雜色曲霉最適生長(zhǎng)條件及抗藥性實(shí)驗(yàn)研究

董丹，關(guān)統(tǒng)偉，車(chē)振明*

（西華大學(xué)微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039）

雜色曲霉最適生長(zhǎng)條件及抗藥性實(shí)驗(yàn)研究

董丹，關(guān)統(tǒng)偉，車(chē)振明*

（西華大學(xué)微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039）

從發(fā)酵8個(gè)月豆瓣瓣子中分離獲得1株曲霉，編號(hào)為JC1156。經(jīng)真菌18S rRNA分子鑒定該菌為雜色曲霉（Aspergillus versicolor），與其最高同源性菌株的相似度為100%；對(duì)該菌的最適生長(zhǎng)條件及抗藥性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)該菌的最適生長(zhǎng)溫度為28℃、pH值為6.0、鹽含量為5%。測(cè)定了25種常用抗菌藥物對(duì)該菌的抑菌性，結(jié)果顯示，在25種抗菌藥物中，該菌對(duì)9種藥物具有抗性；分別為可奇霉素、林可霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、頭孢西丁、妥布霉素、奈替米星、克林霉素以及紅霉素。

雜色曲霉；抗藥性；生長(zhǎng)條件

郫縣豆瓣是以豆瓣為原料、霉菌為主要微生物菌種，經(jīng)自然制曲、天然發(fā)酵而成的特色調(diào)味品。傳統(tǒng)的豆瓣生產(chǎn)可大致分為3個(gè)階段：發(fā)酵制曲階段、發(fā)酵初期和發(fā)酵后期。豆瓣發(fā)酵過(guò)程中的微生物組成相當(dāng)豐富，不同時(shí)期微生物的組成也存在一定的差異。曲霉一般存在于制曲階段和瓣子發(fā)酵初期[1]。曲霉的種類(lèi)有很多，如黃曲霉（A.flavus）、煙曲霉（A.fumigatus）、灰綠曲霉（A.glaucus）、構(gòu)巢曲霉（A.nidurans）、寄生曲霉（A.parasiticus）、土曲霉（A.terreus）和雜色曲霉（A.versicolor）等。曲霉菌是發(fā)酵工業(yè)和食品工業(yè)的重要菌種，已被利用的近60種，但同時(shí)曲霉菌也是造成食物腐敗變質(zhì)的罪魁禍?zhǔn)?，其是過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎的常見(jiàn)誘因；雜色曲霉菌為曲霉菌屬的一種，是濕熱的沿海地區(qū)和內(nèi)陸常見(jiàn)的室內(nèi)外致敏真菌[2]。雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉和離蠕孢霉是產(chǎn)生雜色毒素的主要菌種[3]。上述這些霉菌廣泛存在于自然界中，會(huì)導(dǎo)致大麥、小麥、玉米、大豆、奶酪等糧食、食品和飼料的污染，尤其是對(duì)小麥、玉米的污染最為嚴(yán)重。產(chǎn)毒素最高的是雜色曲霉，其次是構(gòu)巢曲霉和離蠕孢霉[4-5]。雜色曲霉毒素（sterigmatocystin，ST）是日本學(xué)者YUICHI H等[6]從雜色曲霉菌絲體中首先分離并命名的，當(dāng)時(shí)未引起人們的重視。直至1960年英國(guó)爆發(fā)“火雞X病”證實(shí)為黃曲霉毒素中毒并有致癌作用[7-11]，從此才對(duì)結(jié)構(gòu)與其相似的雜色曲霉毒素引起注意。本實(shí)驗(yàn)從發(fā)酵8個(gè)月豆瓣瓣子中分離獲得1株雜色曲霉（Aspergillus versicolor）JC1156，為進(jìn)一步了解該菌株的生理特性，對(duì)其最適生長(zhǎng)條件及抗藥性進(jìn)行了研究，針對(duì)目前許多小型豆瓣企業(yè)黃曲霉毒素超標(biāo)的問(wèn)題，對(duì)豆瓣中產(chǎn)毒素菌株的研究十分有必要，這對(duì)未來(lái)豆瓣生產(chǎn)中黃曲霉毒素含量的控制及豆瓣產(chǎn)品品質(zhì)的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

從發(fā)酵8個(gè)月豆瓣瓣子中分離得到的曲霉，編號(hào)為JC1156，菌株分別以30%甘油管和20%牛奶罐保存于-20℃。

1.1.2 試劑

核酸染料（goldview）、三羧甲基氨基甲烷（Tris堿）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、TE緩沖溶液（Tris-EDTA buffer）：上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、甘油、無(wú)水乙醇、異戊醇、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、大豆磷脂、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：成都市科龍劑化工廠(chǎng)；ExTaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphote，dNTP）：大連Takara公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒（離心柱）：捷瑞生物工程（上海）有限公司。

1.1.3 抗菌藥物

本實(shí)驗(yàn)共選用25常用藥敏試紙（鏈霉素、慶大霉素、青霉素G、可奇霉素、林克霉素、多粘菌素B、奈替米星、奈替米星、呋喃妥因、新生霉素、萘啶酸、環(huán)丙沙星、卡那霉素、頭孢西丁、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、妥布霉素、克林霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐西林、羧芐青霉素、諾氟沙星、頭孢噻胯、利福平）：杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）[12]：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，自然pH。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TB-214型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHS-3C型酸度計(jì)：方舟科技有限公司；9700型PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；NGS721型分光光度計(jì)：北京中惠天城科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 霉菌的分子鑒定

DNA的提?。篋NA的提取采用改良十六烷基三甲溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）[13-14]法。得到的樣品總DNA于-20℃保存，作為后續(xù)PCR的模板。

PCR及產(chǎn)物的純化：以提取得到的DNA為模板，選擇真菌引物ITS4（5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；ITS5（5'-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。反應(yīng)條件：95℃、4 min；94℃、30 s，53℃、30 s，72℃、40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃、7min。PCR反應(yīng)體系為50μL：10×Buffer5μL、dNTP4μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 37.5 μL、DNA模板1 μL。PCR產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳時(shí)間40 min。純化過(guò)程按照DNA膠回收試劑盒中的步驟進(jìn)行，具體步驟參照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit試劑盒說(shuō)明。

測(cè)序：PCR產(chǎn)物純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）進(jìn)行Blast（Basic Local Alignment Search Tool）序列分析。

1.3.2 菌株母液的制備[15]

在LB斜面培養(yǎng)基上接種供試菌，放入30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h制成斜面種子，然后挑取1環(huán)菌種于裝有20 mL滅菌后的液體PDA培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，置于溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

1.3.3 鹽含量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

取0.5 mL菌株母液于裝有20 mL滅菌后的分別加入鹽含量為0、5%、10%、15%、20%的PDA液體培養(yǎng)基中，共5個(gè)錐形瓶，置于溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24 h，以液體PDA培養(yǎng)基作空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)660 nm處的吸光度值。菌株的生長(zhǎng)情況越好，菌體密度越大，吸光度值越大。

1.3.4 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

取0.5 mL菌株母液于裝有20 mL滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基中，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 h，以液體PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)660 nm處的吸光度值。

1.3.5 pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響[16]

將液體PDA培養(yǎng)基分別用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，取0.5 mL菌株母液于裝有20 mL已調(diào)好pH值的液體PDA培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，放入溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)28 h，以液體PDA培養(yǎng)基作空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)660 nm處的吸光度值。

1.3.6 菌株抗藥性檢測(cè)

抗菌藥物平板制備：在LB平板上加入100 μL母液，用涂布棒涂均勻后，用標(biāo)記筆將平板分為五等分，在每個(gè)部分放入一張藥敏性試紙，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)抑菌圈的產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分子鑒定

雜色曲霉經(jīng)PCR凝膠呈像結(jié)果見(jiàn)圖1。

將JC1156測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接過(guò)后，在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast序列比對(duì)，序列號(hào)為JX506349，經(jīng)同源性對(duì)比與Aspergillus versicolor相似度為100%，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》以及生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，最終確定JC1156為Aspergillus versicolor。

2.2 菌株最適生長(zhǎng)條件研究結(jié)果

2.2.1 鹽含量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

高鹽環(huán)境能抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)微生物浸泡在高鹽環(huán)境中時(shí)會(huì)因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外滲透壓過(guò)大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部嚴(yán)重失水直至微生物的死亡。鹽含量對(duì)菌株JC1156生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可看出，鹽含量為0～5%時(shí)，隨著鹽含量的增加，菌體密度逐漸增大，在鹽含量為5%時(shí)，菌體密度達(dá)到最大值，鹽含量＞5%后，隨著鹽含量的升高，菌體密度逐漸降低。表明適宜的鹽含量有利菌株的生長(zhǎng)。菌株JC1156雜色曲霉最適生長(zhǎng)鹽含量為5%。

2.2.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

溫度的高低影響微生物的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸的變性失活，而過(guò)低的溫度會(huì)使酶活力受到抑制，細(xì)胞的新陳代謝活力減弱[17]。不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可看出，溫度在24～28℃內(nèi)，隨著溫度的升高，菌體密度逐漸增大，當(dāng)溫度為28℃時(shí)，菌體密度最大，當(dāng)溫度＞28℃后，隨著溫度的升高，菌體的密度逐漸降低。表明適宜的溫度有益于菌株的生長(zhǎng)。菌株JC1156的最適生長(zhǎng)溫度為28℃。

2.2.3 pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在最適pH條件下，微生物細(xì)胞能達(dá)到最高生長(zhǎng)率。在此pH值下，微生物的細(xì)胞量達(dá)到最大，并且細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中所需的有關(guān)酶的活性也最高。不同pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可看出，pH值在4.0～6.0內(nèi)，菌體密度逐漸增大，在pH值為6.0時(shí)，菌體密度達(dá)到最大，在pH值＞6.0后，隨著pH值的增大，菌體密度逐漸減小。由此得出菌株JC11546生長(zhǎng)最適的pH值為6.0。

2.2.4 菌株抗藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了了解該曲霉的藥敏情況，以便為雜色曲霉的防治提供參考依據(jù)，本研究檢測(cè)了菌株JC1156對(duì)25種抗生素的抗藥性，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，在菌株的抗藥性實(shí)驗(yàn)中，菌株JC1156對(duì)9種常用藥物具有抗性，分別為可奇霉素、林可霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、頭孢西丁、妥布霉素、奈替米星、克林霉素以及紅霉素。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用純培養(yǎng)的方法從發(fā)酵8個(gè)月豆瓣瓣子中分離得到一株曲霉菌，經(jīng)18S rRNA分子鑒定得知該株曲霉為雜色曲霉（Aspergillus versicolor），編號(hào)為JC1156。通過(guò)對(duì)其最適生長(zhǎng)條件及抗藥性研究得到該菌的最適生長(zhǎng)溫度為28℃、最適生長(zhǎng)pH值為6.0、最適生長(zhǎng)鹽含量為5%，在抗藥性實(shí)驗(yàn)中，該菌對(duì)9種常用藥物都具有抗性。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果對(duì)于豆瓣中雜色曲霉菌生長(zhǎng)的抑制以及雜色曲霉毒素的控制提供了理論依據(jù)，為更好的保證豆瓣生產(chǎn)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

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DONG Dan,GUAN Tongwei,CHE Zhenming*
(Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province,Institute of Microbiology, Xihuan University,Chengdu 610039,China)

AspergillusJC1156 was isolated from eight months’fermented soybean paste.The strain was identified asAspergillus versicolorby 18S rRNA molecular identification,and it was 100%homology with the highest homology strains.The optimal growth conditions and drug resistance of the strain was studied.The results showed that the optimum condition was temperature 28℃,pH 6.0 and salt concentration 5%.Meanwhile,25 kinds of commonly antibacterial drugs were used to study antibacterial activity of the bacteria.The results showed that the strain was resistant to nine kinds of drugs:spectinomycin,lincomycin,ciprofloxacin,kanamycin,cefoxitin,tobramycin,netilmicin,clindamycin and erythromycin.

Aspergillus versicolor;drug resistance;growing conditions

Q93-331

A

0254-5071（2015）04-0051-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.012

2015-03-24

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目（No.13205639）

董丹（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ?/p>

*通訊作者：車(chē)振明（1960-），男，教授，本科，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵技術(shù)。