大豆叢枝菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷累積雙定位方法

周 佳， 張 爽， 廖 紅， 王秀榮

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 根系生物學(xué)研究中心， 資源環(huán)境學(xué)院， 廣東廣州 510642)

大豆叢枝菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷累積雙定位方法

周 佳， 張 爽， 廖 紅， 王秀榮*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 根系生物學(xué)研究中心， 資源環(huán)境學(xué)院， 廣東廣州 510642)

【目的】多聚磷是叢枝菌根內(nèi)磷的主要貯存形式，定性、定量觀察多聚磷對于解析菌根中磷代謝具有重要意義。隨著植物體內(nèi)越來越多的參與菌根真菌與寄主植物之間營養(yǎng)交換過程的基因被鑒定，迫切需要進一步提高根內(nèi)菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷累積的染色和定位分析技術(shù)。【方法】本研究利用叢枝菌根真菌Glomusmosseae侵染的大豆植株，采集新鮮根樣制片，一部分薄根片利用低濃度熒光染料麥胚凝集素，室溫染色30 min，在波長488 nm的藍光激發(fā)下使用熒光顯微鏡觀察拍照；另一部分薄根片利用熒光染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)進行染色，在波長405 nm紫外光激發(fā)下觀察并拍照；進一步取新鮮制備的薄根片，先后用以上兩種熒光染料進行染色，分別在波長405 nm和488 nm的激發(fā)光下觀察并拍照，完成了菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷的共定位?！窘Y(jié)果】 1)使用熒光染料麥胚凝集素，大豆叢枝菌根真菌侵染結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記活性染色法，可以清晰地檢測到大豆叢枝菌根中所有的共生結(jié)構(gòu)，包括叢枝，泡囊和根內(nèi)菌絲等。2)在叢枝菌根真菌侵染的根中，各種共生結(jié)構(gòu)都呈現(xiàn)出黃色熒光，為DAPI與多聚磷結(jié)合在紫外光激發(fā)下的呈色。根段中部分細胞內(nèi)的藍白色斑點為DAPI與細胞核中DNA結(jié)合的顯色結(jié)果。在含有成熟叢枝結(jié)構(gòu)的細胞中，也可觀察到大部分叢枝呈藍白色，主要是叢枝膜質(zhì)結(jié)構(gòu)的呈色。因此，利用熒光染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染色法定位多聚磷，能很好地區(qū)分多聚磷酸鹽、DNA和膜質(zhì)。3)在以上研究的基礎(chǔ)上，通過熒光光路的切換，可以同時觀察到菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷的共定位。處于發(fā)育階段的整個叢枝中多聚磷累積的亮黃色清晰可見。在成熟的叢枝中，由于膜質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)達，對累積在叢枝結(jié)構(gòu)中的多聚磷的染色觀察產(chǎn)生了一定影響，導(dǎo)致僅僅局部的多聚磷累積清晰可見。【結(jié)論】本研究建立的大豆菌根共生結(jié)構(gòu)與多聚磷累積的雙定位分析系統(tǒng)，能夠直觀觀察植物與叢枝菌根真菌的養(yǎng)分交換，清晰地對叢枝菌根共生結(jié)構(gòu)中多聚磷的累積進行定位分析，可作為從組織和細胞水平研究菌根共生體的重要技術(shù)手段。

大豆; 叢枝菌根真菌; 叢枝菌根共生結(jié)構(gòu); 多聚磷; 熒光染料

自然界中，叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)可以與近80%的陸生植物形成互惠共生關(guān)系。共生過程中AMF的孢子萌發(fā)產(chǎn)生根外菌絲，隨后在植物根內(nèi)形成根內(nèi)菌絲、泡囊、叢枝等一系列共生結(jié)構(gòu)。根外菌絲吸收土壤中的無機磷，并快速轉(zhuǎn)變成多聚磷(Polyphosphate，Poly-P)，轉(zhuǎn)運至根內(nèi)共生結(jié)構(gòu)中，在叢枝結(jié)構(gòu)中再轉(zhuǎn)化成無機磷形態(tài)轉(zhuǎn)運給寄主植物利用[1-2]。多聚磷是叢枝菌根內(nèi)磷的主要貯存形式，對多聚磷的定性、定量觀察對于解析菌根中磷代謝具有重要意義。隨著植物體內(nèi)越來越多的負責(zé)菌根真菌與寄主植物之間營養(yǎng)交換的轉(zhuǎn)運子被鑒定[3-6]，迫切需要進一步提高根內(nèi)菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷累積的染色和定位分析技術(shù)。

根內(nèi)菌根共生結(jié)構(gòu)的染色常用的是非活性染色法，較難觀測到清晰的菌根結(jié)構(gòu)。1991年，Smith和Dickson[7]首次應(yīng)用麥胚熒光素(Wheat germ agglutinin，WGA)活性染色，觀察到清晰的菌根共生結(jié)構(gòu)，該方法不易操作，需要較好的經(jīng)驗和技術(shù)，故發(fā)展受到一定限制。但由于其顯著的優(yōu)點，被染色菌根共生結(jié)構(gòu)清晰、美觀、易于觀察，越來越多的實驗室仍然試圖建立這種熒光染色方法。多聚磷染色常用的方法有呂氏亞甲基藍染色(多聚磷顆粒為粉紫色)，奈瑟氏染色(多聚磷顆粒為紫黑色)和DAPI (4′，6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)染色(多聚磷顆粒為黃色)。其中，DAPI染色多聚磷顆粒為黃色，與DNA和膜質(zhì)結(jié)構(gòu)所呈藍白色形成鮮明對比，因為易于區(qū)分而成為最常用的多聚磷染色方法[8-9]。然而，DAPI常用于聚磷菌體內(nèi)多聚磷的染色，將其用于菌根真菌侵染結(jié)構(gòu)的染色報道較少[10-11]，利用WGA和DAPI雙染色將菌根共生結(jié)構(gòu)，以及共生結(jié)構(gòu)中的多聚磷顆粒進行雙定位分析還未見報道。本研究嘗試建立大豆叢枝菌根共生結(jié)構(gòu)的熒光染色定位方法，并對AMF侵染結(jié)構(gòu)中磷的主要存在形態(tài)—多聚磷的累積進行DAPI法定位分析，進而發(fā)展菌根共生結(jié)構(gòu)與多聚磷累積的雙定位分析系統(tǒng)，以期為從組織和細胞水平上研究菌根共生體提供關(guān)鍵技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采用砂培方式，植物材料為大豆(Glycinemax(L.) Merr)基因型HN66，接種10%的AMFGlomusmosseae菌劑(即孢子、根外菌絲及被侵染根段等的混合物)，在25 ℃、14 h光照，22 ℃、10 h黑暗的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每周澆一次低磷(25 μmol/L)改良的1/2 Hoagland營養(yǎng)液[12]，pH 6.0，期間補水，常規(guī)管理，接種28 d后，采集新鮮根樣制片觀察。

1.2 根鮮樣切片

收取新鮮根樣，洗凈，切成約1 cm長的根段，用PEM buffer(50 mmol/L PIPES、5 mmol/L EGTA和5 mmol/L MgSO4，pH 7.0)固定1 h。將固定好的根段取出，紙巾吸干表面水分，用低熔點agar包埋，使用振動切片機(Leica VT1200S)將根段縱切成50 μm厚的薄根片。

1.3 染色方法

1.3.1 WGA488染色法 將切好的薄根片放在離心管中，加入PBS buffer(pH 7.4)(KH2PO4，0.144 g/L；NaCl，9.0 g/L；Na2HPO4·7H2O，0.795 g/L)漂洗三次，使用PBS buffer稀釋的10 μ g/mL WGA488(購自Invitrogen，WGA488干粉用PBS buffer溶解為1 mg/mL的儲存液，放置-20 ℃長期保存)，熒光染料室溫染色30 min后，再使用PBS buffer(pH 7.4)漂洗三次，將染色好的薄根片擺放在加有PBS buffer的載玻片上，壓片，在波長488 nm的藍光激發(fā)下使用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.2 DAPI染色法 將切好的薄根片放在離心管中，用PBS buffer漂洗三次，使用含有10% H2O2的甲醇溶液室溫浸泡10 min，用20 μ g/mL的DAPI工作液(購自Sigma，DAPI干粉用滅菌雙蒸水溶解為1 mg/mL的儲存液，放置-20 ℃長期保存)，熒光染料室溫染色30 min后，再用PBS buffer漂洗三次，將染色好的薄根片擺放在加有PBS buffer的載玻片上，壓片，在波長405 nm的紫外光激發(fā)下使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 WGA488和DAPI雙染色定位法 將切好的薄根片放在離心管中，用PBS buffer漂洗三次，使用含有10% H2O2的甲醇溶液室溫浸泡10 min，首先，使用20 μg/mL的DAPI室溫染色30 min，再使用10 μg/mL的WGA488熒光染料室溫染色30 min后，再用PBS buffer漂洗三次，將染色好的薄根片擺放在加有PBS buffer的載玻片上，壓片，分別在波長405 nm和488 nm的激發(fā)光下使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 WGA488對菌根共生結(jié)構(gòu)的染色

Wheat Germ Agglutinin(WGA)是一種細胞生物學(xué)研究中廣泛使用的熒光標(biāo)記麥胚凝集素，是從小麥胚中分離的蛋白，分子量約為43 KDa，可與N-乙酰葡糖胺基和唾液酸殘基結(jié)合[13]。 WGA 488是一種真菌細胞壁染料，其可與真菌細胞壁上的幾丁質(zhì)結(jié)合，在波長488 nm的藍光激發(fā)下，收集505_582 nm散射綠色熒光[13]。本研究通過瓊脂包埋根鮮樣后，用振動切片機將新鮮根段切成薄根片，再使用低濃度的WGA488熒光染料室溫避光染色30 min，成功地建立了大豆叢枝菌根共生結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記活性染色法。該方法可以清晰地檢測到大豆叢枝菌根中所有的共生結(jié)構(gòu)，包括叢枝、泡囊和根內(nèi)菌絲。圖1為AMFGlomusmosseae侵染大豆28 d后的根縱切WGA488染色結(jié)果。如圖中所示，綠色熒光部分可以清晰地看到根內(nèi)菌絲(IH)、叢枝結(jié)構(gòu)(A)和泡囊(V)。

2.2 DAPI 對菌根內(nèi)多聚磷的染色

DAPI是一種熒光染料，與菌體中多聚磷結(jié)合，可形成黃色熒光[8-11]。從圖2可見，在AMF侵染的根段中，各種共生結(jié)構(gòu)內(nèi)都存在黃色熒光，即為DAPI染色后多聚磷在紫外光激發(fā)下的呈色，尤其是在叢枝結(jié)構(gòu)和泡囊結(jié)構(gòu)中黃色熒光更強(如圖2c，d所示)，說明在這兩個共生結(jié)構(gòu)中有較多的多聚磷累積，而根外菌絲，這個主要輸送多聚磷的結(jié)構(gòu)中卻只能觀察到較弱的黃色熒光(如圖2a，b所示)。這可能是由于叢枝結(jié)構(gòu)是植物與菌根真菌之間多聚磷向無機磷轉(zhuǎn)化的主要場所，而泡囊是菌根真菌用于儲存養(yǎng)分的主要場所。DAPI熒光染料的靈敏度高，在室溫、中性條件下即可以對植物薄根片進行染色，且對樣品無損傷，可保持樣品的活性，同時，不影響其他染料的著色。

DAPI也用于雙鏈DNA的染色，染色后用熒光顯微鏡可觀察到DAPI-DNA復(fù)合物呈藍白色[8，9，14]。如圖2b所示，根段中部分細胞內(nèi)的藍白色斑點即為DAPI與細胞核中DNA結(jié)合的顯色結(jié)果。而且，在含有成熟叢枝結(jié)構(gòu)的細胞中也可觀察到高度分支的結(jié)構(gòu)大部分呈藍白色(圖2a，b)，這主要是由于叢枝這一高度分化的結(jié)構(gòu)主要是由膜質(zhì)結(jié)構(gòu)組成，膜質(zhì)結(jié)構(gòu)經(jīng)DAPI染色后也會發(fā)藍白色熒光[8，9，11]。而叢枝菌根共生結(jié)構(gòu)中的多聚磷經(jīng)DAPI染色后，呈亮黃色，很容易加以區(qū)分開。因此，雖然本研究中DAPI對多聚磷的染色不是很特異，但是仍然可以根據(jù)染色后的不同呈色，很容易區(qū)分DNA、膜質(zhì)結(jié)構(gòu)與多聚磷。此外，在根的維管束中也出現(xiàn)了很亮的藍白色熒光，可能為木質(zhì)部的自發(fā)熒光造成(圖2a)。

為了進一步確定我們利用DAPI熒光染色定位的黃色是聚磷酸鹽顆粒而不是其他物質(zhì)，我們進一步DAPI染色后，使用激光共聚焦顯微鏡對AMF侵染的大豆根系進行了觀察，結(jié)果如圖3所示，右邊照片中綠色十字所指示的藍色部分為DAPI自身的熒光呈色，其發(fā)射波長大約在470 nm，紅色十字所指示的黃色熒光為DAPI與多聚磷復(fù)合物的熒光呈色，其發(fā)射波長大約在550 nm，藍色十字所指示的藍白色熒光為DAPI與DNA或膜質(zhì)結(jié)構(gòu)的熒光呈色，其發(fā)射波長大約在500 nm。Aschar-Sobbi等[15]已有的研究發(fā)現(xiàn)，DAPI與多聚磷的結(jié)合會改變DAPI的激發(fā)光譜。激發(fā)波長在405 nm時，DAPI與多聚磷結(jié)合后的熒光強度顯著高于DAPI的熒光強度，并且獲得最高熒光強度時的發(fā)射波長大約在550 nm處。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)激發(fā)波長在405 nm時，叢枝結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生的黃色熒光的發(fā)射波長也是大約在550 nm處，參照相關(guān)文獻報道[10，11，15]，可以間接證明黃色熒光是DAPI與多聚磷復(fù)合物所發(fā)出的熒光。

2.3 菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷的雙定位

通過將新鮮根樣經(jīng)固定—瓊脂包埋—振蕩切片—雙氧水-甲醇處理—DAPI-WGA488熒光染料染色—顯微鏡觀察等步驟，本研究成功地建立了大豆菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷累積的雙染色共定位分析系統(tǒng)。該方法在用顯微鏡觀察時，只需切換熒光光路即可同時完成菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷的共定位。圖4a為未經(jīng)染色明場的縱切根段，叢枝以及根內(nèi)菌絲結(jié)構(gòu)清晰可見。圖4b-j為同時使用WGA488和DAPI對菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷進行染色，分別在藍光和紫外光下的觀察結(jié)果?？v切的根片段中可以觀察到叢枝、根內(nèi)菌絲等結(jié)構(gòu)。WGA488染色的叢枝結(jié)構(gòu)中綠色熒光顏色比較均勻，且熒光最強，根內(nèi)菌絲的熒光較弱(圖4b，d，f)。DAPI染色結(jié)果可以看到，在含有叢枝的細胞中有藍白色熒光，為DAPI與叢枝膜質(zhì)結(jié)構(gòu)的顯色結(jié)果。同時，可以看到，在一些含有叢枝的細胞中，明顯有黃色熒光的分布，即為多聚磷累積的DAPI染色結(jié)果(圖4c，e，j)。并且，在成熟叢枝中，由于膜質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)達，對累積在叢枝結(jié)構(gòu)中的多聚磷的染色觀察產(chǎn)生了一定影響，導(dǎo)致僅僅局部的多聚磷累積清晰可見(圖4e)。而處于發(fā)育階段的整個叢枝中多聚磷累積的亮黃色更清晰，更易觀察(圖4c，j)。此外，與圖2類似，維管束中也出現(xiàn)了很亮的熒光，可能為木質(zhì)部的自發(fā)熒光(圖4j)。本實驗中，雙染色實現(xiàn)了非常一致的菌根共生結(jié)構(gòu)和多聚磷累積的雙定位，但由于本研究觀察拍照主要使用普通熒光顯微鏡，所以觀測到的叢枝等結(jié)構(gòu)立體感不足，還有待進一步的改進。

3 結(jié)論

WGA488對菌根共生結(jié)構(gòu)的染色結(jié)合DAPI 對菌根內(nèi)多聚磷的染色，實現(xiàn)大豆菌根共生結(jié)構(gòu)與多聚磷累積的雙定位，能夠直觀觀察植物與叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)的養(yǎng)分交換，可用于從組織和細胞水平研究菌根共生體。

[1] Parniske M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6： 763-775.

[2] Harrison M, van Buuren M. A phosphate transporter from the mycorrhizal fungusGlomusversiforme[J]. Nature, 1995, 378： 626-629.

[3] Harrison M J, Dewbre G R, Liu J. A phosphate transporter fromMedicagotruncatulainvolved in the acquisition of phosphate released by arbuscular mycorrhizal fungi[J]. The Plant Cell, 2002, 14(10)： 2413-2429.

[4] Paszkowski U, Kroken S, Roux C, Briggs S P. Rice phosphate transporters include an evolutionarily divergent gene specifically activated in arbuscular mycorrhizal symbiosis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(20)： 13324-13329.

[5] Pumplin N, Harrison M. Live-cell imaging reveals periarbuscular membrane domains and organelle location inMedicagotruncatularoots during arbuscular mycorrhizal symbiosis[J]. Plant Physiology, 2009, 151(2)： 809-819.

[6] Kobae Y, Tamura Y, Takai Setal. Localized expression of arbuscular mycorrhiza-inducible ammonium transporters in soybean[J]. Plant and Cell Physiology, 2010, 51(9)： 1411-1415.

[7] Smith S E, Dickson S. Quantification of active vesicular-arbuscular mycorrhizal infection using image analysis and other techniques[J]. Australian Journal of Plant Physiology, 1991, 18(6)： 637-648.

[8] 任世英, 肖天. 聚磷菌體內(nèi)多聚物的染色方法[J]. 海洋科學(xué), 2005, 29(1)： 59-63. Ren S Y, Xiao T. Staining methods for intracellular polymers deposited by polyphosphate-accumulating microorganisms[J]. Marine Sciences, 2005, 29(1)： 59-63.

[9] Smolders G, van der Meij J, van Loosdrecht Metal. Model of the anaerobic metabolism of the biological phosphorus removal process stoichiometry and pH influence[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1994, 43(6)： 461-470.

[10] Boddington C, Dodd J. Evidence that differences in phosphate metabolism in mycorrhizas formed by species ofGlomusandGigasporamight be related to their life-cycle strategies[J]. New Phytologist, 1999, 142, 531-538.

[11] Funamoto R, Saito K, Oyaizu Hetal. Simultaneous in situ detection of alkaline phosphatase activity and polyphosphate in arbuscules within arbuscular mycorrhizal roots[J]. Functional Plant Biology, 2007, 34(9)： 803-810.

[12] Zhou J, Xie J N, Liao H, Wang X R. Overexpression ofβ-expansin geneGmEXPB2 improves phosphorus efficiency in soybean[J]. Physiologia Plantarum, 2014, 150： 194-204.

[13] Bonfante-Fasolo P, Faccio A, Perotto S, Schubert A. Correlation between chitin distribution and cell wall morphology in the mycorrhizal fungusGlomusversiforme[J]. Mycological Research, 1990, 94(2)： 157-165.

[14] Tijssen J P F, Beekes H W, Steveninck J. Localization of polyphosphates inSaccharomycesfragilis, as revealed by 4, 6-diamidino-2-phenylindole fluorescence[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1982, 721(4)： 394-398.

[15] Aschar-Sobbi R, Abramov A, Diao Cetal. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach[J]. Journal of Fluorescence, 2008, 18： 859-866.

Dual localization of arbuscular mycorrhizal structures and polyphosphate accumulation in soybean roots

ZHOU Jia, ZHANG Shuang, LIAO Hong, WANG Xiu-rong*

(RootBiologyCenter,CollegeofResourcesandEnvironment,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou, 510642,China)

【Objectives】 Polyphosphates are major phosphorus forms existing in the structural bodies of arbuscular mycorrhizae. Qualitative and quantitative analyses of polyphosphates are important to understand the phosphorus metabolism in arbuscular mycorrhizae. Many genes have been identified to involve in nutrient exchanges between mycorrhizal fungi and host plants. Therefore, the technology for the staining and localization of polyphosphates in arbuscular mycorrhizae is urgently required. 【Methods】 Fresh roots fromGlomusmosseaecolonized soybean plants were sampled and made into thin slices. Some of them were stained with low concentration of wheat germ agglutinin for 30 min at room temperature, and photographed using a fluorescence microscope at blue light excitation with wavelength of 488 nm; the others were stained with the fluorescent dye 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, and photographed at ultraviolet excitation with wavelength of 405 nm. The polyphosphates were thus localized by both the methods. 【Results】 1) Using fluorescent active staining method (stained with wheat germ agglutinin), all arbuscular mycorrhizal structures could be clearly detected, including arbuscules, vesicles and intercellular hyphae. 2) In the infected roots, polyphosphates in arbuscular mycorrhizal structures showed yellow fluorescence under excitation of ultraviolet light. DNA in nucleus interacting with 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride showed blue-white fluorescent dots, and arbuscular membrance of mature arbuscules in the cells exhibited blue-white fluorescence. So, using fluorescent dye 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride to position the polyphosphates, the pigmentation of polyphosphates, DNA and membrane structure were obviously distinguished. 3) Based on the above results, dual localization of mycorrhizal structures and polyphosphate accumulation was realized by changing the fluorescent channels. Furthermore, polyphosphate accumulation in immature arbuscules showed light yellow fluorescence, and those in mature arbuscules could only partly be observed since highly developed membrane structure affected the staining and appearance of polyphosphates. 【Conclusions】The dual staining method using fluorescent dyes wheat germ agglutinin and 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride is able to localize the mycorrhizal structures and polyphosphate accumulation in soybean roots. Using the method, the nutrient exchanges between arbuscular mycorrhizal fungi and plant roots can be visually observed. Therefore, it is prospective technology for the study of mycorrhizal symbiosis at tissue and cellular level.

soybean; arbuscular mycorrhizal fungi; arbuscular mycorrhizal structures; polyphosphates; fluorescent dyes

2013-10-18 接受日期： 2014-11-03

國家自然科學(xué)基金項目(31372126)資助。

周佳(1985—)， 女， 吉林省琿春市人， 博士研究生， 主要從事植物營養(yǎng)生理與遺傳研究。 E-mail: zhoujia8555@163.com * 通信作者 E-mail: xrwang@scau.edu.cn

S131+.2

A

1008-505X(2015)01-0211-06