。

酵母培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L；蛋白胨20 g/L；葡萄糖20 g/L；瓊脂15 g/L；pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：去皮土豆200 g/L（浸汁）；葡萄糖20 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH自然。

1.1.3 試劑

葡萄糖（分析純）、MgSO4·7H2O（分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠；無水乙醇、鹽酸：天津市化學(xué)試劑廠二廠；酵母膏、蛋白胨：北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaOH、瓊脂：天津市化學(xué)試劑廠三廠。

1.2 儀器與設(shè)備

3120血球計數(shù)板：國營上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠；BL-220H電子天平：日本島津公司；E200顯微鏡：日本Nikon公司；YXQG02型電熱式滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械廠；Micro 200R離心機(jī)：廣州市華粵行儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、G2X-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YX-DHS-35-420-60隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海醫(yī)療器械七廠；UEOS-503型中空纖維膜組件、TP10-20超濾泵：天津膜天膜工程技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 靶標(biāo)指示菌的培養(yǎng)

白色念珠菌：將保藏的白色念珠菌接入YPD斜面培養(yǎng)基，于26℃靜置培養(yǎng)活化3 d，活化2代后備用。

1.3.2 海洋真菌的培養(yǎng)

菌種的活化培養(yǎng)：將保藏的菌種接入PDA斜面培養(yǎng)基，于26℃下靜置培養(yǎng)5～7 d。

搖瓶培養(yǎng)：取經(jīng)過活化的斜面菌種，用無菌水制備成1×106CFU/mL的孢子懸液，以培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)2%的孢子懸液接種于50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，26℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)4 d。

1.3.3 海洋真菌發(fā)酵液的制備

將搖瓶培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)雙層濾紙真空抽濾，除去菌絲球等大體積懸浮物，再用孔徑為0.45μm的無菌微孔濾膜過濾，得到菌種發(fā)酵原液；發(fā)酵原液經(jīng)UEOS-503型中空纖維膜組件（Mr=6 000 u）進(jìn)行超濾，獲得分子質(zhì)量大小不同的2組發(fā)酵液組分；發(fā)酵液及超濾液置于真空干燥箱制成干粉，為海洋真菌的粗提物干物質(zhì)。

1.3.4 抗白色念珠菌活性菌株的篩選

菌株抑菌活性的初篩采用抑菌圈法：用無菌水將靶標(biāo)菌制備成濃度為1×106CFU/mL的菌懸液，取0.1 mL置于預(yù)先倒好的平板上（Ф=9 cm），用無菌涂布棒涂勻，（培養(yǎng)條件如1.3.1）。取培養(yǎng)好的供試海洋真菌的平板，用打孔器（Ф= 8 mm）切取菌落生長均勻的部分，將切取的菌塊點植接種于涂有靶標(biāo)指示菌的平板，每板2～3塊，菌塊間距為2 cm，24 h后觀察并測定抑菌圈大小。

篩選出的各菌株抑菌活性采用濾紙片法（將抑菌圈法的菌餅換為浸泡過發(fā)酵液的無菌濾紙片）對發(fā)酵液進(jìn)行復(fù)篩，旨在復(fù)核確認(rèn)能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的活性菌株，排除菌體本身對靶標(biāo)指示菌的影響。實驗設(shè)置3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3.5 活性菌株發(fā)酵液抑菌活性的測定

取經(jīng)活化2代的靶標(biāo)菌制成濃度為106CFU/mL的菌懸液，以不加靶標(biāo)菌液作為對照（CK），發(fā)酵液按照2n進(jìn)行梯度稀釋，按表1進(jìn)行加樣混勻，于26℃培養(yǎng)12 h、24 h，在600 nm波長條件下測定吸光度值A(chǔ)600nm[19]。

1.3.6 活性代謝物性質(zhì)的初步分析

發(fā)酵液不同組分的抑菌活性：分別檢測超濾后的大分子、小分子發(fā)酵液及發(fā)酵原液的抑菌活性。

pH穩(wěn)定性：用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl溶液將活性菌株發(fā)酵液分別調(diào)成pH為4、5、6、7、8、9，分別檢測抑菌活性。

熱穩(wěn)定性：將待測菌株發(fā)酵液經(jīng)45℃、56℃、70℃、80℃、90℃處理24 h、121℃高溫滅菌20 min處理，以及發(fā)酵原液常溫處理24 h，檢測其抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗白色念珠菌海洋真菌的篩選

對55株渤海絲狀真菌抑菌活性檢測結(jié)果見表2，由表2可知，有21株海洋真菌對白色念珠菌具有較高的抑菌活性。濾紙片法復(fù)篩結(jié)果顯示，4株海洋真菌BH431、BH515、BH531、BH09721對野生型菌株SC5314有較強(qiáng)的抑菌活性，且菌株BH431和BH515對基因缺陷型菌株RM1000有較強(qiáng)的抑制作用，即確定對這4株海洋真菌做進(jìn)一步的分析研究。

2.2 指示菌的抑菌效果

部分海洋真菌對指示菌的抑菌效果，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，4株海洋真菌對白色念珠菌SC5314及RM1000均有抑制作用。

2.3 活性菌株發(fā)酵液的抑菌活性

2.3.1 活性菌株發(fā)酵液對SC5314的抑菌活性

初篩選取對白色念珠菌SC5314抑菌活性較強(qiáng)的菌株BH431、BH515、BH531、BH09721做進(jìn)一步分析，檢測結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，菌株BH431的發(fā)酵液稀釋4倍時，培養(yǎng)12 h，吸光度值開始上升；而培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液在稀釋2倍時吸光度值便開始上升，但明顯低于4倍稀釋液，因此，BH431菌株發(fā)酵液的最高稀釋倍數(shù)為2倍。菌株BH515發(fā)酵液稀釋度在1～8倍之間，培養(yǎng)12 h，吸光度值呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，當(dāng)發(fā)酵液稀釋16倍時，吸光度值開始上升，抑菌活性下降；而培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液在稀釋8倍時吸光度值便開始上升，但明顯低于16倍稀釋液，表明BH515菌株發(fā)酵液的最高稀釋倍數(shù)為8倍。菌株BH531、BH09721的發(fā)酵液稀釋度在1～4倍之間時，培養(yǎng)12 h，吸光度值呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，當(dāng)發(fā)酵液稀釋8倍，二者的吸光度值均開始上升；而培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液稀釋4倍吸光度值便開始上升，但明顯低于8倍稀釋液，因此，BH531、BH09721菌株發(fā)酵液的最高稀釋倍數(shù)為4倍。經(jīng)換算，BH515、BH431、BH531、BH09721粗提物對SC5314的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為19μg/mL、65μg/mL、54μg/mL、23μg/mL。

2.3.2 活性菌株發(fā)酵液對RM1000的抑菌活性

對基因缺陷型白色念珠菌RM1000抑菌活性較強(qiáng)的菌株BH515和BH431做進(jìn)一步分析，檢測結(jié)果見圖3。

由圖3可知，菌株BH515、BH431的發(fā)酵液稀釋度在1～4倍時，培養(yǎng)12 h，吸光度值呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，當(dāng)發(fā)酵液稀釋8倍，二者的吸光度值均開始上升；而培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液稀釋4倍吸光度值便開始上升，但明顯低于8倍稀釋液。因此，BH515、BH431菌株發(fā)酵液的最高稀釋倍數(shù)均為4倍，經(jīng)換算，BH515、BH431粗提物對RM1000的最小抑菌濃度分別為39μg/mL、32μg/mL。

2.4 活性菌株發(fā)酵液不同組分抑菌活性的分析

發(fā)酵液經(jīng)UEOS-503型中空纖維膜組件（Mr=6 000 u）進(jìn)行超濾后得到大分子組分（Mr＞6 000 u）和小分子組分（Mr＜6 000 u），分別進(jìn)行抑菌活性檢測，結(jié)果見表3。

由表3可知，4株海洋真菌發(fā)酵液小分子組分和發(fā)酵原液抑菌活性較明顯，發(fā)酵液中截留的大分子物質(zhì)抑菌活性顯著下降或幾乎沒有抑菌活性。結(jié)果表明，4株海洋真菌抑菌活性組分主要為發(fā)酵液小分子組分。

2.5 pH對活性菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

活性菌株發(fā)酵液分別調(diào)成pH值為4、5、6、7、8、9，分別檢測抑菌活性，結(jié)果見表4。

由表4可知，4株海洋真菌在設(shè)定的pH范圍內(nèi)，其發(fā)酵液均表現(xiàn)出抑菌活性，這一結(jié)果顯示，pH值變化對發(fā)酵液的抑菌活性影響不大，表現(xiàn)出較好的酸堿適應(yīng)性。且BH431菌株對SC5314的抑菌效果差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

將待測菌株發(fā)酵液經(jīng)45℃、56℃、70℃、80℃、90℃處理24 h、121℃高溫滅菌20 min，以及發(fā)酵原液（常溫24 h），檢測其抑菌活性，結(jié)果見表5。

由表5可知，菌株BH431的發(fā)酵液對白色念珠菌的抑菌活性受溫度影響差異不顯著（P＞0.05），具有較好的熱穩(wěn)定性；菌株BH09721、BH531、BH515的發(fā)酵液具有一定的耐熱性，但經(jīng)80℃以上高溫處理喪失了抑菌活性，即失活。

3 結(jié)論

本研究從渤海灣水域分離獲得的55株海洋絲狀真菌中篩選出抗白色念珠菌活性顯著的菌株BH515、BH431、BH531、BH09721，并對其進(jìn)行了初步的分析研究。其中海洋真菌BH431和BH515不僅對野生型白色念珠菌SC5314有抑制作用，對基因缺陷型菌株RM1000也有較強(qiáng)的抑制作用，已有報道表明，菌株RM1000喪失了合成組氨酸的功能[20]，基因類型為ura3：：imm434/ura3：：imm434 iro1/ iro1：：imm434 his1：：hisG/his1：：hisG[21-22]，而菌株SC5314能正常合成組氨酸，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。已有報道顯示，菌株BH431還具有較強(qiáng)的殺線活性[23]和抑大腸桿菌活性[24]的功能，且其菌種發(fā)酵液具有較廣泛的酸堿適應(yīng)范圍及耐高溫特性，顯示出菌株BH431相對廣泛的生物活性，具有可觀的研究前景。

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Screening of anti-Canidia albicans marine fungi and their antifungl activity

WANGYongyong1,MENG Chunlei1,CAIShuang1,HUANG Min1,MENGQingheng2*,SUN Jianhua2

(1.College of Life Science,Tianjin NormalUniversity,Tianjin 300387,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,Tianjin NormalUniversity,Tianjin 300387,China)

Using Candida albicans as the target strain,antifungal strains were screened from fifty-five marine-derived filamentous isolated from differentsites in Bohai Bay.Four strains of BH431,BH515,BH531 and BH09721 which had higher anti-C.albicans activity were screened,and the antifungal activity of the fermentation broth and the character ofmetabolite were preliminary tested.The results showed that the four strains had higher antifungalactivities to the wild type C.albicans SC5314.Their minimalinhibitory concentration(MIC)was 65 g/ml,19 g/ml,54 g/mland 23 g/ml, respectively.Whereas,strains BH431 and BH515 possessed antifungalactivity to the knockoutstrain RM1000 with MIC 32 g/mland 39 g/ml.Moreover,their active metabolites also showed adaptability in a wide range of pH.The ultrafiltration results suggested that the molecular mass(Mr)was less than 6 000 u.Extensively,the active metabolite of BH431 strain showed an excellentthermostability.

marine-derived filamentous fungi;Canidia albicans;antifungalactivity;screening

Q939.9

A

0254-5071（2015）02-0055-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.013

2014-12-12

國家自然科學(xué)基金資助項目（31272019）

王勇勇（1987-），女，碩士研究生，研究方向為應(yīng)用微生物。

*通訊作者：孟慶恒（1963-），男，副教授，碩士，研究方向為應(yīng)用微生物。