核桃餅粕多酚純化工藝及其抗氧化活性的研究

梁杏，張旭，陳朝銀，趙聲蘭*，梁永菊，魯曉芳

（1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南昆明650500；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

核桃餅粕多酚純化工藝及其抗氧化活性的研究

梁杏1，張旭1，陳朝銀2，趙聲蘭1*，梁永菊1，魯曉芳1

（1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南昆明650500；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

研究大孔樹脂純化核桃餅粕多酚的工藝，比較AB-8、HPD-100、D101、X-5、NKA-9五種大孔樹脂對核桃餅粕多酚的分離純化效果。結(jié)果表明，HPD-100為分離純化核桃餅粕多酚的最佳大孔樹脂，其最佳純化工藝為上樣液pH值為4.0，質(zhì)量濃度4.0 mg/mL，流速2 BV/h，體積1.8 BV，以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗脫，洗脫流速4 BV/h，洗脫體積3 BV。用該工藝純化后，核桃餅粕多酚的純度從26.63%提高到81.10%，回收率為87.33%。純化后的核桃餅粕多酚對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子自由基（·）清除作用均呈現(xiàn)量效關(guān)系，半數(shù)抑制濃度IC50分別為481.18 μg/mL、151.43 μg/mL、8.19 μg/mL和202.83 μg/mL，對DPPH和·OH清除能力較VC強，具有深入研究的價值。

核桃餅粕；多酚；大孔吸附樹脂；純化；抗氧化活性

體內(nèi)過量的自由基會破壞健康細(xì)胞，侵害人體內(nèi)的蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)，加速機體衰老進程并誘發(fā)癌癥、心腦血管疾病等病變[1]。植物多酚是一類天然抗氧化劑，能通過清除自由基，對自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護作用，維持細(xì)胞膜的流動性和蛋白質(zhì)的構(gòu)型構(gòu)象，防止輻射誘發(fā)的脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA)斷裂，具有抗突變、抗腫瘤、抗癌癥、抗衰老、降血脂等作用[2-9]。核桃富含多酚類化合物[10]，ZHANG Z J等[11]從核桃分離到7種多酚化合物，其中4種多酚物質(zhì)對二苯代苦味酰（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力高于水溶性生育酚（Trolox）當(dāng)量。核桃餅粕為核桃榨油后的副產(chǎn)物，含有豐富的多酚類物質(zhì)，目前多作為動物飼料，附加值低[12-13]。本研究采用大孔樹脂吸附法，研究核桃餅粕多酚的分離純化及其抗氧化活性，為高效開發(fā)利用核桃餅粕資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕：云南匯智源食品有限公司；沒食子酸對照品：上海同田生物技術(shù)股份有限公司；大孔樹脂NKA-9、AB-8、D101、X-5、HPD-100：河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司；DPPH試劑：美國Sigma公司；福林-酚（Folin-Ciocaileu）試劑：北京索萊寶科技有限公司；牛血清蛋白：上海新興醫(yī)藥保健品科技開發(fā)中心；葡萄糖、維生素C：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硫酸亞鐵、1.10-菲啰啉、三（羥甲基）氨基甲烷、氯化鉀、過氧化氫30%、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、焦性沒食子酸、醋酸鈉、無水乙醇、無水碳酸鈉、冰乙酸、硫酸、鹽酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759S紫外-可見分光光度計：上海精科科學(xué)儀器有限公司；BS214D電子分析天平：奧豪斯儀器有限公司；洗脫柱（φ1.2 cm×50.0 cm）：中國科學(xué)院昆明植物研究所玻璃儀器加工廠；ZNHW電熱套：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。1.3實驗方法

1.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用Folin-Ciocaileu比色法[5]，精密稱取沒食子酸對照品0.0050g，蒸餾水溶解并定容至50mL，搖勻，得100μg/mL沒食子酸對照品儲備液，臨用現(xiàn)配。用移液管分別移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL沒食子酸對照品儲備液于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL沒食子酸工作液。分別吸取沒食子酸工作液1 mL于10 mL容量瓶，加5 mL 10%福林酚試劑，搖勻，5 min后加7.5%碳酸鈉溶液4mL，搖勻后避光反應(yīng)1h，測定波長765nm處吸光度值，得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.010 9X+ 0.011 9，相關(guān)系數(shù)R=0.999 2，其中X為沒食子酸溶液質(zhì)量濃度C（μg/mL），Y為吸光度值A(chǔ)。多酚含量及多酚損失率計算公式如下：

式中：C0為濾液中多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；V0為濾液體積，mL；M為核桃餅粕干質(zhì)量，g。

式中：X3為處理前原液多酚量，mg；X4為處理后多酚量，mg。

1.3.2 多糖含量測定方法

采用苯酚-硫酸法[14]，精密稱取葡萄糖20 mg，蒸餾水溶解并定容至100 mL，搖勻，得葡萄糖母液。分別吸取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL葡萄糖母液于具塞試管中，用蒸餾水補至2.0 mL，加6%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min，測波長490 nm處吸光度值，以葡萄糖質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.057 2X-0.007 5，相關(guān)系數(shù)R=0.999 4。多糖沉淀率計算公式如下：

式中：C1為處理前多糖質(zhì)量濃度，μg/mL；V1為處理前體積，mL；C2為處理后多糖質(zhì)量濃度，μg/mL；V2為處理后體積，mL。

1.3.3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取牛血清蛋白100 mg，蒸餾水溶解并定容至100 mL，得1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于不同試管中，用蒸餾水補足到1 mL，加5 mL福林-酚試劑甲，混勻，放置10 min，加0.5 mL福林-酚試劑乙，搖勻，放置30 min，測定波長500 nm處吸光度值，得牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.6842X+0.0214，相關(guān)系數(shù)R=0.9990，其中，X為牛血清蛋白含量mg/mL，Y為吸光度值A(chǔ)。

1.3.4 上柱液制備

核桃餅粕粉碎，過60目篩，在液固比50∶1（mL∶g），乙醇體積分?jǐn)?shù)50%條件下，用電熱套加熱至73℃，回流提取2次，每次1 h，過濾，濃縮，配成1 mg/mL樣液，按樣液∶無水乙醇（V/V）1∶0.25、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9加入無水乙醇，靜置30 min，4 500 r/min，離心20 min，取上清液，所得除去部分多糖和蛋白質(zhì)的核桃餅粕多酚提取液，回收乙醇，濃縮備用，即為上柱液。

1.3.5 大孔樹脂優(yōu)選

分別精密稱取預(yù)處理好的5種（X-5、HPD-100、D101、AB-8、NKA-9）大孔樹脂5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入1 mg/mL核桃餅粕多酚50 mL，于110 r/min、28℃搖床中，振搖吸附6 h，取樣測定多酚含量，用蒸餾水清洗2～3次，加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇50 mL，在110 r/min、28℃搖床中，振搖解吸6 h，取樣測定多酚質(zhì)量濃度。樹脂的吸附量、吸附率和解吸率計算公式如下：

式中：C0為起始多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為平衡多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附液體積，mL；M為樹脂干質(zhì)量，g。

式中：C0為起始多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為平衡多酚質(zhì)量濃度，mg/mL。

式中：C0為起始多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為平衡多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附液體積，mL；C2為解吸液多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為解吸液體積，mL。

（1）上樣液pH值對吸附的影響

精密稱取優(yōu)選并預(yù)處理好的大孔樹脂5 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL，pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0核桃餅粕多酚樣液50 mL，瓶口密封，110 r/min、28℃搖床中，振搖吸附6 h，取樣測定多酚含量，分析上樣液pH值對樹脂吸附核桃餅粕多酚的影響。

（2）上樣液質(zhì)量濃度對吸附的影響

在確定的pH值、流速4 BV/h的條件下，控制上樣液質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0mg/mL。檢測漏出液多酚質(zhì)量濃度，漏出液多酚質(zhì)量濃度達(dá)上樣液質(zhì)量濃度的10%（泄漏點）停止上柱，考察上樣液質(zhì)量濃度對樹脂吸附核桃餅粕多酚的影響。

（3）上樣液流速對吸附的影響

在確定的pH值及上樣液質(zhì)量濃度條件下，控制上樣流速分別為1 BV/h、2 BV/h、4 BV/h、8 BV/h。檢測漏出液多酚質(zhì)量濃度，考察上樣液流速對樹脂吸附核桃餅粕多酚的影響。

1.3.6 樹脂動態(tài)吸附特性

按確定的吸附條件上柱，分部收集漏出液，測定漏出液中核桃餅粕多酚量，以上樣液體積BV為橫坐標(biāo)，漏出液核桃餅粕多酚質(zhì)量濃度C1/上柱液質(zhì)量濃度C0為縱坐標(biāo)，繪制動態(tài)吸附曲線。

1.3.7 樹脂洗脫條件的優(yōu)化

乙醇體積分?jǐn)?shù)對洗脫的影響：按確定的條件上柱，吸附平衡后，用3 BV蒸餾水快速淋洗樹脂柱?？刂葡疵撘后w積3 BV，洗脫流速4 BV/h，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為65%、75%、85%進行洗脫，計算解吸率。

洗脫液體積對洗脫的影響：按確定的條件上柱，吸附平衡后，用3 BV蒸餾水快速淋洗樹脂柱。按確定的洗脫液質(zhì)量濃度，洗脫流速2BV/h，控制洗脫液體積分別為10mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL進行洗脫，計算解吸率。

流速對洗脫的影響：按確定的條件上柱，吸附平衡后，用3 BV蒸餾水快速淋洗樹脂柱。按確定的洗脫液質(zhì)量濃度及確定的洗脫液體積，控制洗脫流速分別為2 BV/h、4 BV/h、6 BV/h、8 BV/h進行洗脫，計算解吸率。

洗脫特性試驗：按確定的吸附條件上柱，吸附平衡后，3 BV蒸餾水快速淋洗樹脂柱。用確定的洗脫條件進行洗脫，收集洗脫液，測定，以洗脫液體積（BV）為橫坐標(biāo)，洗脫液中核桃餅粕多酚質(zhì)量濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。

1.3.8 核桃餅粕多酚體外抗氧化活性

（1）對過氧化氫（H2O2）的清除作用[5]

取10 mL具塞試管，分別加以50 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液配制的40 mmol/L H2O2溶液2.5 mL、核桃餅粕多酚溶液，以VC為陽性對照，以不加樣品的H2O2溶液為空白對照，以不加H2O2溶液為樣品空白對照組，用水補足至10 mL，混勻，10 min后測量吸光度值A(chǔ)230nm，過氧化氫清除率計算公式如下：

式中：A0為空白對照組吸光度值，A1為樣品組吸光度值，A2為樣品空白對照組吸光度值。

（2）對羥自由基（·OH）的清除作用[5]

采用Fention反應(yīng)體系，利用鄰二氮菲與Fe2+反應(yīng)生成有色配合物，該配合物在波長536 nm處有最大吸收的原理測定。H2O2/Fe體系產(chǎn)生的羥自由基（·OH）氧化鄰二氮菲-Fe2+生成鄰二氮菲-Fe3+，A536nm值減少，待測樣品若對體系中·OH有清除作用，則可抑制A536nm減少。取10 mL具塞試管，以VC為陽性對照，分別依次加入核桃餅粕多酚溶液或等濃度VC溶液1 mL，0.75 mmol/L FeSO4溶液1 mL，0.75 mmol/L鄰二氮菲1 mL，0.01%H2O2溶液1 mL，37℃保溫1 h，測定吸光度值A(chǔ)536nm。損傷管和未損傷管不加抑制劑，損傷管含1 mL H2O2，未損傷管不加H2O2。羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：A0試劑未損傷管吸光度值，A1試劑損傷管吸光度值，A2樣品未損傷管吸光度值，A3樣品損傷管吸光度值。

采用鄰苯三酚自氧化法，取10 mL具塞試管，依次加入50 mmol/L pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液1.5 mL，蒸餾水1.5 mL，搖勻，25℃恒溫20 min，取出后立即加入25℃預(yù)熱3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速混勻，在波長325 nm處每隔30 s測定1次吸光度值，計算鄰苯三酚的自氧化速率ΔA對照，按上法在加入鄰苯三酚前，先加入核桃餅粕多酚溶液，測定ΔA樣品。超氧自由基清除率計算公式如下：

式中：ΔA對照為1 min內(nèi)對照管吸光度的變化值；ΔA樣品為1 min內(nèi)對照管吸光度的變化值。

（4）對DPPH自由基清除作用[15]

準(zhǔn)確稱取DPPH試劑0.008 0 g用無水乙醇溶解定容至100 mL，得0.2 μmol/L的DPPH貯備液。取4 mL DPPH貯備液加入到4mL核桃餅粕多酚溶液中，充分混合，靜置30min，于波長517 nm處測定其吸光度值。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A1為4 mL DPPH溶液+4 mL樣品溶液的吸光度值；A2為4 mL樣品提取液+4 mL乙醇的吸光度值；A3為4 mL DPPH溶液+4 mL乙醇的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對核桃餅粕多酚提取液中多糖、蛋白質(zhì)及多酚的影響

核桃餅粕多酚提取液中的糖類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)會引起大孔樹脂中毒（較多的糖類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)導(dǎo)致大孔樹脂吸附能力下降，甚至消失），因此用乙醇沉淀多糖和蛋白質(zhì)，結(jié)果見表1。由表1可知，提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時多糖沉淀最多，達(dá)23.36%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為87.5%時蛋白質(zhì)沉淀最多，達(dá)71.23%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時多酚損失率最小，為0.59%，綜合考慮多糖、蛋白質(zhì)沉淀率和多酚損失率，核桃餅粕多酚粗提液中乙醇體積分?jǐn)?shù)20%為宜。

2.2 大孔吸附樹脂的優(yōu)選

2.2.1 醇沉對大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸的影響

由表2可知，大孔樹脂對核桃餅粕多酚的靜態(tài)吸附和解吸效果均顯著提高，且醇沉后X-5、AB-8、NKA-9、D101、HPD-100大孔樹脂對核桃餅粕多酚吸附率分別為68.38%、77.12%、63.51%、74.09%、78.62%，解吸率分別為74.20%、78.58%、69.03%、70.58%、83.89%，其中，HPD-100大孔樹脂的吸附和解吸效果最佳，因此選擇HPD-100大孔樹脂進行后續(xù)實驗。

2.2.2 HPD-100靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

由圖1可知，0.5 h內(nèi)HPD-100對核桃餅粕多酚快速吸附，0.5～1.0 h內(nèi)吸附速度變緩，1.0 h后吸附達(dá)到飽和，故靜態(tài)吸附1.0 h適宜。

2.2.3 pH值對HPD-100靜態(tài)吸附的影響

由圖2可知，低pH值有利于吸附，pH值為2.0，吸附量為13.818 8 mg/g，pH值升高，吸附量減少，pH值為8.0，吸附量下降到9.7156mg/g。主要是吸附質(zhì)以離子形態(tài)存在時不易被吸附樹脂吸附，吸附質(zhì)以分子態(tài)存在時易被吸附樹脂吸附，核桃餅粕多酚是一種弱酸性物質(zhì)，pH值升高，以離子形式存在；pH值下降，多以分子態(tài)存在，易被樹脂吸附，但當(dāng)pH值低于一定值后核桃餅粕多酚幾乎完全以分子態(tài)存在，故pH值為4.0效果最佳。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對HPD-100靜態(tài)解吸的影響

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)20%～80%時，核桃餅粕多酚解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加，可能是核桃餅粕總多酚成分較為復(fù)雜，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，其溶解度增大，同時也增大了大孔樹脂的溶脹，使核桃餅粕多酚容易被洗脫下來，但乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時解吸率又下降。因此，靜態(tài)解吸時，用乙醇洗脫適宜體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.3 HPD-100樹脂動態(tài)吸附條件的優(yōu)化

2.3.1 上柱液質(zhì)量濃度對HPD-100吸附的影響

由圖4可知，上柱液質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL，漏出液多酚質(zhì)量濃度達(dá)上樣液質(zhì)量濃度的10%（泄漏點），上柱液核桃餅粕多酚量分別為47.5 mg、75.0 mg、140.0 mg、200.0 mg、192.0 mg。在0.5～4.0 mg/mL范圍，上柱液多酚總量隨著上柱液質(zhì)量濃度的增加而增大，在4.0～6.0 mg/mL范圍，上柱液體積隨質(zhì)量濃度增加而減少。上柱流速一定時，隨上樣液質(zhì)量濃度增大，與多酚競爭吸附的雜質(zhì)隨之增加，多酚在樹脂內(nèi)部擴散能力降低。充分考慮樹脂的吸附和效率，上柱液質(zhì)量濃度4.0 mg/mL為宜。

2.3.2 上柱流速對HPD-100吸附的影響

由圖5可知，僅改變流速，上柱流速1 BV/h、2 BV/h、4 BV/h、8 BV/h達(dá)泄漏點時，上柱液多酚量分別為264 mg、 216 mg、200 mg、144 mg。隨著流速的增加，吸附量隨之減少，可能是流速較小，多酚分子有足夠的時間與樹脂的內(nèi)表面接觸，有利于吸附，減少多酚的漏出，提高其吸附率，但流速太小，操作周期過長；上柱流速太快，多酚溶液與大孔樹脂的接觸時間短，易發(fā)生泄漏，降低吸附率，因此，上柱流速以2 BV/h為宜。

2.3.3 HPD-100樹脂動態(tài)吸附動力學(xué)特性曲線

由圖6可知，上樣液體積在低于0.33 BV時，沒有核桃餅粕多酚漏出；上柱液0.33～0.75 BV核桃餅粕多酚漏出較快；在0.75～1.80 BV漏出速度減緩；到達(dá)1.80 BV時，漏出液達(dá)到上柱液10.8%，所以上樣體積選擇1.80 BV為宜。2.3.4 HPD-100樹脂洗脫條件的優(yōu)化

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對洗脫的影響

由圖7可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%～75%，洗脫率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%到85%，洗脫率有所降低。綜合圖3和圖7結(jié)果，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇75%，洗脫率可達(dá)99.6%。

（2）乙醇體積對洗脫的影響

由圖8可知，體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗脫能力與其用量呈正相關(guān)，用量越大，解吸率越大。洗脫劑＜20 mL，幾乎沒有洗脫，洗脫劑90 mL，解吸率99.6%，洗脫劑100 mL時，核桃餅粕多酚幾乎被完全洗脫下來。從節(jié)約成本和核桃餅粕多酚含量出發(fā)，體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗脫體積以90mL為宜。

（3）乙醇流速對洗脫的影響

由圖9可知，流速為2BV/h，解吸率100%；流速為4BV/h，解吸率99.6%；而流速8 BV/h，解吸率只有87.5%。流速太快，解吸率降低，流速太慢使洗脫時間增加。故體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗脫流速宜控制在4BV/h為宜。

（4）HPD-100動力學(xué)洗脫特征曲線

由圖10可知，HPD-100大孔吸附樹脂對核桃餅粕多酚有良好的洗脫性能，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇1 BV就開始大量洗脫核桃餅粕多酚，至1.33BV時洗脫到最大值3.8 mg/mL，之后洗脫速率下降，當(dāng)洗脫液達(dá)3 BV時核桃餅粕多酚洗脫完全。因此，用3 BV的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗脫核桃餅粕多酚最佳。

2.4 核桃餅粕多酚純度和回收率

經(jīng)冷凍干燥后測定，核桃餅粕多酚純度和回收率見表3。由表3可知，純化前核桃餅粕總多酚含量26.63%，經(jīng)HPD100樹脂純化后含量81.10%，核桃餅粕多酚的純度顯著提高，回收率87.33%。

2.5 核桃餅粕多酚純化物的抗氧化活性

2.5.1 核桃餅粕多酚純化物對H2O2、OH·、·及DPPH自由基清除作用

對H2O2清除作用見圖11（a），核桃餅粕多酚及VC對H2O2清除作用隨質(zhì)量濃度增加而增大，質(zhì)量濃度800 μg/mL時，對H2O2清除率84.62%，IC50481.18 μg/mL。VC對H2O2清除作用高于核桃餅粕多酚。

對·OH的清除作用見圖11（b），核桃餅粕多酚和VC對·OH的清除均隨質(zhì)量濃度增加而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度400 μg/mL時，核桃餅粕多酚對·OH清除率幾乎達(dá)100%，IC50151.43 μg/mL，同質(zhì)量濃度VC對·OH清除率69.07%，IC50348.25μg/mL，核桃餅粕多酚對·OH清除作用高于VC。

對DPPH自由基清除作用見圖11（d），核桃餅粕多酚和VC對DPPH自由基清除作用均隨多酚質(zhì)量濃度升高而增大，IC50分別為8.19 μg/mL和10.11 μg/mL，核桃餅粕多酚對DPPH自由基清除能力高于VC。

3 結(jié)論

研究了5種不同大孔樹脂對核桃餅粕多酚粗提取物的吸附和解吸，其中HPD-100型大孔樹脂吸附量大、解吸率高、對核桃餅粕多酚分離純化效果最好。HPD-100樹脂分離純化核桃餅粕多酚最佳工藝為上液樣pH值為4.0，上樣液質(zhì)量濃度4.00 mg/mL，上樣流速2 BV/h，上柱液體積1.8 BV，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，洗脫流速4 BV/h，洗脫體積3 BV。此條件下，核桃餅粕多酚的含量從26.63%提高到81.10%，回收率87.33%。純化后的核桃餅粕多酚對·DPPH、·OH、H2O2和·有較強清除作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系，IC50分別為481.18 μg/mL、151.43 μg/mL、8.19 μg/mL和202.83 μg/mL，對DPPH和·OH的清除能力高于VC，值得進一步研究。

[1]孫建霞.蘋果多酚的提取分離及其主要功能活性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2005.

[2]宋立江，狄瑩，石碧.植物多酚研究與利用的意義及發(fā)展趨勢[J].化學(xué)進展，2000，12（2）：161-170.

[3]BLOMHOFF R,CARLSEN M H,ANDERSEN L F,et al.Health benefits of nuts:potential role of antioxidants[J].Brit J Nutr,2006,96(2):S52-S60.

[4]YANG J,CHEN C Y,ZHAO S L,et al.Effect of solvents on the antioxidant activityofwalnut(JuglansregiaL.)shell extracts[J].Food Nutr Res, 2014,2(9):621-626.

[5]張春梅，陳朝銀，趙聲蘭，等.核桃內(nèi)種皮多酚提取工藝及其體外抗氧化活性的初步研究[J].中國釀造，2014，33（7）：130-134.

[6]JOSEPH J A,SHUKITT-HALE B,WILLIS L M.Grape juice,berries, and walnuts affect brain aging and behavior[J].J Nutr,2009,139(9): 1813S-1817S.

[7]SHI D D,CHEN C Y,ZHAO S L,et al.Walnut polyphenols inhibit pancreatic lipase activityin vitroand have hypolipidemic effect on high-fat diet-induced obese mice[J].Food Nutr Res,2014,2(10):757-763.

[8]YANG J,CHEN C Y,ZHAO S L,et al.The inhibitory effect of different solvents extracts from walnut shell(Juglans regiaL.)on pancreatic lipase and adipogenesis of 3T3-L1 preadipocytes[J].Food Nutr Res,2014,2 (10):664-670.

[9]HAIDER S,BATOOL Z,TABASSUM S,et al.Effects of walnuts (Juglans regia)on learning and memory functions[J].Plant Food Hum Nutr,2011,66(4):335-340.

[10]陳虹霞，王成章，周昊，等.核桃酚類化合物的研究進展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2013，33（1）：130-134.

[11]ZHANG Z J,LIAO L P,MOORE J,et al.Antioxidant phenolic compoundsfromwalnutkernels(JuglansregiaL.)[J].Food Chem,2008,113 (1):160-165.

[12]梁杏，趙聲蘭，曹冠華，等.液態(tài)發(fā)酵核桃餅粕的初步研究[J].中國釀造，2013，32（12）：66-69.

[13]孫鳳莉，李茜，墨鋒濤，等.核桃餅飼用營養(yǎng)成分分析[J].飼料研究，2010（10）：37-38.

[14]王文雅，李軍，岳海燕，等.3種大孔吸附樹脂對葡萄酒下腳料中原花青素分離性能的研究[J].食品科技，2008，33（6）：146-149.

[15]徐曼，陳笳鴻，汪詠梅，等.落葉松原花青素的沒食子?；捌淇寡趸钚栽鰪娦?yīng)[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2010，30（6）：55-60.

LIANG Xing1,ZHANG Xu1,CHEN Chaoyin2,ZHAO Shenglan1*,LIANG Yongju1,LU Xiaofang1
(1.College of Traditional Chinese Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China; 2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Purification technology of walnut residue polyphenols was investigated using macroporous resin.The effects of macroporous resin AB-8, HPD-100,D101,X-5 and NKA-9 on purification of walnut residue polyphenols were studied respectively.Results indicated that the HPD-100 was the optimal resin,and the optimum purification conditions were sample pH 4.0,concentration 4.0 mg/ml,flow rate 2 BV/h,volume 1.8 BV,eluent 75%alcohol,elution flow rate 4 BV/h and elution volume 3 BV.Under these conditions,the purity of walnut residue polyphenols increased from 26.63%to 81.10%and the recovery was 87.33%.The purified polyphenols showed dose-dependent scavenging activity against hydroxyl(·OH),hydrogen peroxide(H2O2),2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)and superoxide anion free radical(O-2·),and its hemi-inhibiting concentrations(IC50) were 481.18 μg/ml,151.43 μg/ml,8.19 μg/ml and 202.83 μg/ml,respectively.Results showed that the scavenging activity against DPPH and·OH of purified walnut residue polyphenols were stronger than VC,which was worth of further study.

walnut residue;ployphenols;macroporous resin;purification;antioxidant activity

TS229

A

0254-5071（2015）04-0055-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.013

2015-03-12

云南省教育廳科學(xué)研究重大專項項目（ZD2014009）；科技部科技支撐計劃項目（2011BAD46B00）；國家中醫(yī)藥管理局傣藥學(xué)重點學(xué)科（30970101808）

梁杏（1989-），女，碩士研究生，研究方向為中藥資源開發(fā)與利用研究。

*通訊作者：趙聲蘭（1962-），女，教授，碩士，研究方向為藥食資源開發(fā)與利用研究。