基于響應(yīng)面法的魯氏酵母發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

康遠軍，楊華，李欣，陳雄*，王志

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

基于響應(yīng)面法的魯氏酵母發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

康遠軍，楊華，李欣，陳雄*，王志

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是醬油及醬類生產(chǎn)中風(fēng)味形成的重要微生物之一。為了獲得大量菌體，采用響應(yīng)面法（RSM）對魯氏酵母CCTCC M 2013310培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，Plackett-Burman（PB）設(shè)計對培養(yǎng)基中相關(guān)影響因素的效應(yīng)進行評價，結(jié)果表明，葡萄糖、玉米漿和磷酸二氫鉀對生物量影響顯著。由中心組合及響應(yīng)面分析優(yōu)化確定優(yōu)化培養(yǎng)基為葡萄糖12.03%，玉米漿2.24%，酵母粉1%，磷酸二氫鉀0.26%，甘油3%，VB10.001%。優(yōu)化培養(yǎng)基的生物量為28.28 g/L，比未優(yōu)化前提高了4.5倍。

魯氏酵母；培養(yǎng)基；響應(yīng)面；優(yōu)化

在醬油釀造過程中，酵母菌的參與是必不可少的[1]。在醬油形成的中后期，酵母菌發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)酸產(chǎn)醇，并與乳酸菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)[2]。魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是最常見的耐高滲透壓酵母，其特點是能生長在含糖量極高的物料中，也能在含18%食鹽的基質(zhì)中繁殖[3]。在制曲及醬醪發(fā)酵期間，由空氣中自然落入而繁殖的魯氏酵母占醬醪中酵母總數(shù)的45%，它是發(fā)酵型酵母，出現(xiàn)在主發(fā)酵期。魯氏酵母的添加工藝已經(jīng)非常成熟，應(yīng)用比較廣泛，呈味效果已得到公認[4]。

醬油生產(chǎn)后期接入酵母菌進行后熟發(fā)酵的技術(shù)已推廣應(yīng)用多年，但直接添加酵母菌導(dǎo)致各批次的應(yīng)用效果差距很大。活性干酵母是由特殊培養(yǎng)的鮮酵母經(jīng)壓榨干燥脫水后仍保持強的發(fā)酵能力的干酵母制品，有含水量低，保藏期長、發(fā)酵穩(wěn)定性高的特點[5]。因此開發(fā)出利于工業(yè)化生產(chǎn)醬油的高活性、高穩(wěn)定性的干酵母對于制醬企業(yè)來說已不容忽視。目前活性干酵母的制備及應(yīng)用在釀酒和發(fā)酵面食加工領(lǐng)域的研究報道較多，而在醬類釀造領(lǐng)域中，活性干酵母的制備及應(yīng)用研究還很少[6]。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種解決多變量問題的統(tǒng)計試驗設(shè)計方法，在食品、發(fā)酵工程等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[7-8]。本研究從辣椒醬中分離得到一株高耐鹽性魯氏接合酵母，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，篩選出了對魯氏酵母經(jīng)濟可行的發(fā)酵培養(yǎng)基，對后期高密度發(fā)酵及活性干酵母的制備有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏酵母是湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院分離保藏菌種，Biolog分子鑒定系統(tǒng)結(jié)合生理生化試驗，鑒定為魯氏接合酵母，該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，專利保藏號為：CCTCCM2013310[9]。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%（固體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂），pH值為6.0[10]。

酵母粉：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；氨基酸類：美國Sigma公司；維生素類：武漢華順生物技術(shù)有限公司；其他試劑均來自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

wj-sx700高壓滅菌鍋：上海博訊有限公司；HNY-200D恒溫搖床：天津市歐諾儀器儀表有限公司；DGG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱：重慶銀河試驗儀器有限公司；5424R離心機：德國Eppendorf公司；UV-1102可見光分光光度計：尤尼柯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵方法及培養(yǎng)條件

將實驗室保藏的魯氏酵母CCTCC M 2013310菌種用YEPD斜面活化，恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)2～3 d。將活化好的斜面接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)30 h，獲得液體種子。試驗培養(yǎng)基中接入5%的液體種子，于28℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)20 h。

1.3.2 生物量的測定

細胞干質(zhì)量測定：取10 mL菌體發(fā)酵液于離心管中（離心管提前干燥并稱質(zhì)量），8 000 r/min離心10 min，收集菌體。將收集到的菌體用去離子水洗滌2次，放入干燥箱中于80℃干燥至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量并計算細胞干質(zhì)量（g/L）[11]。

細胞光密度（OD600nm）測定：菌液發(fā)酵液離心后去掉上清液，菌體稀釋后于波長600 nm處以去離子水為對照進行比色測定，OD600nm=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)[12]。

1.3.3 碳源單因素試驗

在無碳源的YEPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別以2%葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜和麥芽糖為碳源，選擇最優(yōu)碳源，并考察不同質(zhì)量分數(shù)（5%、10%、15%、20%、25%、30%）的葡萄糖對酵母生物量的影響。

1.3.4 氮源單因素試驗

在無氮源的YEPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以1%的量添加有機氮源或無機氮源：胰蛋白胨、工業(yè)蛋白胨、酵母浸粉、酸水解酪蛋白、玉米漿、氯化銨、硝酸鈉和硫酸銨，考察酵母最佳利用氮源。

在不含氮源的簡單復(fù)合培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，考察不同有機氮源含量（1%、2%、3%、4%、5%）對酵母生物量的影響，以及不同無機氮源含量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對酵母生物量的影響。

選取4%的氮源為總氮源，以玉米漿和酵母粉為復(fù)合氮源，添加比例為玉米漿/酵母粉為4/0、3/1、2/2、1/3、0/4；以玉米漿和硝酸鈉為復(fù)合氮源，玉米漿添加量為4%，硝酸鈉添加量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。

1.3.5 其他營養(yǎng)物質(zhì)單因素試驗

以碳源及氮源的結(jié)果得到初優(yōu)培養(yǎng)基：葡萄糖20%、玉米漿3%、酵母粉1%和硝酸鈉0.5%。分別向初優(yōu)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分數(shù)為0.1%的磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鋅、硫酸鐵及0.02%的硫酸錳，考察其對酵母生長的影響；分別向初優(yōu)培養(yǎng)基中添加0.1%的谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸，考察其對酵母生長的影響；分別向初優(yōu)培養(yǎng)基中添加0.001%的硫胺素（VB1）、肌醇、膽堿、泛酸、生物素、核黃素、煙酸、吡哆醛、對氨基苯甲酸，考察其對酵母生長的影響；分別向初優(yōu)培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的甘油，考察其對酵母生長的影響。

1.3.6 Plackett-Burman試驗設(shè)計

試選用n=12的PB設(shè)計，把每個因素設(shè)計成高（+1）和低（-1）2個水平。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，結(jié)合酵母細胞的生長特點，最終確定葡萄糖（A）、玉米漿（B）、酵母粉（C）、硝酸鈉（D）、谷氨酰胺（E）、甘油（F）、磷酸二氫鉀（G）、硫胺素（H）這8個因素為PB試驗的考察對象。

1.3.7 最陡爬坡試試驗設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果各顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長及變化方向，以快速逼近最佳區(qū)域。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負和大小確定，正效應(yīng)的因素均取較高值，負效應(yīng)的因素均取較低值。找到魯氏酵母產(chǎn)量最高的處理，即為下一步響應(yīng)面分析的中心點。

1.3.8 響應(yīng)面分析實驗方法

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，顯著因素以中心點為零水平，高水平和低水平分別比零水平高于或低于一個實際步長。用Design Expert軟件設(shè)計中心組合試驗并進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

根據(jù)表1中的試驗結(jié)果，不同碳源對魯氏酵母生物量（OD600nm）的影響差異顯著，葡萄糖作為碳源的優(yōu)勢比較明顯，因此選擇葡糖糖作為碳源。葡萄糖質(zhì)量分數(shù)優(yōu)化結(jié)果表明該魯氏酵母耐糖性很高，葡萄糖作為單糖是微生物最容易利用的碳源，但過多的葡萄糖會形成Crabtree效應(yīng)（葡萄糖效應(yīng)）[13]，抑制菌體的生長，降低葡萄糖的利用率，因此選擇葡萄糖的添加量為20%。

氮源試驗中，有機氮源酵母粉和玉米漿的OD600nm值達到了11.03和11.01，酵母粉是新鮮酵母自溶濃縮后形成的，含有多種維生素及生長因子能夠促進酵母細胞的生長[14]；玉米漿是制玉米淀粉的副產(chǎn)物，含有豐富的可溶性蛋白、氨基酸、還原糖、生長因子和一些前體物質(zhì)[15]，適于酵母生長；無機氮源是微生物生長的速效氮源，硝酸鈉是3種無機氮源中生物量最高的，因此在復(fù)合氮源的優(yōu)化中，選擇酵母粉、玉米漿和硝酸鈉作為考察對象。在復(fù)合氮源試驗組中，以3%的玉米漿及1%的酵母粉組成的復(fù)合氮源得到的發(fā)酵效果最佳，向培養(yǎng)基中添加少量的無機氮源有利于減少發(fā)酵過程延滯期的時間，最后以3%玉米漿、1%酵母粉和0.5%的硝酸鈉為初優(yōu)培養(yǎng)基的氮源。

以碳源及氮源的結(jié)果得到初優(yōu)培養(yǎng)基：葡萄糖20%、玉米漿3%、酵母粉1%和硝酸鈉0.5%。通過培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質(zhì)試驗結(jié)果及酵母生長特點的分析，確定0.4%谷氨酰胺、3%甘油、0.1%磷酸二氫鉀及0.001%VB1添加到初優(yōu)培養(yǎng)基進行PB試驗。

2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

按Plackett-Burman試驗設(shè)計進行試驗，把每個因素設(shè)計成高（+1）和低（-1）2個水平，高水平是低水平的1.25倍。PB試驗設(shè)計及響應(yīng)值（魯氏酵母OD600nm值）結(jié)果見表2，各因素水平及顯著性分析見表3。

由表3可看出，酵母粉、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、VB1表現(xiàn)為正效應(yīng)，葡萄糖、玉米漿、谷氨酰胺、甘油表現(xiàn)為負效應(yīng)?？尚哦龋?5%的因素為葡萄糖、磷酸二氫鉀，表現(xiàn)為極顯著。玉米漿的貢獻值排在第3位，可信度＞90%。因此確定葡萄糖、磷酸二氫鉀、玉米漿為主要影響因素進行下一步試驗。考慮到魯氏酵母不能利用硝酸鹽，在后續(xù)實驗中不再添加硝酸鈉。

2.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)根據(jù)表3分析結(jié)果，顯著因素的變化步長及方向的試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

從表4可以看出，最佳因素組合在第2組。但是隨著葡萄糖濃度的下降，1～5組的細胞產(chǎn)量很接近，細胞對葡萄糖的得率下降。較低的葡萄糖含量有利于酵母的生長，因此選擇第5組的水平作為響應(yīng)面的中心點，即葡萄糖12%、玉米漿2.2%、KH2PO40.26%。

2.4 響應(yīng)面分析的試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗確定了重要影響因素的取值的區(qū)間。利用Design Expert進行中心組合的試驗設(shè)計，對魯氏酵母發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素做進一步的研究和探討，將最陡爬坡試驗中的3個因素葡萄糖含量、玉米漿含量、KH2PO4含量分別標記為X1、X2、X3，以魯氏酵母發(fā)酵20 h后OD600nm值（Y）作為響應(yīng)值，試驗因素與水平見表5，設(shè)計及結(jié)果見表6，回歸模型方差分析結(jié)果見表7。

根據(jù)表6試驗結(jié)果通過Design-Expert軟件進行響應(yīng)面分析，建立多元二次回歸方程如下：

由表7可知，模型大于F值的概率P＜0.01，表明模型非常顯著對響應(yīng)值Y的影響非常顯著，可信度較高；模型的二次項對魯氏酵母產(chǎn)量的效應(yīng)影響非常顯著（P＜0.01），交互項X2X3較為顯著；模型失擬項的P值為0.373 4，表明模型符合實際情況，可以用此模型對魯氏酵母的產(chǎn)量進行分析和預(yù)測。

2.5 最適培養(yǎng)基組成的確定及驗證試驗

根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖，以確認葡萄糖、玉米漿、KH2PO43個因素對魯氏酵母產(chǎn)量的影響，響應(yīng)面圖見圖1。

由圖1可知，該方程的拋物線圖形開口均向下，說明方程存在最大值，即響應(yīng)面范圍覆蓋了最大值所在的區(qū)域。由Design Expert軟件分析得到最適培養(yǎng)基中葡萄糖、玉米漿和KH2PO4所對應(yīng)的實際值分別為12.03%、2.24%、0.26%。由此可知，最適培養(yǎng)基組成為葡萄糖12.03%，玉米漿2.24%，酵母粉1%，磷酸二氫鉀0.26%，甘油3%，VB10.001%。預(yù)測在此組成條件下發(fā)酵20 h魯氏酵母生物量最大，OD600nm值為38.717 4。

使用上述培養(yǎng)基進行魯氏酵母發(fā)酵培養(yǎng)的驗證試驗，結(jié)果見圖2。由圖2可知，魯氏酵母在優(yōu)化培養(yǎng)基的生長曲線20 h時的OD600nm值在40左右，與預(yù)測值相近，經(jīng)過24 h魯氏酵母生長達到穩(wěn)定期，最大OD600nm值為59.125，對應(yīng)的細胞干質(zhì)量為28.28 g/L，優(yōu)化前的YEPD培養(yǎng)基最大細胞質(zhì)量為5.12 g/L，優(yōu)化培養(yǎng)基比YEPD培養(yǎng)基細胞干質(zhì)量提高了4.5倍。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母粉和玉米漿。部分因子試驗表明葡萄糖、玉米漿和磷酸二氫鉀對生物量的影響顯著。經(jīng)中心組合試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析，確定了優(yōu)化培養(yǎng)基組成為葡萄糖12.03%，玉米漿2.24%，酵母粉1%，磷酸二氫鉀0.26%，甘油3%，VB10.001%。建立了以生物量為響應(yīng)值的二次模型：Y=38.685-0.065 4X1+0.350 9X2-0.036 1X3+0.363 2X1X2+ 0.6878X1X3+1.414 1X2X3-2.208 8X12-1.212 8X22-1.542 2X32。驗證試驗結(jié)果證明了該模型的正確性，經(jīng)過24 h魯氏酵母生長達到穩(wěn)定期，最大OD600nm值為59.125，對應(yīng)的細胞干質(zhì)量為28.28 g/L，優(yōu)化前的YEPD培養(yǎng)基最大細胞干質(zhì)量為5.12 g/L，優(yōu)化培養(yǎng)基細胞干質(zhì)量比未優(yōu)化前提高了4.5倍。

[1]王夫杰，魯緋.我國醬油研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].中國釀造，2010， 29（12）：3-7.

[2]王夫杰，魯緋，趙俊平，等.醬油風(fēng)味及其檢測方法的研究進展[J].中國釀造，2010，29（8）：6-10.

[3]徐瑩，姜維，何曉霞.耐鹽性魯氏酵母的研究進展[J].中國釀造，2009，28（10）：1-4.

[4]LUH B S.Industrial production of soy sauce[J].J Ind Microbiol,1995, 14(6):467-471.

[5]張輝，李海梅，程建軍，等.魯氏酵母和球擬酵母活性干酵母的制備研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（8）：64-66.

[6]FERRARINI R,BOCCA E,CAVAZZA A.Mechanical dispersion procedures improve the rehydration of active dry yeast[J].Enzyme Microb Tech,2007,40(5):1251-1255.

[7]李淑娟，詹亞光，楊傳平，等.基于響應(yīng)面法的白蠟屬花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基優(yōu)化[J].植物學(xué)報，2009，44（2）：223-228.

[8]李嘯，張婭，李建華，等.響應(yīng)面法優(yōu)化紫紅紅球菌的發(fā)酵培養(yǎng)基[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，17（5）：15-19.

[9]陳雄，代俊，王志.一種高耐鹽魯氏接合酵母：中國，CN103589651A [P].2014-02-19.

[10]杜連祥，路福平.微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2006.

[11]郭美錦，莊英萍，儲炬，等.重組巴氏畢赤酵母高密度發(fā)酵表達rHSA[J].微生物學(xué)報，2002，42（1）：62-68.

[12]ROMANOS M A,SCORER C A,CLARE J J.Foreign gene expression in yeast:a review[J].Yeast,1992,8(6):423-488.

[13]RODRIGUES F,LUDOVICO P,LE?O C.Sugar metabolism in yeasts: an overview of aerobic and anaerobic glucose catabolism[M].Biodiversityand ecophysiologyof yeasts.Springer Berlin Heidelberg,2006.

[14]于景芝，陳堯燊，俞學(xué)鋒，等.酵母生產(chǎn)與應(yīng)用手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2005.

[15]YANG T W,RAO Z M,ZHANG X,et al.Effects of corn steep liquor on production of 2,3-butanediol andacetoin byBacillus subtilis[J].Process Biochem,2013,48(11):1610-1617.

KANG Yuanjun,YANG Hua,LI Xin,CHEN Xiong*,WANG Zhi

(Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Key Laboratory Fermentation Engineering Ministry of Education,College of Bioengineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Zygosaccharomyces rouxiiis one of the important microbe in the flavor formation of soy sauce and other sauces production.In order to obtain more biomass,response surface methodology was used to optimize fermentation medium composition forZ.rouxiiCCTCC M 2013310.Plackett-Burman design was used to evaluate the influence of related factors on medium.The results of PB design indicated that contents of glucose,corn steep liquor and KH2PO4affected the biomass significantly.The optimum medium was obtained with central composite design and response surface analysis method as follows:glucose 12.03%,corn steep liquor 2.24%,yeast extract 1%,KH2PO40.26%,glycerol 3%,VB10.001%.The maximum cell mass in optimum medium was 28.28 g/L,improved 4.5 times than the non-optimized one.

Zygosaccharomyces rouxii;medium;response surface methodology;optimization

TQ925

A

0254-5071（2015）04-0025-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.007

2015-04-03

湖北省自然科學(xué)基金重點項目（No.2012FFA058）；武漢市重點科技攻關(guān)項目（No.201220822278-1）

康遠軍（1990-），男，碩士研究生，研究方向為釀造工程。

*通訊作者：陳雄（1969-），男，教授，博士，研究方向為釀造工程。