動物卵巢組織的凍存技術(shù)

李 娜 張云山

1.天津醫(yī)科大學(xué)（300070）；2.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

目前，隨著放療和化療技術(shù)不斷發(fā)展，女性癌癥患者存活率大幅度提高。然而，放療和化療會對年輕女性患者卵巢功能造成極大損傷，進而使其生育能力顯著降低。研究表明，在接受化療的年輕女性癌癥患者中，超過1／3會發(fā)展成卵巢早衰［1］；使用標(biāo)準(zhǔn)盆腔放療劑量將無一例外導(dǎo)致卵巢早衰。因此，癌癥治愈后生育力保存就顯得尤為重要。目前，人類卵巢組織凍存技術(shù)已取得一定進展，但由于受到倫理等問題限制尚缺乏系統(tǒng)研究。而動物繁殖周期短，其卵巢在結(jié)構(gòu)和功能上與人卵巢相似，因此目前研究主要依靠動物實驗進行，本文就近年來動物卵巢組織凍存技術(shù)綜述如下。

1 概述

20世紀(jì)30年代，甘油作為冷凍保護劑問世。隨后，開始用甘油凍存動物卵巢組織。1960年，Parrott等［2］用甘油凍存小鼠卵巢組織，解凍移植后獲得了成功妊娠和分娩。但是由于受當(dāng)時冷凍保護劑和冷凍設(shè)備的限制，解凍后只有10%的原始卵泡存活。隨后，乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）、二甲基亞砜（DMSO）等新型冷凍保護劑問世，動物卵巢組織凍存的成功率大幅度提高。目前，研究動物卵巢組織凍存最常用模型是綿羊，因為其卵巢體積、組成、卵泡密度和人相近，且綿羊是單排卵動物［3－4］。此外，小鼠、大鼠、兔等也是較常用的動物模型。

保存生育力的方法包括胚胎凍存、卵子凍存和卵巢組織凍存。相對于前兩者而言，卵巢組織凍存具有明顯優(yōu)勢：①不需要卵巢刺激，可在月經(jīng)周期任何時間進行；②不需要男方精子，是青春期前女性保存生育力的唯一方法［5］；③卵巢皮質(zhì)含有大量始基卵泡，其體積較小，冷凍保護劑能迅速穿透其內(nèi)部卵細胞，和生長卵泡相比，代謝不活躍，透明帶缺乏，因此冷凍損傷較??；④卵巢組織凍融移植后可恢復(fù)患者內(nèi)分泌功能。但卵巢細胞種類多，各種細胞的數(shù)目、大小、水含量以及對冷凍保護劑的滲透性不同，且存在血管系統(tǒng)，這就勢必導(dǎo)致卵巢凍存相對于胚胎凍存和卵子凍存而言難度更大。

2 凍存方法

2.1 慢速程序化冷凍

該方法運用低濃度冷凍保護劑在程序化冷凍保護儀控制下，緩慢降溫使細胞充分脫水。脫水過程中，滲透性冷凍保護劑進入細胞內(nèi)稀釋細胞內(nèi)電解質(zhì)，使細胞內(nèi)溶質(zhì)性和冰晶損傷降到最低，從而保護細胞。較適合凍存體積小、代謝率低、缺乏細胞器和皮質(zhì)顆粒的始基卵泡。研究表明，慢速程序化冷凍具有以下優(yōu)勢：①已應(yīng)用多年，技術(shù)成熟，效果穩(wěn)定；②對卵巢皮質(zhì)中始基卵泡損傷較??；③竇卵泡顆粒細胞和卵泡膜細胞凋亡較少［6］；④溶質(zhì)擴散更好。但該方法也有其局限性：①對卵巢基質(zhì)和血管損傷相對較大［7］；②需要較昂貴的程序冷凍儀控制降溫速度，耗時長，過程復(fù)雜，一般實驗室不易實施。

2.2 玻璃化冷凍

該方法運用高濃度冷凍保護劑在快速降溫過程中由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o結(jié)構(gòu)的玻璃化狀態(tài)或無冰晶結(jié)構(gòu)的固態(tài)，減少冷凍過程中冰晶形成，從而降低冷凍損傷。對卵泡存活率的影響目前尚無定論。研究顯示該方法凍存卵巢組織后卵泡存活率與慢速程序化冷凍接近，也有學(xué)者認為，解凍后的卵泡存活率較慢速程序化冷凍更高（分別是89%和42%）［8］。另有研究表明，兩者對卵泡形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)［9］、壞死細胞比例和解凍移植后組織血管再生方面的影響［10］并沒有顯著差別。目前研究認為玻璃化冷凍具有以下優(yōu)點：①省時、操作簡便、花費少；②降溫速度可＞1500℃／min，使胞質(zhì)內(nèi)外的水物質(zhì)迅速通過5～15℃的冷凍敏感區(qū)，可最大限度減少細胞內(nèi)冰晶形成；③對卵巢血管形態(tài)損傷較輕。但該方法也有不足之處：①需要高濃度冷凍保護劑，對細胞毒性作用較強；②卵母細胞胞漿損傷更嚴(yán)重；③解凍后正常竇前卵泡率下降［11］，這是由于細胞暴露在高滲透壓環(huán)境中、高濃度冷凍保護劑毒性作用［12］、基膜損壞［13－14］等原因引起的。相對于慢速程序化冷凍而言，該方法操作簡單，已經(jīng)在動物模型中取得一定成功。Sugimoto等［15］用該法凍存出生10～12d幼鼠雙側(cè)卵巢，解凍后移植到一側(cè)腎囊內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)分泌功能恢復(fù)時間與新鮮卵巢組織移植組沒有明顯差異。

2.3 快速冷凍

快速冷凍法是將卵巢組織置于低鈉濃度的冷凍保護劑中，在液氮蒸汽中放置超過12h后投入液氮。該方法凍存效果會因液氮蒸汽發(fā)生器的不同而出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定現(xiàn)象，所以目前研究較少。

3 影響因素

3.1 冷凍保護劑的選擇

冷凍保護劑通過脫水、調(diào)整滲透壓、減少細胞內(nèi)冰晶形成和穩(wěn)定細胞內(nèi)蛋白質(zhì)等作用來保護細胞在冷凍復(fù)蘇過程中免遭損傷，可分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑。前者有DMSO、PROH、EG等，后者有蔗糖、葡萄糖、脂蛋白等。研究顯示不同冷凍保護劑凍存卵巢組織后原始卵泡存活率由高到低依次為EG（84%）、DMSO（74%）、PROH（44%）、甘油（10%）［16］。目前，DMSO 和 PROH 是最常 用 的 冷凍保護劑［17］。使用冷凍保護劑的目的是在達到冷凍效果的同時降低其細胞毒性。降低細胞毒性的方法有：①選擇毒性較小的冷凍保護劑，如EG、PROH等；②聯(lián)合應(yīng)用兩種或兩種以上冷凍保護劑，既可以降低各冷凍保護劑濃度，又有利于不同性質(zhì)冷凍保護劑協(xié)同作用，如聯(lián)合應(yīng)用DMSO、PROH和EG對卵巢組織進行玻璃化冷凍，得到正常卵泡比率可達92.31%［18］；③添加毒性中和劑，如在DMSO中加入適量甲酰胺；④運用毒性小的新型保護劑，如多聚賴氨酸、抗冷凍蛋白等。

3.2 卵巢組織塊大小的選擇

冷凍前需對卵巢組織進行修整并切割成較小組織塊，以剔除不含卵泡的髓質(zhì)和黃體，利于冷凍保護劑滲透。但研究表明，卵巢組織解凍移植后功能維持時間過短與移植卵巢組織體積偏小有關(guān)。Baird等［19］用小皮質(zhì)塊凍存方法凍存綿羊卵巢組織，解凍自體移植后4個月卵巢功能恢復(fù)，但只維持了兩年。因此，為了使移植后卵巢功能維持更長時間，應(yīng)在保證卵泡存活率前提下，盡量增加皮質(zhì)塊體積［20］。但皮質(zhì)塊越大，冷凍效果越差，且解凍移植后血管形成所需時間越長，缺血再灌注損傷越嚴(yán)重。Kagawa等［21］將牛卵巢組織切割成1mm×10mm×10mm大小行玻璃化冷凍，解凍后卵母細胞存活率89%。Nyachieo等［22］將東非狒狒卵巢組織切割成1mm3組織塊行玻璃化冷凍，解凍后卵泡存活率67.1%。理論上，卵巢組織塊越薄越有利于冷動保護劑滲入，但若組織塊太小，會在切割過程中造成過多卵泡丟失。因此，目前認為將卵巢組織切成厚約0.75～1mm，表面積1mm2～1cm2大小時冷凍效果最好。

3.3 冷凍損傷

冰晶形成、冷凍保護劑的毒性作用、細胞凋亡以及移植后缺血和缺氧損傷是導(dǎo)致卵泡大量丟失的主要原因。冷凍過程中，隨著溫度降低到冰點以下，細胞內(nèi)的水會形成細胞內(nèi)冰晶。微小的冰晶對細胞沒有明顯損傷作用，但冰晶越大，對細胞造成的損傷也越大。冰晶主要通過機械作用損傷細胞膜及其他細胞器的膜性結(jié)構(gòu)，并對細胞內(nèi)的各種細胞器和細胞骨架造成擠壓。

冷凍保護劑為化學(xué)物質(zhì)，會對細胞造成一定損傷。DMSO作為最有效的冷凍保護劑已被應(yīng)用多年，但是研究表明其毒性較大而且會影響細胞的分化過程［23］。Demirci等［24］在研究綿羊卵巢組織凍存實驗中發(fā)現(xiàn)PROH和DMSO會導(dǎo)致細胞萎縮、細胞質(zhì)空泡形成和細胞核固縮。Oskam等［25］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PROH凍存卵巢組織會使正常形態(tài)竇卵泡比例顯著下降，且造成嚴(yán)重的間質(zhì)損傷。

Mazoochi［26］等發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢組織凍存后凋亡相關(guān)因子表達增強，說明凋亡也是引起凍存過程中卵泡丟失的主要原因。Choi等［27］研究發(fā)現(xiàn)慢速程序化冷凍及玻璃化冷凍均會抑制小鼠卵巢中始基卵泡發(fā)育，使細胞凋亡率增加。Xiao等［28］通過針形浸潤玻璃化法（NIV）凍存卵巢組織，發(fā)現(xiàn)隨冷凍保護劑濃度降低，凋亡率顯著下降，說明冷凍保護劑的毒性作用是引起凋亡的原因之一。

卵巢組織凍存后主要用來移植或體外培養(yǎng)。因為卵巢皮質(zhì)塊移植沒有血管吻合，移植后血供完全依靠周圍毛細血管生長，所以移植后最初一段時間處于缺血、缺氧狀態(tài)。原始卵泡可耐受局部缺血至少4h，而間質(zhì)組織對局部缺血更加敏感。Baird等［19］凍存綿羊卵巢組織發(fā)現(xiàn)，因移植后缺血導(dǎo)致的卵泡丟失遠遠大于低溫冷凍造成的損傷。Lee等［29］研究小鼠卵巢組織凍存時也發(fā)現(xiàn)，卵泡大量丟失主要發(fā)生于移植過程。因此，通過縮短移植后血管再生時間來降低缺血、缺氧引起的卵泡丟失成為研究的熱點。

4 降低冷凍損傷的新型化合物

4.1 抗冷凍蛋白

抗冷凍蛋白的主要成分是糖肽類，其不僅可以通過吸附－抑制機制抑制冰晶生長，而且可以保護細胞膜結(jié)構(gòu)完整性，是目前在研的一種理想冷凍保護劑。Martínez－Páramo等［30］研究表明在斑馬魚胚胎早期向其中導(dǎo)入抗冷凍蛋白，能夠有效增強細胞保護作用。Bagis等［31］對攜帶轉(zhuǎn)抗冷凍蛋白基因小鼠的卵巢組織進行凍存，發(fā)現(xiàn)抗冷凍蛋白明顯提高了冷凍效果。但是抗冷凍蛋白是從極地魚、過冬昆蟲等生物體中提取和純化出來的，進行大規(guī)模生產(chǎn)時費用昂貴。

4.2 多聚賴氨酸

多聚賴氨酸是一種聚兩性電解質(zhì)，毒性較傳統(tǒng)冷凍保護劑小。因氨基和羧基比列恰當(dāng)，使其表現(xiàn)出較理想的冷凍效果。Matsumura等［32］發(fā)現(xiàn)多聚賴氨酸可有效防止冰晶形成，效果優(yōu)于DMSO。同時，多聚賴氨酸具有和抗冷凍蛋白相同的吸附作用，因此能更好地保護細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。

4.3 動物血清

動物血清中含有血漿蛋白、碳水化合物、生長因子及無機物等，是一種復(fù)合型冷凍保護劑。在冷凍液中加入動物血清，可降低其他冷凍保護劑的毒性。目前，應(yīng)用最廣泛且冷凍保護效果較佳的是胎牛血清。Carvalho等［33］用玻璃化冷凍法凍存山羊卵巢組織，發(fā)現(xiàn)含0.25mol／L蔗糖及10%胎牛血清的冷凍保護劑效果最佳。Lunardia等［34］用六種不同玻璃化液凍存山羊卵巢組織，發(fā)現(xiàn)含6mol／L EG、0.25mol／L蔗糖以及10%胎牛血清的玻璃化液效果好。然而，動物血清在具有較好冷凍保護作用的同時，也存在弊端，即來自動物的血清在臨床使用會增加感染風(fēng)險。因此，如何在使用動物血清作為冷凍保護劑的同時降低其感染風(fēng)險，是亟待解決的問題。

4.4 海 藻 糖

海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過糖苷鍵連接成的非還原性糖，其細胞毒性較小且自身性質(zhì)穩(wěn)定，在低溫、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下，能在細胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而對細胞膜起到保護作用，而且海藻糖可以在冷凍過程中形成穩(wěn)定的玻璃化狀態(tài)［35］，是一種天然的冷凍保護劑。

5 總結(jié)

卵巢冷凍保存雖然處于試驗階段，但是因其不會延誤癌癥患者治療時間以及凍融移植后可恢復(fù)卵巢內(nèi)分泌功能等優(yōu)勢而具有廣闊應(yīng)用前景。目前，卵巢組織凍存已經(jīng)在大量動物實驗中取得了一定成功，為年輕女性癌癥患者，尤其是青春期前女性和未婚女性帶來了曙光。但如何降低冷凍損傷仍是目前面臨的主要問題。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，卵巢組織凍存技術(shù)定會日趨完善，從而為人類生育力保存做出巨大貢獻。

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