桑葉多酚的研究進展

張宇思，周 昊，顏新培，王成章

(1.湖南省蠶?？茖W(xué)研究所，湖南 長沙 410127；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091)

桑葉多酚的研究進展

張宇思1,2，周 昊1,2，顏新培1，王成章2,3*

(1.湖南省蠶?？茖W(xué)研究所，湖南 長沙 410127；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091)

桑葉作為一種藥食兩用的資源，在我國栽培歷史悠久，種植面積較廣。植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的重要次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性，近年來越來越受到人們關(guān)注。本文對桑葉多酚的提取純化、含量測定、成分鑒定和生物活性的最新研究進展進行了綜述，并展望了桑葉多酚研究應(yīng)用的前景。

桑葉多酚；提取純化；含量測定；成分鑒定；生物活性

桑葉是?？浦参锷?MorusalbaL.)的干燥葉，為我國重要的中藥材，被《中華人民共和國藥典》所收載，性味甘、苦，寒，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目的功能，主要用于治療風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花等癥狀[1]。現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桑葉中含有生物堿、黃酮類、多糖類和多酚類等活性成分，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗衰老、抗腫瘤和抑菌等藥理作用。

多酚是植物體內(nèi)復(fù)雜的酚類次生代謝產(chǎn)物，具有多元酚結(jié)構(gòu)，主要存在于植物的皮、根、葉、殼及果肉中，具有多種生物活性，對人的營養(yǎng)和健康有著重要的影響，隨著研究的深入，植物多酚在醫(yī)學(xué)、食品、制革工業(yè)、日用化工等方面都表現(xiàn)出了越來越重要的作用[2]。本文對桑葉多酚提取純化、含量測定、成分鑒定和生物活性的最新研究進展進行了綜述，并展望了桑葉多酚研究應(yīng)用的前景，旨在為桑葉的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 桑葉多酚的提取純化

植物多酚提取的傳統(tǒng)方法為浸提法，溶劑一般使用一定濃度的乙醇溶液，浸提法具有操作簡便，適合規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點。丁雙華等[3]利用響應(yīng)面分析法對桑葉多酚的浸提工藝進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，桑葉多酚的最佳提取條件為提取時間2 h，提取溫度60 ℃，料液比1 ∶25，乙醇體積分數(shù)45%，在此條件下桑葉多酚的提取得率為2.44%。超聲波輔助提取法近年來廣泛應(yīng)用于植物多酚的提取，超聲波主要通過空化效應(yīng)擊破植物的細胞膜結(jié)構(gòu)，從而增大了溶劑向細胞內(nèi)部的擴散和有效成分的溶出，具有提取時間短、效率高且對提取物質(zhì)不產(chǎn)生破壞作用的優(yōu)點[4-5]。楊上鶯等[6]利用正交試驗對桑葉多酚的超聲輔助提取工藝進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，桑葉多酚的最佳提取條件為提取時間20 min，提取溫度50℃，料液比1 ∶33，乙醇體積分數(shù)60%，超聲波功率160 W，在此條件下桑葉多酚的提取得率為3.51%。

植物多酚的初步純化通常采用大孔樹脂法，大孔樹脂是一種具有多孔立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與其他吸附劑相比具有成本低、穩(wěn)定性好、容易再生等特點，在天然物質(zhì)分離中被廣泛使用。王藝等[7]采用大孔樹脂混用技術(shù)分離純化桑葉多酚，從8種不同型號的大孔樹脂中優(yōu)選出HPD400和HPD826兩種型號，對這兩種樹脂的混合比例進行考察，利用正交試驗對桑葉多酚的大孔樹脂純化工藝進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳條件為HPD400和HPD826大孔樹脂混合比1 ∶1(v/v)，生藥量與樹脂比為0.8 ∶1(g/mL)，上樣濃度150 mg/mL，上樣流速10 min/mL，60%乙醇洗脫，在此條件下，桑葉多酚轉(zhuǎn)移率為73.6%，質(zhì)量分數(shù)為64.1%。

2 桑葉多酚的含量分析

植物多酚的含量測定方法有多種，如高錳酸鉀法、酒石酸亞鐵比色法、原子吸收法等，這些方法在實際應(yīng)用中存在操作繁瑣、重復(fù)性差等缺點。Folin-ciocalteu比色法在測定多酚化合物時能在很大程度上克服以上缺點，并且已作為測定茶葉中多酚物質(zhì)含量的國際標準[8]。張軍等[9]以沒食子酸為標準品，研究了Folin-ciocalteu比色法測定桑葉中多酚含量的適宜條件，結(jié)果表明，桑葉提取液在Folin-ciocalteu試劑2.0 mL、20% Na2CO3溶液5.0 mL、反應(yīng)溫度30℃、反應(yīng)時間2 h的條件下，測定其760 nm處的吸光值，多酚濃度在10.0～100.0 mg/L范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系；穩(wěn)定性精密度重現(xiàn)性和回收率實驗的相對標準偏差為0.2969%～2.502%。該法是一種簡便快速準確測定桑葉多酚含量的可靠方法。

桑葉多酚的含量測定結(jié)果和桑樹的種植資源、桑葉的采收季節(jié)和生長階段有關(guān)。我國的桑樹種質(zhì)資源十分豐富，包括廣東桑、白桑、魯桑、雞桑、山桑等15個桑種 (其中有5個栽培種，10個野生種) 及其4個變種[10]。沈維治等[11]對包含野生資源和栽培品種的不同桑種質(zhì)資源桑葉多酚含量進行了測定，結(jié)果表明，不同桑種質(zhì)資源間的桑葉多酚含量差異較大，變幅為7.84～17.28 mg/g，野生桑資源的桑葉多酚含量普遍高于栽培品種，其中野生變種垂枝桑的多酚含量最高。此外，桑葉多酚含量會受到季節(jié)性變化的影響，季節(jié)變化會引起溫度、光照等生態(tài)因子的改變，桑葉成熟度和體內(nèi)物質(zhì)積累也受季節(jié)影響。對桑葉多酚的變化規(guī)律研究表明，不同品種桑葉的多酚含量在4～10月的變化趨勢基本相同，在4月份最低，到5月份時達到最大值，5月過后逐漸下降，7～ 8月份開始又緩慢上升直至10月份[12]。張亮亮等[13]發(fā)現(xiàn)，桑葉多酚含量和其葉位有一定的相關(guān)性，葉質(zhì)較嫩的桑葉多酚含量較高，并隨著葉片的成熟程度增加多酚含量呈先降低再上升的趨勢。

3 桑葉多酚的成分鑒定

植物多酚成分復(fù)雜，還存在結(jié)構(gòu)相近的異構(gòu)體，成分鑒定比較困難，國內(nèi)對桑葉多酚類物質(zhì)的定性鑒定多采用高效液相色譜技術(shù)，利用標準品進行比對分析。高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜(HPLC-MS-IT-TOF)聯(lián)用技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項新的天然產(chǎn)物有效成分定性定量分析技術(shù)，可以在缺少對照品的情況下對粗提物中微量成分進行結(jié)構(gòu)分析，具有高效快速，靈敏度高的優(yōu)點。Paola Dugo等[14]本研究利用該方法對桑葉的多酚類化合物進行定性分析，鑒定出了22 種多酚類物質(zhì)，主要為綠原酸及其異構(gòu)體、對羥基肉桂酸、咖啡酸、7-羥基香豆素、蘆丁、槲皮素、異槲皮苷、槲皮素葡萄糖苷及其衍生物、山奈酚葡萄糖苷及其衍生物和異鼠李素葡萄糖苷等。

4 桑葉多酚的生物活性

多酚類化合物具有多種生理活性，其中最重要的是其減少自由基和清除自由基的抗氧化作用。不僅能清除體內(nèi)氧自由基，還能清除酶類所不能清除的羥自由基和脂類有機自由基。醫(yī)學(xué)研究證明，這些自由基在人體內(nèi)含量過多會引起細胞和組織損傷，可直接損傷各種生物大分子和生物膜，導(dǎo)致諸如心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生。桑葉多酚類化合物作為天然的抗氧化劑，使其在食品工業(yè)中得以開發(fā)應(yīng)用具有重要意義。沈維治等[15]測定桑葉提取液中的總多酚含量以及體外總抗氧化能力、清除羥自由基能力和清除氧自由基能力，分析桑葉總多酚含量與體外抗氧化活性的量效關(guān)系，結(jié)果表明，桑葉提取液的抗氧化、清除羥自由基和氧自由基活性與桑葉提取液中的總多酚含量的相關(guān)性都達到極顯著水平，二者之間具有良好的量效關(guān)系，說明桑葉中的總多酚是其抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，桑葉總多酚含量可以作為評價桑葉抗氧化作用的參考標準。

植物多酚對多種細菌、真菌、酵母菌都有明顯的抑制作用, 而且在相應(yīng)的抑制濃度下不影響動植物體細胞的正常生長[16]。沈維治等[17]用不同極性溶劑萃取桑葉粉中的活性物質(zhì)，分別獲得乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物，采用瓊脂打孔擴散法評價桑葉各極性溶劑提取物的抑菌效果，結(jié)果表明，桑葉不同極性溶劑提取物對供試革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯提取物的抑菌活性顯著高于其它溶劑提取物，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為6.3 mg/mL，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌的最低抑菌濃度均為12.5 mg/mL，測定乙酸乙酯提取物中的總多酚質(zhì)量比為11.91 mg/g，顯著高于其它溶劑提取物，說明桑葉不同極性溶劑提取物的抑菌活性與其總多酚的含量成顯著劑量效應(yīng)關(guān)系。

除了抗氧化和抑菌外，近年來研究還發(fā)現(xiàn)桑葉多酚的其他生物活性。鄒宇曉等[18]采用微膠囊技術(shù)制備得到桑葉多酚微膠囊，采用CCl4腹腔注射誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型來研究桑葉多酚微膠囊的護肝作用，結(jié)果表明，桑葉多酚能顯著提高小鼠血清和肝勻漿的超氧化物歧化酶 (SOD) 活力，顯著降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT) 的活力和丙二醛 (MDA) 含量，小鼠肝組織形態(tài)觀察表明，桑葉多酚能降低小鼠的肝損傷程度，效果明顯。上述結(jié)果說明桑葉多酚具有保肝護肝的作用，可以應(yīng)用于具有抗氧化和護肝功能食品的開發(fā)。Cheng-Hsun Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)桑葉多酚提取物可以調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，降低脂肪酸合成酶 (FAS)、乙酰輔酶A羧化酶 (ACC)和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶 (HMGCR)的活性，其機制是通過激活A(yù)MPK的信號通路來減少肝臟

的脂質(zhì)堆積。這提示桑葉多酚可以用于非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 的治療。

5 總結(jié)與展望

桑葉作為一種具有藥食兩用的資源，在我國栽培歷史悠久，種植面積較廣。但是近年來隨著工業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，桑樹種植面積不斷減少，農(nóng)民栽桑養(yǎng)蠶的經(jīng)濟效益逐漸下滑。因此，作為一種極有潛力的天然降血糖、降血脂和抗氧化劑資源，以桑葉為原料探尋新型高附加值的應(yīng)用領(lǐng)域，研制開發(fā)高效低毒價廉的保健食品或藥品，對提升當(dāng)?shù)匦Q桑業(yè)的綜合經(jīng)濟效益和抗風(fēng)險能力，創(chuàng)造蠶桑業(yè)新的經(jīng)濟增長點具有重要意義。

到目前為止，關(guān)于桑葉多酚的研究仍不夠深入和系統(tǒng)，今后的工作還可以圍繞以下幾方面進一步開展：一、桑葉多酚的高效大量制備工藝和穩(wěn)態(tài)化技術(shù)研究；二、桑葉多酚類化合物活性單體的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，建立以活性物質(zhì)為標志成分的鑒偽技術(shù)和全程質(zhì)量控制技術(shù)體系；三、桑葉多酚的藥效作用機理的研究；四、桑葉多酚功能性產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用。可以預(yù)見，作為一種全新綠色安全的生理活性物質(zhì)，桑葉多酚類化合物的研究具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1] 國家藥典委員會. 中國藥典:一部[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 279.

[2] 韓丙軍, 彭黎旭. 植物多酚提取技術(shù)及其開發(fā)應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2005, 11(1): 21-26.

[3] 丁雙華, 葉立斌, 陳衛(wèi), 等. 響應(yīng)面優(yōu)化提取桑葉多酚的研究[J]. 中國食品學(xué)報, 2012, 12(1): 52-58.

[4] Vilkhu K, Mawson R, Simons L, et al. Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry—A review[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2008, 9(2): 161-169.

[5] Wang J, Sun B, Cao Y, et al. Optimisation of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran[J]. Food Chemistry, 2008, 106(2): 804-810.

[6] 楊上鶯, 賈冬英, 遲原龍, 等. 超聲波輔助乙醇提取桑葉多酚的工藝條件優(yōu)化[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2013, 39(6): 1155-1159.

[7] 王藝, 彭國平, 歐陽臻, 等. 大孔樹脂混用技術(shù)分離純化桑葉總酚[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25(1): 22-26.

[8] 譚和平, 鄒燕, 葉善蓉, 等. 茶葉中的多酚類物質(zhì)及其分析方法綜述[J]. 中國測試技術(shù), 2008, 34(4): 4-11.

[9] 張 軍, 李江遐, 陸翠珍, 等. Folin_ciocalteu比色法測桑葉中多酚含量[J]. 激光生物學(xué)報, 2012, 21(2): 131-135.

[10] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所. 中國桑樹品種志[M]. 北京:農(nóng)業(yè)出版社, 1993:5.

[11] 沈維治, 廖森泰, 鄒宇曉, 等. 不同類型桑種質(zhì)資源的桑葉總多酚及單體酚類物質(zhì)含量測定[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2014, 3: 024.

[12] 沈維治, 廖森泰, 鄒宇曉, 等. 桑葉酚類物質(zhì)的變化規(guī)律研究[J]. 中草藥, 2010 (11): 1890-1892.

[13] 張亮亮, 汪詠梅, 徐曼, 等. 不同品種桑葉多酚和黃酮含量變化規(guī)律研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2013, 24(5): 1064-1066.

[14] Dugo P, Donato P, Cacciola F, et al. Characterization of the polyphenolic fraction of Morus alba leaves extracts by HPLC coupled to a hybrid IT‐TOF MS system[J]. Journal of separation science, 2009, 32(21): 3627-3634.

[15] 沈維治, 鄒宇曉, 劉凡, 等. 桑葉總多酚含量與體外抗氧化能力的相關(guān)性研究 [J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2012, 38(6): 1073-1078.

[16] 馮麗, 宋曙輝, 趙霖, 等. 植物多酚種類及其生理功能的研究進展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2007, 19(10): 105-107.

[17] 沈維治, 鄒宇曉, 劉凡, 等. 桑葉不同極性溶劑提取物的總多酚含量與抑菌活性[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2013, 39(1): 135-138.

[18] 鄒宇曉, 廖森泰, 肖更生, 等. 一種桑葉多酚的制備方法及其微膠囊和應(yīng)用: 中國, CN101428069[P]. 2008-12-08.

[19] Wu C H, Chen S C, Ou T T, et al. Mulberry leaf polyphenol extracts reduced hepatic lipid accumulation involving regulation of adenosine monophosphate activated protein kinase and lipogenic enzymes[J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(4): 1620-1632.

Research Progress on Polyphenols from Mulberry Leaves

Zhang Yusi1,2, Zhou Hao2,3, Yan Xinpei1, Wang Chengzhang2,3*

(1.The Sericultural Research Institute of Hunan Province, Changsha 410127, China; 2.Institute of Chemical Industry of Forest Products, CAF; National Engineering Lab. for Biomass Chemical Utilization; Key and Open Lab. of Forest Chemical Engineering, SFA; Key Lab. of Biomass Energy and Material, Nanjing 210042, China; 3．Institute of New Technology of Forestry, CAF, Beijing 100091, China)

Mulberry leaves have long utilizing history and large planting area in China as medicine and food resources. Polyphenols are important secondary metabolites, which widely exist in plants. They have gained widely attention because of their biological activity. The extraction and purification, determination of content, component identification, biological activity of polyphenols from mulberry leaves were summarized in the paper. The research and application on polyphenols from mulberry leaves were forecasted.

Mulberry leaves polyphenols; extraction and purification; determination of content; component identification; biological activity

2015-05-19

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD36B07)。

張宇思(1986—)，男，博士生，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail: nmczhang@126.com

*通訊作者：王成章(1966—)，男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物研究與利用。E-mail: wangczlhs@sina.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.05.010

R284

A

1006-9690(2015)05-0035-03