白酒釀造體系厭氧微生物研究進展

曾 超，邱樹毅，胡寶東，陳美竹，徐 佳，王曉丹，3*

（1.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

白酒是我國傳統(tǒng)的蒸餾酒，是世界七大蒸餾酒之一，在白酒釀造過程中，無論是液態(tài)、半固態(tài)，還是固態(tài)發(fā)酵法，在進行堆積、發(fā)酵過程中，經(jīng)過不斷地馴化和發(fā)酵，酒醅和窖池都會形成獨有的適合厭氧微生物生長的厭氧環(huán)境，厭氧微生物不斷地代謝繁殖生長，進而形成一系列厭氧微生物體系，在堆積、發(fā)酵過程中必然發(fā)揮著重要的作用，由于厭氧菌是一類在無氧條件下比在有氧環(huán)境中生長好的細菌，這類細菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無氧發(fā)酵的方式進行，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙醇、乳酸、己酸等，就必然會影響釀酒體系中的pH值和白酒的風味。因此對白酒釀造體系中酒醅和窖池的厭氧微生物的研究是很有現(xiàn)實意義的。然而由于厭氧微生物在有氧存在的情況下基本不生長或者死亡，對厭氧微生物的厭氧環(huán)境很難保證，這就給分離篩選出純種厭氧微生物帶來了更大的困難。直到最近二十年，由于自動厭氧手套箱的出現(xiàn)，再加上新技術新方法的應用，對厭氧微生物的研究取得了很大的進展，并獲得了一系列豐碩的成果[1]。

厭氧微生物是一大群專性厭氧，必須在無氧環(huán)境中才能生長的微生物，一般主要是細菌。霉菌和酵母均是好氧或兼性厭氧菌[2]。厭氧微生物主要可分為兩大類[3]：一類是革蘭染色陽性有芽胞的厭氧芽胞梭菌，另一類是無芽胞的革蘭陽性及革蘭陰性球菌與桿菌。前一類因有芽胞，抵抗力強，在自然界（水、土等）、動物及人體腸道中廣泛存在，并且能長期耐受惡劣的環(huán)境條件，在窖泥、酒醅中均有發(fā)現(xiàn)；后一類則是人體的正常菌群，可與需氧菌、兼性厭氧菌共同存在于口腔、腸道、上呼吸道、泌尿生殖道等，這類無芽胞厭氧菌的致病性屬于條件致病性的內源性感染，在長期使用抗生素、激素、免疫抑制劑等發(fā)生菌群失調或機體免疫力衰退時，或細菌進入非正常寄居部位時才可致病。本文主要對現(xiàn)階段厭氧微生物的培養(yǎng)技術及其白酒釀造體系厭氧微生物的研究現(xiàn)狀做概述，為相關研究的順利開展提供理論依據(jù)。

1 厭氧微生物培養(yǎng)技術的研究

厭氧菌培養(yǎng)日益引起臨床細菌檢驗人員的重視。厭氧曲培養(yǎng)的一個關鍵性問題就是厭氧條件是否合格，只有厭氧條件合格才能提高厭氧菌的分離率[4]。目前厭氧微生物的培養(yǎng)技術主要有平板厭氧技術（主要包括平皿夾層厭氧法、平板培養(yǎng)瓶厭氧技術）、亨蓋特（Hungate）滾管技術、厭氧手套箱技術等。

1.1 平板厭氧技術[5]

1.1.1 平皿夾層厭氧法

平皿夾層厭氧法具體操作是：將瓊脂培養(yǎng)基滅菌后，倒入平板中（三分之一左右），再將不同梯度的菌懸液分別取0.1 mL涂布于平板上（同好氣操作），讓菌懸液滲透10 min，再倒入瓊脂培養(yǎng)基至剛好未溢出的狀態(tài)，蓋上皿蓋并下壓，排除皿內的氣泡，使其達到嚴格厭氧狀態(tài)，并用瓊脂密封皿口培養(yǎng)。穆軍等[6]結合常規(guī)好氧細菌和嚴格厭氧細菌分離純化方法的優(yōu)點，設計了平皿夾層厭氧法，并將之成功地運用于硫酸鹽還原細菌（嚴格厭氧）和脫氮硫桿菌（兼性厭氧）菌株的分離純化。

1.1.2 平板培養(yǎng)瓶厭氧技術[7]

平板培養(yǎng)瓶厭氧技術是利用寬體窄頸瓶形成培養(yǎng)瓶底部的平面，進行菌液涂布或滴加菌滴并輕搖涂布法，用氮氣吹脫培養(yǎng)瓶內空氣（氧氣）。配制培養(yǎng)基過程中，利用加熱煮沸驅逐液相溶解氧和利用氮氣吹脫瓶內氣相空氣的方式，保證嚴格厭氧，加瓊脂0.2%～0.5%，吸收多余水分。全部實驗操作采用吹氮氣脫氧和加熱驅氧法。韓靜等[8]通過利用簡單的酸處理與熱處理相結合的方法，并結合平面厭氧操作技術與培養(yǎng)瓶厭氧技術，成功的分離得到了一株高溫產(chǎn)氫菌。此菌在45～50 ℃范圍內具有較強的產(chǎn)氫能力。此菌為高溫產(chǎn)氫菌，并且在85 ℃下處理10 min后仍然具有一定的活性，這有利于簡化菌種的純化，但是操作繁瑣，厭氧環(huán)境不易控制，很難達到厭氧菌的生長條件。該方法雖然能分離出嚴格厭氧菌，但使用并不廣泛。

1.2 亨蓋特（Hungate）滾管技術

亨蓋特厭氧滾管技術主要原理是管內的銅柱不斷被氧化被還原以實現(xiàn)除氧的目的，達到無氧狀態(tài)。與亨蓋特厭氧滾管技術相比，厭氧袋、厭氧罐的除氧效果不太理想，很難保證厭氧微生物所需的無氧狀態(tài)，厭氧箱價格昂貴，設備維護費用較高。亨蓋特厭氧滾管技術是一種能夠達到無氧狀態(tài)，操作較簡便的理想的分離篩選各種厭氧微生物的方法。李平蘭等[9]成功利用亨蓋特厭氧滾管技術檢測雙歧桿菌制品中的活菌數(shù)。鄧功成等[10]采用亨蓋特厭氧滾管技術，從厭氧消化器中分離得到嚴格厭氧微生物甲烷菌。結果顯示，亨蓋特厭氧滾管分離培養(yǎng)技術方法可靠，分離的效果好，適用于各種嚴格厭氧微生物的分離純化。

1.3 厭氧手套箱技術[11]

手動厭氧箱：其操作是關閉交換室內門，外門打開，將物品放入交換室，再關閉外門，啟動抽氣泵，抽去箱內的空氣，待壓力計指針接近不動，關閉抽氣泵，打開箱內進氮氣按鈕，待氮氣充滿操作室時，關閉箱內進氮氣按鈕，再打開抽氣泵，如此循環(huán)3～5次后，再打開室內混合氣按鈕，充進混合氣，過道同室內操作相同。操作完畢后，打開內門，將物品放入操作室，關閉內門，打開外門，取出物品。再進行室內和過道混合氣微調，使厭氧工作站達到厭氧狀態(tài)。該方法操作繁瑣，每次放樣都要進行幾次抽氣、換氣，從而消耗氣體量很大，操作過程不是直接接觸儀器，而是通過厭氧手套來進行，操作難度大，而且厭氧手套箱價格較昂貴，成本較大，不適宜進行厭氧菌的分離。

自動厭氧手套箱：一旦儀器安裝完畢，只要打開啟動按鈕，操作室的換氣操作可自動進行，只需厭氧指示劑來指示其是否達到厭氧狀態(tài)，操作極其簡單。雖然該方法消耗氣體較多，成本較大。該方法能夠克服厭氧環(huán)境難以形成的問題，操作及其培養(yǎng)都在厭氧手套箱中，能夠直接通過手與儀器接觸進行操作，操作方便，較前面幾種方法更容易培養(yǎng)出嚴格厭氧菌。該方法適用于酒醅、窖泥中厭氧細菌的分離純化。

2 白酒釀造體系厭氧微生物的研究現(xiàn)狀

在白酒釀造中，根據(jù)微生物學研究，分析出酒曲以霉菌、酵母的作用為主[12]，對酒曲中的厭氧微生物尚未見報道。而窖泥以細菌的作用為主，主要為乳桿菌和己酸菌，酒醅中的微生物主要來自酒曲及窖泥，受環(huán)境影響大、菌群復雜。以下主要對在白酒釀造中，窖泥、酒醅中的厭氧微生物做了簡單的概述。

2.1 窖泥厭氧微生物的研究

傳統(tǒng)濃香型大曲酒采用泥窖發(fā)酵，其原因就是窖泥中棲息著大量的微生物，窖泥微生物的種類、數(shù)量、種群間的相互作用以及代謝的多樣性直接影響著白酒的質量[13]。在濃香型白酒窖池微生物類群中，以細菌的作用為主，且大多為厭氧及兼性厭氧菌，其中對白酒香氣形成貢獻最大的是梭狀芽孢桿菌，其主要代謝產(chǎn)物是己酸、丁酸和氫。此外，還有異養(yǎng)菌、多種產(chǎn)甲烷菌、甲烷氧化菌、乳酸菌、各類發(fā)酵菌等，且發(fā)現(xiàn)己酸菌和甲烷菌共生時可促進己酸的生成。由此可見，影響濃香型白酒香氣產(chǎn)生的主要微生物表現(xiàn)為厭氧菌和兼性厭氧菌[14]。

易彬等[15]通過對不同窖齡窖泥微生態(tài)變化研究表明：窖壁泥的好氧細菌數(shù)量和窖底泥的好氧芽孢細菌數(shù)量均隨著窖齡的增加呈逐漸降低趨勢，而窖壁泥的好氧芽孢細菌數(shù)量和窖底泥的好氧細菌數(shù)量均隨著窖齡的增加呈先降后升的趨勢；窖底泥的厭氧細菌和厭氧芽孢細菌以及窖壁泥的厭氧芽孢細菌數(shù)量隨著窖齡的增加呈逐漸增加的趨勢，不同窖齡的窖壁泥的厭氧細菌數(shù)量沒有明顯差異；不同窖齡的窖泥的好氧細菌、好氧芽孢細菌、厭氧細菌以及厭氧芽孢細菌數(shù)量總趨勢為窖底泥顯著高于窖壁泥；不同窖齡的窖泥中的霉菌和酵母菌數(shù)量均較少。趙輝等[16]從東北地區(qū)某酒廠優(yōu)質窖泥中采用兼性厭氧培養(yǎng)及微量成分分析的方法，分離篩選出3株（C78、a57、A17）高產(chǎn)己酸的兼性厭氧細菌，其產(chǎn)己酸量分別為：213.691 4 mg/100 mL、170.465 mg/100 mL、103.509 7 mg/100 mL。經(jīng)形態(tài)學、生理生化特征和分子生物學鑒定其分別為：巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、梭狀芽孢桿菌（Bacillus fusiformis）及地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。徐占成等[17]從劍南春老窖泥中分離到產(chǎn)己酸的一株菌株，經(jīng)過貝勞格微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為“Clostridium cocleatum”即耳渦形梭菌。耳渦形梭菌是生成己酸的主要菌種之一，該菌種的生理生化特性上與克拉瓦氏菌有明顯的不同，在分類學上也有較遠的距離。并不與甲烷菌互利共生，普遍存在于濃香型窖泥中，耳渦形梭菌是至今行業(yè)內首次確定己酸菌的科學名稱，是我國釀酒行業(yè)的重大發(fā)現(xiàn)。為了認識窖泥厭氧微生物，王贊等[18]從濃香型白酒窖泥中分離篩選出3株厭氧細菌，對其進行菌落形態(tài)觀察、顯微鏡觀察細胞形態(tài)和對其進行生理生化檢測，參照《伯杰細菌鑒定手冊》對3株厭氧菌進行初步鑒定，并確定其分別為：乳桿菌屬（Lactobacillus），束村氏菌屬（Tsukamurella），芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）。

2.2 酒醅厭氧微生物的研究

酒醅是已發(fā)酵完畢等待蒸的物料，其微生物菌系來自于酒曲、窖泥以及現(xiàn)場生產(chǎn)環(huán)境。由于中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒生產(chǎn)的工藝特殊性，以及相關研究技術及手段受生產(chǎn)地域、發(fā)酵周期、產(chǎn)品風格等多方面因素的限制，加之酒醅微生物區(qū)系研究的鑒定工作量相當浩大，對其探討相對較少[19]。酒醅在窖泥微生物的不斷馴化下，也逐漸形成了獨有的厭氧微生物體系，對于酒的風味起著不可替代的作用。

酒醅微生物區(qū)系是白酒釀造體系中微生物多樣性研究的重點，其產(chǎn)生的酶類、脂類、酸類構成了酒體風味物質的前提[20]。學者對瀘州老窖、五糧液等著名濃香型白酒的糟醅微生物進行了比較深入的研究，成功運用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）及指紋圖譜技術監(jiān)測酒糟微生物區(qū)系的分布、消長等動態(tài)變化過程[18]。結果表明，細菌多分布于酒醅上層，酵母菌及厭氧細菌主要分布于酒醅下層，霉菌較少；好氧細菌、兼性厭氧細菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量在發(fā)酵初期增長較快，各類微生物的數(shù)量隨著發(fā)酵的進行均有所減少；在發(fā)酵中期，兼性厭氧細菌、酵母菌先后成為優(yōu)勢菌群；臨近出窖時，酵母菌數(shù)減少，芽孢桿菌數(shù)增加，發(fā)酵后期基本上已不能檢出霉菌[21]。

李光輝等[22]利用貝勞格（BIOLOG）自動微生物鑒定系統(tǒng)對濃香型白酒酒醅微生物群落代謝進行分析。結果表明，入窖發(fā)酵2～4周期間，下層酒醅微生物群落代謝活性呈先降后升的變化趨勢，功能多樣性呈先升后降的變化趨勢，而且酒醅微生物功能多樣性的增加與pH值的顯著降低之間也存在著一定的聯(lián)系。吳衍庸等[23]采用甲烷菌、己酸菌二元發(fā)酵技術培養(yǎng)窖泥時，結果表明兩菌具有互利共生的關系，在培泥反應中，兩株菌的數(shù)量都有所增加。目前，利用己酸菌培窖的微生物技術已經(jīng)在全國范圍內推廣[24]，而瀘州老窖酒曲試驗結果表明，利用窖泥甲烷菌與己酸菌二元發(fā)酵能夠提高酒體中己酸乙酯的含量[25]，若以酒體中己酸乙酯含量180 mg/100 mL計，其優(yōu)質品率可達到總出酒量的80.9%?？梢?，在白酒釀造體系中，厭氧微生物能有效提高白酒質量，提高總出酒量的優(yōu)質率。喬宗偉等[26]為了比較準確地把握濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅微生物區(qū)系的多樣性及消長規(guī)律，以全興酒廠正常生產(chǎn)窖池為試驗窖，采用特制取樣器跟蹤發(fā)酵過程取樣，對窖池酒醅中不同空間位置的微生物區(qū)系進行了動態(tài)分析，初步弄清了濃香型白酒窖池酒醅不同層面、不同區(qū)域微生物數(shù)量的分布及變化趨勢，并通過形態(tài)、生理學特性的分析比較以及16S rDNA、18S rDNA序列分析等，對發(fā)酵過程中主要微生物類群進行了分類鑒定。

侯小歌等[27]以河南宋河白酒發(fā)酵30 d的糟醅為實驗材料，通過富集培養(yǎng)及稀釋涂布法分離厭氧及兼性厭氧菌，以菌落計數(shù)法確定最佳樣品稀釋度和適宜的厭氧菌培養(yǎng)方法，并采用形態(tài)學和生理生化特性進行種屬的初步鑒定。結果表明：厭氧及兼性厭氧菌分離適宜稀釋度為10-3，最佳培養(yǎng)方法為抽真空培養(yǎng)法，共分離到5株己酸菌、6株丁酸菌、2株甲烷菌、6株乳酸菌。丁酸菌、己酸菌和乳酸菌革蘭氏染色均為陽性，甲烷菌為革蘭氏陰性菌。丁酸菌和己酸菌分別歸梭菌屬（Clostridium）和芽孢桿菌屬（Bacillus），甲烷菌為假單胞菌屬（Pseudomonas），乳酸菌為芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）。王莉等[28]通過對醬香型白酒發(fā)酵窖池中不同時間的窖底泥及環(huán)境土樣中的微生物區(qū)系構成進行了測序分析，擴增樣本中細菌16S rDNA的v6區(qū)并采用Illumina高通量測序平臺進行深度測序。結果表明，醬香型白酒廠周邊土壤中的微生物多樣性極其豐富，相比窖底泥中的微生物組成更加復雜。在土壤馴化成窖底泥的過程中，微生物的復雜度逐漸降低，隨著窖底泥的不斷馴化，乳桿菌科（Lactobacillaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）和瘤胃茵科（Ruminococcaceae）等厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢種群。另外，從窖泥底分離純化得到的菌株腸球菌科（Enterococcaceae）也是白酒釀造過程中酒醅中常見的微生物組分[29]，由此可見，在醬香型白酒酒醅發(fā)酵過程中，酒醅與窖底泥中的微生物進行相互滲透和作用。

3 總結與展望

本文對目前主要的厭氧細菌的分離培養(yǎng)方法和在白酒釀造體系中厭氧微生物的研究進行了簡單的概述，對幾種厭氧微生物的培養(yǎng)方法進行比較，結果顯示：自動厭氧手套箱操作簡單，分離效果最佳，更加有利于厭氧菌的分離純化。通過對白酒釀造體系中厭氧微生物的研究，其中主要是厭氧細菌，包括產(chǎn)己酸菌、產(chǎn)甲烷菌，產(chǎn)乳酸菌等菌屬對白酒產(chǎn)香產(chǎn)氣有很大的影響，深入研究其產(chǎn)香產(chǎn)氣的機制是很有必要的，但由于各種環(huán)境的限制，由于厭氧微生物的分離和純種培養(yǎng)的困難，研究厭氧微生物的技術和方法進展又相當緩慢。目前，在白酒釀造過程中，厭氧微生物的研究還處于傳統(tǒng)初級階段，要想深入了解白酒的代謝機理以及厭氧微生物在白酒釀造過程中的作用，還需結合現(xiàn)代高新生物技術[30]。例如利用氣質聯(lián)用法對白酒酒醅中厭氧微生物代謝產(chǎn)物進行分析，測出代謝產(chǎn)物的組分以及各組分的含量，利用高通量分析，可以很好地了解酒醅中厭氧微生物的變化規(guī)律，對功能微生物的篩選與鑒定和改善白酒的風味有很大的意義。

[1]沈怡方.白酒生產(chǎn)技術全書[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2008.

[2]凌代文.厭氧微生物研究的新進展[J].微生物學通報，1995，22（4）：245-252.

[3]沈 萍，陳向東.微生物學[M].北京：高等教育出版社，2006.

[4]許淑珍，胡玉杰，馬紀平.厭氧菌培養(yǎng)箱厭氧條件的質量控制[J].臨床檢驗雜志，1984（3）：23.

[5]布坎南RE，吉本斯NE.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1984.

[6]穆 軍，張肇銘.一種分離純化厭氧細菌的新方法—平皿夾層厭氧法[J].山西大學學報：自然科學版，1998，21（4）：363-367.

[7]李永峰，任南琪，李建政，等.發(fā)酵產(chǎn)氫細菌厭氧分離技術的改良[C].21 世紀太陽能新技術——2003 年中國太陽能學會學術年會論文集，2003.

[8]韓 靜，肖 偉，王 娜，等.高溫產(chǎn)氫菌的一種簡單篩選法[J].中國農(nóng)學通報，2009，25（1）：260-263.

[9]李平蘭，張 萀.利用亨蓋特厭氧滾管技術檢測雙歧桿菌制品中的活菌數(shù)[J].食品科學，1999，20（2）：68-69.

[10]鄧功成，王 彬，蘇小二，等.嚴格厭氧微生物甲烷古菌分離純化實驗的改進[J].科學大眾·科學教育，2014（4）：170-172.

[11]劉聿太.嚴格厭氧技術[J].微生物學通報，1987，6（10）：268-271.

[12]張文學，喬宗偉，向文良，等.中國濃香型白酒窖池微生態(tài)研究進展[J].釀酒，2004，31（2）：31-35.

[13]TAO Y,LI J,RUI J,et al.Prokaryotic communities in pit mud from different-aged cellars used for the production of Chinese strong-flavored liquor[J].Appl Environ Microbiol,2014,80(7):2254-2260.

[14]趙 爽，楊春霞，徐 曼，等.濃香型白酒生產(chǎn)中釀酒微生物研究進展[J].食品與發(fā)酵科技，2012，48（1）：25-29.

[15]易 彬，任道群，唐玉明，等.不同窖齡窖泥微生態(tài)變化研究[J].釀酒科技，2011（6）：32-34.

[16]趙 輝，敞 顏，王 葳，等.濃香型白酒窖泥中高產(chǎn)己酸兼性厭氧細菌的分離鑒定[J].食品科學，2012，33（5）：177-182.

[17]徐占成，王家輝.窖泥己酸菌新菌種——耳渦形梭菌的發(fā)現(xiàn)與其形態(tài)及生理特性研究[J].釀酒，2005，32（5）：1-2.

[18]王 贊，李光輝，羅惠波.濃香型白酒窖泥厭氧細菌的分離鑒定[J].四川理工學院學報，2014，27（1）：16-19.

[19]趙 爽，楊春霞，竇 屾，等.白酒生產(chǎn)中釀酒微生物研究進展[J].中國釀造，2012，31（4）：5-10.

[20]程 偉，吳麗華，徐亞磊，等.濃香型白酒釀造微生物研究進展[J].中國釀造，2014，33（3）：1-4.

[21]呂 輝，張宿義，馮治平，等.濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物消長與香味物質變化研究[J].食品與發(fā)酵科技，2010，46（3）：37-59.

[22]李光輝，程鐵轅，黃治國，等.濃香型白酒酒醅微生物群落代謝分析[J].釀酒科技，2009（3）：29-32.

[23]吳衍庸，盧世晰，劉光燁，等.利用窖泥甲烷菌與己酸菌二元發(fā)酵技術提高廬型曲酒質量的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1990，6（1）：1-5.

[24]吳衍庸.濃香型曲酒微生物技術[M].成都：四川科技出版社，1986.

[25]王端明，關鳳梅，陸奉勇，等.脫水活性窖泥功能菌制品的研究[J].釀酒，2001，28（1）：33-35.

[26]喬宗偉，張文學，張麗鶯，等.濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅的微生物區(qū)系分析[J].釀酒，2005，32（1）：18-21.

[27]侯小歌，王俊英，李學思，等.宋河白酒發(fā)酵糟醅中厭氧及兼性厭氧菌的分離與鑒定[J].周口師范學院學報，2013，30（2）：65-69.

[28]王 莉，王亞玉，王和玉，等.醬香型白酒窖底泥微生物組成分析[J].釀酒科技，2015（1）：12-15.

[29]LI X R,MA E B,YAN L Z,et al.Bacterial and fungal diversity in the traditional Chinese liquor fermentation process[J].Int J Food Microbiol,2011,146(1):31-37.

[30]司 波，徐 瑾，廖永紅.PCR-DGGE 技術概述及其在白酒領域的應用[J].中國釀造，2013，32（6）：16-20.