豬星狀病毒的病原學特征及檢測技術研究進展

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬星狀病毒的病原學特征及檢測技術研究進展

莊金秋，梅建國，姚春陽，王 艷，李 峰

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬星狀病毒（PAstV）是一種嚴重危害哺乳期仔豬的人獸共患病病原，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大的經濟損失。通過對PAstV的病原學特征及檢測技術研究進展作一簡要概述，為科研人員加強對其的深入研究及了解仔豬病毒性腹瀉疫情的整體概況提供參考。

豬星狀病毒；病原學；檢測；研究進展

豬星狀病毒（PAstV）為星狀病毒科成員。星狀病毒（AstV）是一類廣泛存在于人和多種哺乳動物及鳥類的人獸共患病病原，廣泛分布于世界各地。AstV目前已經從人、豬、牛、犬、水貂等31種哺乳類動物和雞、火雞、鴨和鴿子等6種禽類中檢出，而且其宿主范圍仍呈現出不斷擴大的趨勢[1]。PAstV對哺乳期仔豬侵害較大，常引起腹瀉、脫水和嘔吐等臨床癥狀，導致乳豬生長遲緩，嚴重者可引起死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來一定的經濟損失。目前，本病尚無治療藥物和預防疫苗。本文就PAstV的由來和發(fā)現、病毒的分類地位、流行病學及檢測方法等研究現狀作一簡要概述，以期為疾病的有效防控提供參考。

1??病毒的由來和發(fā)現

AstV首次于1975年由Appleton和Higgins[2]用電鏡檢測胃腸炎患兒糞便標本時發(fā)現，由于電鏡下病毒粒子呈星形，因此被Madeley和Cosgrove命名為星狀病毒[3]。PAstV首次由Bridger通過電鏡在3周齡的乳豬腹瀉糞樣中觀察到，隨后日本、南非、捷克、哥倫比亞、匈牙利、加拿大、美國及中國等國家均有從豬腹瀉糞樣中檢測到PAstV的報道。Shimizu等報道PAstV在豬群中普遍存在，而且常同冠狀病毒、嵌杯狀病毒、輪狀病毒及其他腸道病毒混合感染造成豬急性胃腸炎。有學者認為PAstV是引起近年來仔豬病毒性腹瀉疫情的主要病原之一。

2??病毒的分類地位

星狀病毒科分為哺乳動物星狀病毒屬和禽星狀病毒屬。PAstV屬于哺乳動物星狀病毒屬，還包括人星狀病毒、牛星狀病毒、貓星狀病毒和綿羊星狀病毒等，該屬以人星狀病毒作為代表種。禽星狀病毒屬包括鴨星狀病毒，火雞星狀病毒和禽腎炎病毒，以火雞星狀病毒為代表種[4]。

3??病毒的病原學特征

3.1 病毒的形態(tài)及理化特性

PAstV為無囊膜的單股線狀RNA病毒[5]，Shimizu等（1990）觀察到病毒粒子呈球形，直徑約30 nm，有許多粒子呈六角或五角的星樣結構，同時還觀察到一些空殼粒子。PAstV對氯仿和乙醚等有機溶劑、高濃度的鹽、表面活性劑（1%SDS）、胰蛋白酶及兩性離子消毒劑等穩(wěn)定，但不耐受3M尿素的處理（37 ℃，30 min）。病毒對酸（pH3.0）稍微不穩(wěn)定，對熱處理穩(wěn)定，能抵抗50 ℃1 h，60 ℃5 min[6]。

3.2 病毒的基因組結構及功能

PAstV只有一個結構蛋白，即衣殼蛋白。蘭家暖等[7]在國內首次從豬腹瀉糞樣中擴增出PAstV衣殼蛋白ORF2基因。劉歡[8]通過采用PCR及RACE技術，基本實現了分離病毒PAstV-GXl擴增的全基因組序列，所獲得全長為6 342 bp，基因組包含大部分ORFla、完整的0RF2、ORFlb、3'非編碼區(qū)及poly（A）。PAstV目前發(fā)現5個差異顯著的基因型（PAstVl-PAstV5）。不同地區(qū)存在不同的流行毒株，我國的流行毒株為PAstV1型。

3.3 病毒的培養(yǎng)特性

與其他腸道病毒相似，PAstV在體外培養(yǎng)時，需要在培養(yǎng)液中額外添加胰酶。Lee等發(fā)現PAstV在沒有胰酶存在的條件下，即使延長病毒的吸附時間也很難實現在細胞中的感染。劉歡（2014）研究發(fā)現，在添加胰酶時，病毒的感染性通過觀察細胞病變（CPE）就可以發(fā)現明顯高于不添加胰酶的病毒。

4??病毒的致病性

目前PAstV引起腹瀉的機制仍不完全清楚，可能是病毒侵入機體后，破壞小腸黏膜及絨毛上皮細胞，使腸吸收功能受損，分泌增加；也可能是引起小腸上皮細胞屏障通透性增加，最終導致滲透性腹瀉。Bridger報道，用含有PAstV、嵌杯狀病毒、非典型輪狀病毒和腸道病毒的糞便過濾液接種新生仔豬后出現厭食、腹瀉和生長受阻，最后死亡。但這種接種方法不能代表PAstV的致病性。Shimizu等用克隆化的PAstV接種4日齡的仔豬后出現溫和性腹瀉，并且在糞便中能檢測到PAstV。PAstV有感染人類或其他物種的可能性，隱性感染豬可作為PAstV的儲存宿主及持續(xù)傳染源而感染人或其他動物。Jonassen等研究發(fā)現人、貓星狀病毒和PAstV遺傳距離最相近，提示星狀病毒在進化過程中存在種間交叉?zhèn)鞑?，有可能是豬傳給貓或貓再傳給人以及可通過中間宿主進行傳播。Ulloa等發(fā)現，來自住在同一棟房子的人及豬腹瀉樣品中人星狀病毒和PAstV部分基因出現重組，認為星狀病毒可能存在種間交叉?zhèn)鞑ァ?/p>

5 病毒的流行病學特點

PAstV自然感染多發(fā)生于1日齡至8周齡的仔豬?；钾i腹瀉，呈糊狀乃至黃色水瀉。PAstV感染主要發(fā)生于天氣寒冷及氣溫多變的冬春季節(jié)，具有一定的流行性。蘭加暖等通過檢測帶有腹瀉癥狀的豬群糞便，發(fā)現PAstV的流行率為40.3%，豬場陽性率更是高達80%以上。綜合國內外PAstV流行病學調查資料，可知PAstV的流行率在0%～83%之間。

6??病毒檢測技術研究進展

6.1 電鏡檢查

直接電鏡檢查在星狀病毒感染的早期研究中發(fā)揮了重要的作用。Appleton等（1975）首次用電鏡發(fā)現了星狀病毒。將糞便樣本用蒸餾水稀釋成20%懸液，離心后取上清液，用1%磷鎢酸鉀液（pH7.0）染色后，電鏡檢查。如果糞便中有星狀病毒存在，根據其特有的星狀結構、28～30 nm直徑等特征較易檢出。該法價格昂貴，技術條件要求高，不適合大規(guī)模的流行病學調查。

6.2 病毒的分離培養(yǎng)

由于星狀病毒在細胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)比較困難，而且多數星狀病毒在細胞培養(yǎng)物中不產生CPE，給病毒分離工作帶來了難度。Lee等研究發(fā)現在添加胰酶的條件下，人星狀病毒可在人胚胎腎細胞（HEK）、恒河猴腎細胞（LLC-MK2）及原代狒狒腎細胞中增殖。Shimizu等用豬胚腎建立的細胞系首次從患急性胃腸炎的豬中分離到一株能引起CPE的PAstV，該病毒引起的CPE特征表現在能使細胞增大和在胞漿中有細小顆粒出現。Willcocks等采用傳代細胞系人類結腸癌細胞直接從糞便標本中分離星狀病毒并獲得成功，而無需先在HEK細胞中進行傳代。近年來，國內外也有關于利用PK-15細胞系成功分離PAstV的報道。商曉桂[9]通過對上海郊區(qū)某豬場疑似PAstV感染豬的糞樣進行病毒分離和純化，獲得一株能在PK-15細胞上增長繁殖，并使該細胞產生破碎、脫落等CPE的病毒。蘭家暖等[10]用PK-15細胞從PAstV廣西流行株中分離到2株具有CPE和致病性的PAstV。劉歡（2014）首次使用TPCK處理過的胰酶，成功實現了PAstV在PK-15中的穩(wěn)定增殖。對細胞培養(yǎng)物中分離到的病毒，可用電鏡及免疫熒光試驗等方法進行鑒定。

6.3 血清學檢測技術

星狀病毒在培養(yǎng)細胞內的大量增殖，可用于制備不同血清型的單克隆和多克隆抗體，從而促進了星狀病毒免疫學檢測方法（如ELISA、免疫熒光等）的發(fā)展。ELISA的優(yōu)點是抗原抗體均可檢測，便利、快速、特異性強，并可用于分型研究，缺點是敏感性略低于電鏡，且無法分辨是野毒感染還是疫苗免疫結果。免疫熒光試驗主要用于對細胞培養(yǎng)物或組織切片中星狀病毒的檢測，還可檢測病毒在細胞中的增殖特性和規(guī)律，但被檢病料來源有一定的局限性，用于死亡動物的檢測。目前國內外尚沒有商品化的PAstV血清學檢測試劑盒。

6.4 分子生物學檢測技術

RT-PCR在檢測星狀病毒方面，比ELISA具有更高的靈敏性及特異性，已成為臨床上檢測星狀病毒最主要的手段。商曉桂應用PK15細胞從上海某疑似PAstV感染豬場分離到的PAstV，經RT-PCR檢測到PAstV目的條帶，表明該豬場患病豬為星狀病毒感染。蘭家暖等采用套式RT-PCR技術，對2008—2010年從廣西7個市縣29個不同規(guī)?；i場采集的315份不同階段豬腹瀉糞樣進行PAstV分子流行病學調查及基因型分析，表明PAstV在廣西地區(qū)豬群中已普遍存在。商曉桂等[11]建立了檢測PAstV的SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，其方法靈敏度可達10個拷貝，是普通RT-PCR的100倍，特異性和重復性較好，可用于PAstV的檢測，這為PAstV感染的調查及診斷提供了重要的技術支持。

7??小結

PAstV在豬群中普遍存在，而且常與其他腸道病毒混合感染導致仔豬腹瀉，每年都會給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經濟損失。隨著分子生物學技術的發(fā)展和對PAstV研究的逐步深入，人們逐步認識到PAstV的感染率和發(fā)病率均高出預期[12]。雖然PAstV致病機制還有待于進一步的體內和體外研究，但星狀病毒的多宿主性、基因差異性及其重組現象和跨種間傳播及適應新宿主的能力，使得星狀病毒成為潛在的新興人畜共患病原并具有重要的公共衛(wèi)生意義。

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2015-05-15）

山東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系生豬產業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）

莊金秋（1978-），女，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細胞培養(yǎng)和動物用病毒疫苗研制。