蜱半胱氨酸蛋白酶分子研究進展

于新茂，周金林

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

蜱半胱氨酸蛋白酶分子研究進展

蜱作為體表吸血節(jié)肢動物，可通過采食宿主血液傳播多種病原體，是一種重要媒介。半胱氨酸蛋白酶是一類分布廣泛具有一定保守性的蛋白酶，在蜱生理學中發(fā)揮重要作用。本文對蜱半胱氨酸蛋白酶的研究進展進行了綜述，重點介紹了組織蛋白酶、天冬酰胺內(nèi)肽酶和半胱天冬氨酸蛋白酶，及參與自噬反應的半胱氨酸蛋白酶的功能及相互作用。

蜱；半胱氨酸蛋白酶；功能；相互作用

于新茂，周金林

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

蜱是一類以吸取宿主血液為生的體表寄生蟲。根據(jù)系統(tǒng)分類學，隸屬于節(jié)肢動物門、蛛形綱、蜱螨目、蜱亞目［1，2］。到目前為止，已經(jīng)有超過850種蜱被鑒定，分為硬蜱和軟蜱兩大類［3］。

蛋白酶廣泛分布于生物界，是生命活動中不可或缺的重要分子，根據(jù)其底物的特異性可大致分為肽鏈內(nèi)切酶、肽端解鏈酶、氨基肽酶和羧肽酶等；根據(jù)蛋白水解機制主要可分為半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶［4］。其中半胱氨酸蛋白酶對于胞內(nèi)及胞外蛋白的降解和加工具有非常重要的作用，涵蓋范圍從病毒、細菌到哺乳動物的各個組織器官［5］，是一類分布廣泛、具有一定保守性的蛋白酶。寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶主要分為兩個大族：CA族（clan CA）［6］與CD族）clan CD）［7］。

C2家族（鈣蛋白酶）是寄生蟲最為重要的半胱氨酸蛋白酶。其他族半胱氨酸蛋白酶主要包括CB族和CC族（病毒蛋白酶）以及CD族（C13家族；豆莢蛋白等）［4］。在寄生生物中發(fā)現(xiàn)有蛋白水解酶的分泌，有關原蟲（利士曼原蟲［8］、阿米巴原蟲［9］、剛果錐蟲［10］等）、蠕蟲（血吸蟲［11］、迭宮絳蟲［12］、肝片吸蟲［13］等）和線蟲（馬來絲蟲［14］、旋毛蟲［15］等）等寄生蟲的相關研究報道，證實了半胱氨酸蛋白酶參與寄生蟲重要生理過程，是其生活史中不可或缺的重要分子。對于體表吸血節(jié)肢動物寄生蟲，半胱氨酸蛋白酶參與發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)等相關的各種生理過程，大部分肽酶屬于半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶超家族。

1 蜱體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶家族

半胱氨酸蛋白酶在蜱的生活史中發(fā)揮至關重要的作用，主要涉及組織蛋白酶、天冬酰胺內(nèi)肽酶、半胱天冬氨酸蛋白酶和自噬蛋白酶等，參與蜱血液消化、天然免疫、胚胎發(fā)育等關鍵性生理活動，對于蜱穩(wěn)態(tài)的維持及生活史的完成必不可少。

1.1 蜱組織蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（tick cathepsin

like cysteine proteases） 組織蛋白（Cathepsin）起源于希臘語“kathepsein”，是一類在弱酸環(huán)境中被激活的蛋白酶家族［16］。通過對人類基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，編碼人半胱氨酸蛋白酶的序列有11個，分別是組織蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、X和W［17］。溶酶體半胱氨酸蛋白酶在溶酶體弱酸性環(huán)境中發(fā)揮作用，是溶酶體酶系統(tǒng)的主要組分之一

［18］。最初人們認為半胱氨酸蛋白酶是一種細胞內(nèi)降解酶，在核內(nèi)體或溶酶體酸性環(huán)境下水解胞內(nèi)和胞外蛋白［19，20］。隨著研究的拓展，人們發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶分布廣泛，參與抗原呈遞等眾多復雜的生理過程，而且具有相當?shù)谋Ｊ匦?，在不同物種里均有報道［21-29］。蜱體內(nèi)主要的組織蛋白酶包括組織蛋白酶B、C、L、H、V、S等，分布于唾液腺、腸道、卵巢、脂肪體等主要組織器官中，參與蜱的各項生理活動。近十幾年來，參與血液消化的半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶，在若干種蜱中已經(jīng)完成基因克隆及蛋白純化和酶活測定。2000年從微小牛蜱（B. microplus）中鑒定分離獲得cathepsin L（BmCL1）

［30］。隨后熒光定量和Western blot技術的應用，證實了這些酶單一的只在蜱吸血階段的中腸表達。BmCL1在微小牛蜱中以42 kDa的前體蛋白和23 kDa的成熟態(tài)存在。免疫電鏡技術表明其定位于腸上皮細胞的分泌空泡中［31］。在長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）上分離鑒定出40 kDa和48 kDa大小的腸半胱氨酸肽酶（predominant gut cysteine peptidases）［32］，通過熒光定量方法從其腸道cDNA中也鑒定出2條mRNA序列，編碼cathepsin L同源蛋白［33］。近年來，一種長角血蜱腸相關cathepsin L（gut-associated H. longicornis cathepsin L，HlCPL-A）通過大腸桿菌表達系成功表達純化，并進行了相關功能性的研究，顯示其在長角血蜱吸血過程中上調(diào)表達明顯，最適酶活pH為3.6，既是酶原又充當成熟體［34］。另外，還有一種分離自長角血蜱的cathepsin B，被稱為“l(fā)ongipain”，對于巴貝斯蟲（Babesia spp）的傳播發(fā)揮至關重要的作用［36］。研究表明longipain單一的在蜱腸組織表達并且于吸血時上調(diào)明顯，通過免疫印記技術發(fā)現(xiàn)特異性抗體可識別39 kDa大小的成熟肽酶。longipain似乎在溶酶體空泡和腸細胞表面表達，形成一個“閉合回路”，這對于典型的cathepsin B發(fā)揮其外肽酶活性是必須的。畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系獲得的重組蛋白表現(xiàn)出不同于以往的特殊最適pH值。通過RNA干擾技術敲除longipain證明了其在血液消化和巴貝斯蟲傳播方面的作用［35］。

1.2 蜱天冬酰胺內(nèi)肽酶（t i c k a s p a r a g i n y l endopeptidases） 在半飽血篦子硬蜱（Ixodes ricinus）腸cDNA文庫中克隆的CD家族成員天冬氨酰肽鏈內(nèi)肽酶/豆莢蛋白（asparaginyl endopeptidase/ legumain ，IrAE）是首個在節(jié)肢動物中被報道的此類蛋白成員［36］。半定量RT-PCR分析顯示IrAE只在吸血的中腸有特異性mRNA轉(zhuǎn)錄。免疫電子顯微技術證明IrAE在腸細胞表面表達。畢赤酵母（P. pastoris）獲得的重組IrAE更像是曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）SmAE 的同系物，具有自我催化及加工血吸蟲cathepsin B，使其成為成熟體的能力。天冬氨酰內(nèi)切酶對P1位置的天冬酰胺具有高度特異性，重組酶和天然酶在一定pH范圍內(nèi)（大于pH6時失活）具有良好活性［36］。有關IrAE和SmAE 抑制劑的報道指出，經(jīng)篩選出的一些新抑制劑（the azapeptide michael acceptors and epoxides）對于吸蟲和蜱體內(nèi)酶具有相似的作用，暗示了這些酶對于不同物種，可能具有相似的底物及酶活［37，38］。在長角血蜱（H. longicornis）中也有報道2種天冬氨酰內(nèi)肽酶HlLgm1［39］和HlLgm2［40］，研究表明它們定位于蜱的腸道，可能與吸血相關［41］。重組HlLgm1和HlLgm2顯示出一些與眾不同的生化特性，例如其最適pH為8.0［42］。RNA干擾技術敲除HlLgm1和 HlLgm2后，發(fā)現(xiàn)蜱飽血重量下降明顯且卵的孵化率受到嚴重影響［42］。Alim等［42］的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RNA干擾后，蜱中腸細胞發(fā)育受影響且中腸組織出現(xiàn)不同程度的損傷，揭示了HlLgm1 和HlLgm2在增殖分化和形態(tài)學上發(fā)揮重要作用。

1.3 半胱天冬氨酸蛋白酶（caspases） 半胱天冬氨酸蛋白酶家族（the caspase family of cysteine proteases）是半胱氨酸蛋白酶的一類，根據(jù)其功能主要分為兩大組：一類與細胞凋亡相關，一類與天然免疫信號通路相關。近期的研究表明在人炎癥小體復合物（inflammasome complexes）中鑒定出的“細胞凋亡”半胱天冬氨酸蛋白酶，也有誘導細胞死亡的能力，說明早期對其分類可能過于簡單［44］。半胱天冬氨酸蛋白酶是協(xié)調(diào)和整合統(tǒng)籌信號通路中心，不僅引起細胞凋亡和炎癥反應，也誘導其他形式的細胞死亡，例如炎性壞死（pyroptosis）和程序性死亡（necroptosis）［43］。由于在節(jié)肢動物中研究資料的匱乏，對caspases結構組成及功能尚不明確。目前，在果蠅（Drosophila）體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)7種半胱天冬氨酸蛋白酶，可誘導細胞凋亡［44，45］。Miho等［46］在長角血蜱腸cDNA文庫中克隆獲得兩種半胱天冬氨酸蛋白酶基因，命名為H.longicornis caspase-2（Hlcaspase-2）和H.longicornis caspase-8（Hlcaspase-2），分別編碼340和306個氨基酸，熒光定量分析在長角血蜱的中腸和唾液腺中均有表達，這也是蜱中首次報道的與凋亡相關的半胱天冬氨酸蛋白酶。

1.4 自噬相關蛋白酶（autophagy-related proteases）細胞自噬是一種最基本的維持穩(wěn)態(tài)機制，細胞通過這一功能自體溶解蛋白、脂類和需要去除或替換的細胞器。在細胞損傷或受損細胞器組分沉積的情況下，細胞及其內(nèi)容物就可能誘發(fā)自噬途徑，通過溶酶體進行降解消化［47］。這樣一種機制從長期來看可以防止組織損傷，及時清除受損組織，避免疾病的發(fā)生；同時也是在特殊情況下，保持穩(wěn)態(tài)的一種應急性需要［48］。溶酶體通過自噬作用降解細胞內(nèi)大分子物質(zhì)的過程，需要一些系列酶的參與，涉及的酶種類繁多，這些酶水解多肽支鏈，在自噬的初期形成和延伸階段發(fā)揮重要作用，尤其是半胱氨酸蛋白酶。同時，一些蛋白酶在特殊情況下也對自噬有抑制作用［49］。

Kawano等［50］在長角血蜱中克隆獲得ATG6的同源物，命名為HlATG6，并對其特性進行了初步鑒定，研究發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄水平在卵和未吸血幼蜱階段轉(zhuǎn)錄水平較高。目前在長角血蜱中共發(fā)現(xiàn)5種自噬蛋白酶基因，分別為ATG3、ATG4、ATG6、ATG8和ATG12，主要在卵的發(fā)育階段具有較高的轉(zhuǎn)錄水平［51］。

2 半胱氨酸蛋白酶的功能

2.1 半胱氨酸蛋白酶參與蜱血液消化機制 根據(jù)大量有關蜱腸天冬氨酸［52，53］和亮氨酸氨基肽酶［54］的相關報道，證實宿主血液在蜱腸細胞內(nèi)消化過程是一個復雜的加工流程，而非依靠單一的“血紅蛋白酶”，而且與血吸蟲［55，56］和其他寄生蟲［57］類似，這一消化加工過程依賴腸相關半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶的網(wǎng)絡互作。整個消化作用網(wǎng)絡包括了幾種主要的半胱氨酸內(nèi)肽酶（木瓜蛋白酶家族，clan CA）cathepsin B、C和L，天冬氨酰內(nèi)肽酶（clan CD）和天冬氨酸內(nèi)肽酶cathepsin D（clan AA）［58］。Anderson等［60］通過對蜱腸第一表達序列標簽（the first tick gut expressed sequence tag ，EST）的分析，佐證了消化性半胱氨酸和天冬氨酸多酶復合體的存在。通過對雌性變異革蜱（Dermacentor variabilis）不同吸血階段中腸cDNA文庫的1679個ESTs進行分析，發(fā)現(xiàn)14個不同的半胱氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)錄本，總共24個半胱氨酸蛋白酶ESTs中，19個來自吸血6天的雌蜱，只有5個來自吸血2天的文庫，進一步證明了硬蜱吸血過程中半胱氨酸蛋白酶的誘導產(chǎn)生比較晚。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示這些片段序列主要分為三個半胱氨酸蛋白酶組：類豆莢蛋白（legumain-like）、類組織蛋白酶B（cathepsin B-like）和類組織蛋白酶L（cathepsin L-like）［59］。

2.2 半胱氨酸蛋白酶家族影響蜱胚胎發(fā)育 半胱氨酸蛋白酶對于蜱胚胎發(fā)育具有重要作用，尤其是卵黃蛋白的消化。在蜱胚胎發(fā)育階段，主要依靠卵黃素提供營養(yǎng)，其消化吸收受周圍酸性環(huán)境限制。在這一過程中，有少量文獻報道指出需要特定的酶參與，尤其是天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶（cathepsin L-like）［5］。在毛白鈍緣蜱（O. moubata）中，通過電泳凝膠發(fā)現(xiàn)了大小為37 kDa和39 kDa的蛋白酶條帶，他們在pH3～pH4范圍內(nèi)具有最大活性，在中性pH環(huán)境下可結合卵黃蛋白［60］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)這種酶以酶原的形式儲存，低pH環(huán)境可將其激活［61］。關于胚胎發(fā)育特異性酶的研究尚處于探索階段，基于cDNA或蛋白質(zhì)譜以及相關酶活問題亟待解決。

2.3 半胱天冬氨酸蛋白酶（caspases）參與免疫反應 作為半胱氨酸蛋白酶的一種，半胱天冬氨酸蛋白酶主要對天冬氨酸殘基有特異嗜性，可裂解P1位置含有天冬氨酸的四連肽底物。所有的人半胱天冬氨酸蛋白酶最初生成形式都是無活性的前體態(tài)（procaspases），激活態(tài)均以專性二聚體形式發(fā)揮作用，從前體到成熟體的轉(zhuǎn)變需要補充信號參與，便于前體修飾和酶激活途徑的啟動［43］。半胱天冬氨酸蛋白酶原包含N末端結構域和C末端蛋白酶結構域，C末端蛋白酶結構域具有一大一小兩個含催化半胱氨酸殘基的亞基［63］。啟始半胱天冬氨酸蛋白酶具有較長原結構域（prodomains），這一原結構域主要由CARDs（caspase-associated recruitment domains，CARD）和DEDs（death effector domains，DEDs）兩種蛋白互作結構域組成。這兩種結構域?qū)τ诎腚滋於彼岬鞍酌赶喈敱Ｊ?，caspases-1、caspases-2、caspases-4、caspases-5、caspases-9、caspases-11、caspases-12具有CARDs，而DEDs存在于caspase-8和caspases-10中。嚙齒類動物在進化過程中丟失了caspase-10，因此對于小鼠，caspase-8是唯一外源死亡通路途徑的啟始半胱天冬氨酸蛋白酶［63］。這些蛋白互作結構域有利于啟始半胱天冬氨酸蛋白酶的富集，形成復合活化絡合物（multiprotein activation complexes），例如凋亡復合體（apoptosome）、死亡誘導信號復合體（deathinduced signalling complex， DISC）、炎癥小體（inflammasomes）。這些多蛋白復合體促進了啟始半胱天冬氨酸蛋白酶的二聚作用（dimerisation），通過誘導鄰近機制（induced proximity mechanism）被激活［62，64］。相比之下，效應半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase-3、caspase-6、caspase-7）具有極小的原結構域，最初以同型二聚體無活性狀態(tài)存在，隨后經(jīng)裂解加工后以類似級聯(lián)效應方式（cascade-like manner）被特異性啟始或上游半胱天冬氨酸蛋白酶激活。效應半胱天冬氨酸蛋白酶的激活，可引起超過600種細胞內(nèi)底物的裂解，其中一些參與細胞凋亡程序，但其具體裂解位點序列尚需實驗驗證［65］。

2.4 半胱氨酸蛋白酶參與自噬反應 通常情況下，自噬過程中會形成一種“自噬空泡”，承載受損組織細胞或細胞器等，隨后空泡與溶酶體膜接觸，將內(nèi)容物傳遞給溶酶體進行降解或回收［66］。有研究表明自噬參與胞內(nèi)抗原識別機制，一旦出現(xiàn)問題，將引起感染的易感性增加［67］。此外，自噬作用在先天免疫和獲得性免疫中也發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)自噬過程可以調(diào)節(jié)炎癥復合體和細胞特異性模式識別受體途徑［68-70］，有助于凋亡成分的清除，甚至可以誘導細胞凋亡［71，72］。

蛋白酶參與了自噬的多個不同的步驟。在自噬的初始階段，自噬空泡的形成需要ATG8和共軛磷脂酰乙醇胺的參與［73］。在酵母細胞中，隨著翻譯的進行，ATG8被ATG4（半胱氨酸蛋白酶家族）裂解除去C末端的一小段。隨后ATG8G116參與由ATG7和ATG3催化的類泛素化共軛反應（ubiquitinlike conjugation reaction），這一過程是自噬小體形成的必要環(huán)節(jié)［73］。在哺乳動物細胞中類似，ATG4參與3種ATG8同系物C末端的加工過程，包括GABARAP、LC3和GATE-16。這一過程對于自噬作用途徑至關重要［74，75］。因此半胱氨酸蛋白酶對于ATG8的加工是不可或缺的，也是自噬作用前期階段的必要元素。

3 結語

蛋白酶是生物體正常繁衍代謝不可或缺的重要分子，成員組成復雜，作用范圍廣泛。半胱氨酸蛋白酶家族只是其眾多家族成員之一，雖然在不同的物種發(fā)揮不同的重要作用，但遺傳進化上具有一定的保守性。關于蜱半胱氨酸蛋白酶的研究局限于血液消化過程，對于天然免疫，細胞凋亡和自噬相關等方面所知甚少。但由于半胱氨酸蛋白酶結構和功能的相似性，有關人和小鼠等高等動物的研究為蜱提供了一定的借鑒和參考。鑒于半胱氨酸蛋白酶參與眾多重要的生理生化過程，研究其結構與功能，甚至蛋白酶之間相互作用網(wǎng)絡對于蜱天然免疫和自噬等生理機制的探究及蜱蟲的防控具有十分重要的意義。

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RESEARCH PROGRESS ON CYSTEINE PROTEASES OF TICKS

YU Xin-mao， ZHOU Jin-lin
（Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241，China）

As the blood sucking arthropods， ticks transmit many kinds of pathogens through blood feeding and have been regarded as one of most important vectors. Cysteine proteases are involved in essential roles in ticks. The cysteine proteases in ticks are presented in this article with focus on the functions of cathepsin-like cysteine proteases， asparaginyl endopeptidases and caspases as well as autophagy（autophagy-related proteases） in order to better understand tick prevention and control.

Tick； cysteine proteases； functions； interaction

S852.746

A

1674-6422（2015）05-0079-08

2015-06-18

中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目

于新茂，男，博士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

周金林，E-mail：jinlinzhou@shvri.ac.cn