孢子絲菌病及影響申克孢子絲菌毒力因素的研究進(jìn)展

孢子絲菌病及影響申克孢子絲菌毒力因素的研究進(jìn)展

畢云斐齊琳李福秋王舒

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科,吉林長(zhǎng)春130041)

關(guān)鍵詞〔〕孢子絲菌??；申克孢子絲菌；毒力；黑素

中圖分類號(hào)〔〕R756〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：畢云斐(1989-)，女，碩士，主要從事皮膚病與性病學(xué)研究。

孢子絲菌病是一種由雙相病原真菌申克孢子絲菌感染引起的亞急性或慢性深部真菌病。其不同臨床表現(xiàn)取決于申克孢子絲菌菌株的不同毒力因素以及宿主的不同免疫狀態(tài)。黑色素在真菌致病過程中起著重要的作用，研究黑色素與真菌致病毒力之間的關(guān)系，是研究真菌發(fā)病機(jī)制和真菌耐藥性等的重要工具。

1孢子絲菌病

孢子絲菌病廣泛分布于世界各地，尤其是熱帶及亞熱帶地區(qū)，為全球播散性人、畜共患疾病，人群普遍易感，一般呈散發(fā)趨勢(shì)，但也曾有大規(guī)模暴發(fā)的報(bào)道〔1〕。其病原體主要通過破損的皮膚黏膜進(jìn)入，引起皮膚黏膜、皮下組織及局部淋巴組織的化膿破潰及皮下結(jié)節(jié)；吸入分生孢子可導(dǎo)致肺部感染；偶可經(jīng)血行播散至骨骼、眼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)臟引起多系統(tǒng)損害，但較少見，偶見于酗酒、人免疫缺陷病毒(HIV)感染等免疫低下患者〔2〕。

孢子絲菌是一種自然界普遍存在的腐生菌，在土壤、木材、植物、海洋生物、昆蟲等均可分離出〔3〕。其為雙相型真菌，在25℃~27℃表現(xiàn)為菌絲相，而在35℃~37℃宿主中表現(xiàn)為酵母相。不同臨床型別的申克孢子絲菌分離株生長(zhǎng)溫度略有不同，臨床表現(xiàn)為皮膚固定型的菌株在35℃生長(zhǎng)良好，但在37℃生長(zhǎng)則受抑制，而臨床表現(xiàn)為淋巴管型和播散型的分離株在37℃可生長(zhǎng)良好〔4〕。同時(shí)，根據(jù)致病菌株間的表型及基因型存在差別，以及相同臨床表現(xiàn)的患者對(duì)相同治療方法的反應(yīng)不同，在不同菌種之間對(duì)抗真菌藥物的敏感性存在較大差異，推測(cè)申克孢子絲菌可能是一種同型種復(fù)合體，已有研究者將孢子絲菌進(jìn)一步分為申克孢子絲菌、球形孢子絲菌、巴西孢子絲菌、墨西哥孢子絲菌、白孢子絲菌及申克孢子絲菌盧艾里變種6個(gè)種或變種〔5〕，其中，申克孢子絲菌和球孢子絲菌在世界范圍廣泛分布〔6〕。目前研究認(rèn)為在我國病原菌主要由申克孢子絲菌和球孢子絲菌構(gòu)成，Marimon〔7~9〕等均認(rèn)為我國菌種分布可能以球形孢子絲菌為主。同時(shí)不同菌種之間的致病力以及對(duì)抗真菌藥物的敏感性等也存在差異〔10〕。

臨床上將本病分為皮膚型和皮膚外型。其中皮膚型孢子絲菌病又分為固定型、淋巴管型和播散型；而皮膚外孢子絲菌病又稱內(nèi)臟型或系統(tǒng)性孢子絲菌病，多累及糖尿病、酗酒、應(yīng)用免疫抑制劑、HIV感染等免疫力低下者，多由血行播散引起，可侵犯骨骼、眼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心、肝、脾、胰、腎、睪丸及甲狀腺等器官，吸入孢子可發(fā)生肺孢子絲菌病。

孢子絲菌病的傳統(tǒng)檢查方法主要為真菌培養(yǎng)和組織病理學(xué)檢查，近年來分子生物學(xué)領(lǐng)域的檢查手段，包括免疫熒光抗體檢查、孢子絲菌素皮膚試驗(yàn)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、特異性探針雜交、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析等，在孢子絲菌病的診斷中發(fā)揮越來越重要的作用〔11〕。病理檢查早期損害一般較輕微，表現(xiàn)中性粒細(xì)胞、組織細(xì)胞、漿細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等形成的非特異性炎癥浸潤(rùn)，主要表現(xiàn)為真皮非特異性炎性肉芽腫。典型的特征性改變?yōu)椤叭齾^(qū)結(jié)構(gòu)”的形成，中央：為由中性粒細(xì)胞構(gòu)成、偶有少數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞的化膿區(qū)；外繞：以由組織細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞構(gòu)成、偶有多核巨細(xì)胞的結(jié)核樣區(qū)；最外：由淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞構(gòu)成的梅毒樣區(qū)。過碘酸雪夫(PAS)染色較易發(fā)現(xiàn)以酵母型存在的病原菌、星狀體、雪茄樣小體，偶見菌絲。實(shí)驗(yàn)室檢查病灶組織液、膿液或壞死組織涂片，革蘭染色或PAS染色，高倍鏡下可見G+或PAS陽性的卵圓形或梭形小體；真菌培養(yǎng)可見初為乳白色酵母樣菌落，以后成為咖啡色絲狀菌落。

孢子絲菌病的治療主要是口服藥物治療，包括飽和碘化鉀溶液(SSKI)、伊曲康唑(ITR)、特比萘芬(TBF)、氟康唑(FLU)、兩性霉素B(AmB)等，SSKI曾為治療皮膚型孢子絲菌病的首選藥物。目前孢子絲菌病治療指南〔12〕推薦ITR為治療皮膚型孢子絲菌病及骨關(guān)節(jié)病型的首選藥物，當(dāng)患者因禁忌證、藥物相互作用、副作用等而不能應(yīng)用ITR治療時(shí)，可選擇TBF進(jìn)行治療，當(dāng)固定型及淋巴管型孢子絲菌病患者不能耐受ITR及TBF時(shí)，可用FLU治療，而對(duì)于播散型孢子絲菌病、肺孢子絲菌病、腦膜孢子絲菌病指南推薦首選AmB治療。溫?zé)嶂委煂?duì)于局部固定型效果較好，可與口服藥物治療聯(lián)合應(yīng)用，也可用于合并妊娠、活動(dòng)性肺結(jié)核、碘過敏等的患者〔13〕。手術(shù)治療一般用于纖維包裹明顯的皮膚固定型及肺孢子絲菌病的慢性空洞型纖維結(jié)節(jié)，但均需配合以藥物治療。近年來，研究發(fā)現(xiàn)孢子絲菌黑色素在其致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用〔14〕，隨著病原真菌對(duì)抗真菌藥物耐藥現(xiàn)象的增多，未來研發(fā)抑制其黑色素生物合成的新型抗真菌藥物可能成為研究的新靶點(diǎn)。

2影響孢子絲菌毒力的因素

研究認(rèn)為，孢子絲菌病的不同臨床表現(xiàn)形式主要取決于宿主的免疫狀態(tài)以及孢子絲菌的毒力因素〔15〕。目前關(guān)于影響申克孢子絲菌毒力的熱點(diǎn)因素的研究包括如下方面。

2.1黑色素黑色素是一類廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中的深褐色至黑色的復(fù)合物，是一種帶負(fù)電荷的疏水性多聚芳香族化合物。黑色素已在真菌致病力研究中占有越來越重要的位置〔16〕。真菌黑色素兩種最重要的合成途徑分別是1，8-二羥基萘(DHN)途徑和二羥苯基丙氨酸(DOPA)途徑，不同種真菌合成黑色素的途徑不同〔17〕，DHN-黑色素主要見于子囊菌真菌，DOPA-黑色素則常見于新生隱球菌、組織胞漿菌等〔17〕。Romero-Martinez等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)申克孢子絲菌黑色素可通過DHN途徑合成，但最新研究〔18〕表明申克孢子絲菌黑色素合成過程也可以利用酚類化合物，提示其黑色素合成途徑或許也包括DOPA途徑。黑色素可以保護(hù)真菌細(xì)胞，具有抗氧化，抗惡劣環(huán)境如紫外線和極端溫度，清除自由基，抗離子輻射，增強(qiáng)真菌細(xì)胞表面的黏附性，抗宿主細(xì)胞吞噬作用，降低抗真菌藥的抗真菌作用。Morris-Jones等〔19〕提示黑色素保護(hù)申克孢子絲菌免受某些氧化抗菌化合物和巨噬細(xì)胞的攻擊。目前關(guān)于真菌黑色素與致病力關(guān)系的研究認(rèn)為，黑色素并不是真菌生長(zhǎng)所必需，但卻是某些致病真菌的重要致病因子〔20〕。

2.2黏附力因素黏附是致病菌在宿主中傳播的先決條件，一些病原真菌，如白色念珠菌、煙曲霉等與宿主組織黏附性已被廣泛研究。

在申克孢子絲菌的粘附性實(shí)驗(yàn)中，Lima等〔21〕通過ELISA法證明其分生孢子與酵母細(xì)胞可在體外與宿主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)如Ⅱ型膠原蛋白、纖維蛋白原以及層粘連蛋白等結(jié)合,推測(cè)這可能與孢子絲菌在宿主內(nèi)的播散有關(guān)。但分生孢子與酵母細(xì)胞對(duì)ECM的黏附力略有不同，其中分生孢子對(duì)纖維蛋白原或凝血酶敏感素?zé)o顯著黏附，但酵母細(xì)胞顯示對(duì)纖維蛋白原黏附。其中纖維結(jié)合蛋白是一種大(420kDa)的二聚體糖蛋白，是一種多功能的ECM蛋白，在細(xì)胞黏附和播散中起核心作用〔22〕。Iima等〔23〕通過間接免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)證明申克孢子絲菌酵母細(xì)胞和分生孢子都具有與層粘連蛋白和纖維結(jié)合素黏附的能力，且酵母細(xì)胞具有較分生孢子的黏附能力更為顯著,對(duì)纖維結(jié)合素和層粘連蛋白的結(jié)合也具有劑量依賴性和特異性。此外，對(duì)孢子絲菌細(xì)胞壁糖成分的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞壁組成成分的不同被認(rèn)為與申克孢子絲菌的致病力相關(guān)〔24〕，同時(shí)細(xì)胞壁肽聚糖也參與了黏附過程〔25,26〕，如Ruiz-Baca等〔25〕從申克孢子絲菌酵母細(xì)胞細(xì)胞壁分離出一種70 kDa的糖蛋白被認(rèn)為參與黏附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過程。

此外，申克孢子絲菌酵母細(xì)胞可與宿主內(nèi)皮細(xì)胞黏附，Sandoval-Bernal等〔26〕通過生物素標(biāo)記配體分析，發(fā)現(xiàn)其酵母細(xì)胞細(xì)胞壁蛋白電泳分析中的5種蛋白在與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過程中密切相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁表面甘露糖也參與了與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過程。

3病原真菌黑色素

雖然黑色素不是真菌的生長(zhǎng)所必需，但在真菌侵襲宿主和抵御外界惡劣環(huán)境方面起重要作用〔27〕，某些植物真菌的黑色素可以增加其對(duì)宿主的侵襲能力，如瓜類炭疽病菌、稻瘟病病菌的黑色素能沉積在附著細(xì)胞壁內(nèi)層，防止形成膨脹壓的溶質(zhì)外滲，產(chǎn)生較大的機(jī)械壓力，有利于真菌侵入宿主〔28〕。病原真菌黑色素與真菌毒力的研究。更多集中于黑色素在環(huán)境及感染過程中保護(hù)菌體存活及免受各種因素破壞的機(jī)制，如抗氧化、抗輻射、耐受抗真菌藥物及抗宿主防御機(jī)制等〔29〕。

3.1黑色素理化性質(zhì)及分類黑色素廣泛分布于自然界，根據(jù)其顏色、化學(xué)組成和形成途徑的不同而分為真黑色素、棕黑色素、異黑色素。根據(jù)合成途徑不同，將黑色素分為DHN-黑色素和DOPA-黑色素兩種。但是不論黑色素的來源和組成結(jié)構(gòu)有何不同，所有黑色素的理化性質(zhì)都相同，(1)溶解性：天然黑色素不溶于酸性溶液與常見有機(jī)溶劑(如乙醇、氯仿、苯、丙酮、乙醚等)，微溶于水，但可溶于堿性溶液。(2)光吸收性：黑色素對(duì)紫外線和可見光具有廣闊的吸收帶(150~800 nm)，且在紫外波長(zhǎng)下吸收值最大，且能吸收一些低能量的輻射。(3)氧化還原性：黑色素含有多種功能團(tuán)，能產(chǎn)生半醌自由基，既可作為電子供體也可作為電子受體〔30〕，其本身具有獨(dú)特的自由基特性，同時(shí)可作為自由基消除劑，具有很強(qiáng)的氧化還原的能力。(4)金屬親和性：研究發(fā)現(xiàn)，黑色素存在對(duì)苯二酚和苯醌兩種基團(tuán)，這兩種基團(tuán)在其螯合金屬離子的過程中起主要作用，同時(shí)由于一些金屬離子可介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，間接起到抗氧化作用。

3.2致病真菌黑色素的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，很多真菌的黑色素都分布在菌體的最外層，Gómez等〔31〕從巴西副球孢子菌以及Morris-Jones等〔19〕從培養(yǎng)的申克孢子絲菌獲得分生孢子及酵母細(xì)胞，用蛋白水解酶、變性劑、熱鹽酸處理后，得到與原始孢子及酵母細(xì)胞形狀大小相似的黑色顆粒層，掃描電鏡等證實(shí)該顆粒層是黑色素。故認(rèn)為黑色素是在菌體與周圍不利的環(huán)境間形成的一道屏障，使得菌體能夠抵抗周圍環(huán)境的理化因素，防御紫外線破壞以及抗宿主細(xì)胞吞噬等，同時(shí)黑色素上述理化性質(zhì)決定其具有強(qiáng)大的生物功能。黑色素分布的位置及其特有的理化性質(zhì)使病原菌在環(huán)境中更易存活，在感染中保護(hù)菌體免受各種環(huán)境因素的破壞。侯幼紅等〔32〕總結(jié)致病真菌黑色素的作用機(jī)制有抗電離輻射、抗極端pH和溫度的環(huán)境、增強(qiáng)真菌細(xì)胞表面的黏附性、抵抗宿主細(xì)胞吞噬作用、抗氧化還原、降低抗真菌藥物的抗真菌作用等方面。黑色素對(duì)真菌往往提供一種保護(hù)機(jī)制，使其免受惡劣環(huán)境的損傷。黑色素的金屬親和性使其可以結(jié)合自然界中具有潛在傷害可能的重金屬元素，保護(hù)真菌免受傷害。黑色素因其具有氧化還原性故能有效地清除自由基，此外van Duin等〔33〕研究發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌及莢膜組織胞質(zhì)菌黑色素具有抗兩性霉素B及卡泊芬凈的作用。對(duì)黑色素的抗宿主免疫反應(yīng)研究顯示，在新生隱球菌、著色芽生菌、申克孢子絲菌等的實(shí)驗(yàn)研究中，黑色素具有在體內(nèi)外抗宿主吞噬細(xì)胞吞噬的作用〔34，35〕。同時(shí)黑色素具有抗原性與抗炎特性，可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)較強(qiáng)的T細(xì)胞依賴性抗體應(yīng)答反應(yīng)，新型隱球菌產(chǎn)生的黑色素可激活補(bǔ)體反應(yīng)〔36,37〕。

綜上所述，黑色素在真菌致病過程中發(fā)揮復(fù)雜的作用，其作為申克孢子絲菌的一種重要毒力因子，參與其致病過程?？梢酝ㄟ^測(cè)量真菌黑色素含量的不同，進(jìn)一步驗(yàn)證其與真菌毒力的關(guān)系，有助于對(duì)真菌發(fā)病機(jī)制的研究。

4參考文獻(xiàn)

1Dixon DM,Salkin IF,Duncan RA,etal.Isolation and characterization of Sporothrix schenckii from clinical and environmental sources associated with the largest U.S.epidemic of sporotrichosis〔J〕.J Clin Microbiol,1991;29(6):1106-13.

2Morris-Jones R.Sporotfichosis〔J〕.Clin Exp Dermatol,2002;27(6)：427-31.

3De Amujo T，Marques AC，Kerdel F.Sporotriehosis〔J〕.InI J Dennatol,2001；40(12)：737-42.

4Kauffman CA.Spomtrichosis〔J〕.Clin Infect Dis,1999；29(2):231-6.

5Alvarado-Ramirez E,Torres-Rodriguez JM.In vitro susceptibility of Sporothrix schenckii to six antifungal agents determined using three different methods〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2007；51(7):2420-3.

6Madrid H,Cano J,Gene J,etal.Sporothrix globosa,a pathogenic fungus with widespread geographical distribution〔J〕.Revi Iberoam Micol,2009；26(3):218-22.

7Marimon R,Cano J,Gené J,etal.Sporothrix brasiliensis,S.globosa ,and S.mexicana ,three new Sporothrix species of clinical interest〔J〕.J Clin Microbiol,2007；45(10):3198-206.

8譚靜文，劉偉，萬喆,等.來自中國北方部分地區(qū) 33 株孢子絲菌菌株的表型和基因型鑒定〔J〕.菌物學(xué)報(bào),2013；32(2):161-7.

9Liu TT，Zhang K，Zhou X.Molecular identification of Sporothrix clinical isolates in China〔J〕.J Zhejiang Univ Sci,2014；15(1):100-8.

10Arrillaga-Moncrieff I,Capilla J,Mayayo E.Different virulence levels of the species of Sporothrix in a murine model〔J〕.Clin Microbiol Infect,2009；15(7):651-5.

11Hu S,Chung WH,Hung SL,etal.Detection of Sporothrix schenckii in clinical samples by a nested PCR assay〔J〕.J Clin Microbiol,2003;41(4):1414-8.

12Kauffman CA,Bustamante B,Chapman SW,etal.Clinical practice guidelines for the management of sporotrichosis:2007 update by the Infectious Diseases Society of America〔J〕.Clin Infect Dis,2007;45(10):1255-65.

13李福秋，金學(xué)洙.申克飽子絲菌的體外耐熱實(shí)驗(yàn)觀察〔J〕.中華皮膚科雜志,1996;29(5):359-60.

14Romero-Martinez R ,Wheeler M,Guerrero-Plata A ,etal.Biosynthesis and functions of melanin in sporothrix schenckii〔J〕.Infect Immun,2000;68(6):3696-703.

15al-Tawfiq JA,Wools KK.Disseminated sporotrichosis and Sporothrix schenckii fungaemia as the initial presentation of human immunodefi ciency virus infection〔J〕.Clin Infect Dis,1998;26(6):1403-6.

16Casadevall A,Rosas AL,Nosanchuk JD.Melanin and virulence in Cryptococcus neoformans〔J〕.Curr Opin Microbiol,2000；3(4):354-8.

17Langfelder K，Streibel M，Jahn B，etal.Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi〔J〕.Fungal Genet Biol，2003;38(2):143-58.

18Almeida-Paes R,Frases S,Fialho Monteiro PC,etal.Growth conditions influence melanization of Brazilian clinical Sporothrix schenckii isolates〔J〕.Microbes Infect,2009;11(5):554-62.

19Morris-Jones R,Youngchim S,Gomez BL,etalSynthesis of melanin-like pigments by Sporoth rix schenckii in vitro and during mammalian infection〔J〕.Infect Immun,2003;71(7):4026-33.

20Dixon DM,Migliozzi J ,Cooper CR,etal.Melanized and non-melanized multicellular form mutants of Wangiella dermatitidis in mice:mortality and histopathology studies〔J〕.Mycoses,1992;35(1-2):17-21.

21Lima OC,Figueiredo CC,Pereira BA,etal.Adhesion of the human pathogen sporothrix schenckii to several extracellular matrix proteins〔J〕.Braz J Med Res,1999;32(5):651-7.

22Mohri H.Fibronectin and integrin interactions〔J〕.J Investig Med,1996；44(8):429-41.

23Iima OC，Bouchara JP，Renier G，etal.Immunofluorescence and flow cytometry analysis of fibronectin and laminin binding to Sporothrix schenckii yeast cells and conidia〔J〕.Microb pathog,2004；37(3):131-40.

24Fernandes KS,Mathews HL,Lopes Bezerra LM,etal.Differences in virulence of Sporothrix schenckii conidia related to culture conditions and cell-wall components〔J〕.J Med Microbiol，1999；48(2):195-203.

25Ruiz-Baca E,Toriello C,Perez-Torres A,etal.Isolation and some properties of a glycoprotein of 70 kDa (Gp70) from the cell wall of Sporothrix schenckii involved in fungal adherence to dermal extracellular matrix〔J〕.Med Mycol,2009;47(2):185-96.

26Sandoval-Bernal G,Barbosa-Sabanero G,Shibayama M,etal.Cell wall glycoproteins participate in the adhesion of Sporothrix schenckii to epithelial cells〔J〕.Mycopathologia,2011;171(4):251-9.

27Bell AA，Wheeler MH.Biosynthesis and functions of fungal melanins〔J〕.Ann Rev Phytopathol，2003;24(1):411-51.

28Butler MJ，Day AW，Henson JM，etal.Pathogenic properties of fungal melanins 〔J〕.Mycologia，2001;93(1):1-8.

29Nosanchuk JD，van Duin D，Mandal P，etal.Blastomyces dermatitidis produces melanin in vitro and during infection〔J〕.FEMS Microbiol Lett,2004;239(1)：187-93.

30Plonka PM，Grabacka M.Melanin synthesis in microorganisms-biotechnological and medical aspects〔J〕.Acta Biochim Pol，2006;53(3)：429-43.

31Gómez BL,Nosanchuk JD,Díez S,etal.Detection of melanin-like pigments in the dimorphic fungal pathogen Paracoccidioides brasiliensis in vitro and during infection〔J〕.Infect Immun,2001;69(9):5760-7.

32侯幼紅,呂江陵,黃瑛,等.真菌色素與真菌感染〔J〕.中國真菌學(xué)雜志,2008;3(6):375-80.

33van Duin D,Casadevall A,Nosanchuk JD.Melanization of Cryptococcus neoformans and Histoplasma capsulatum reduces their susceptibility to amphotericin B and caspoungin〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2002;46(11)：3394-400.

34Garcia-Rivera J，Tucker SC，F(xiàn)eldmesser M，etal.Laccase expression in murine pulmonary Cryptococcus neoformans infection〔J〕.Infect Immun，2005;73(5):3124-7.

35Cunha MM,Franzen AJ,Alviano DS,etal.Inhibition of melanin synthesis pathway by tricyclazole increases susceptibility of Fonsecaea pedrosoi agains tmouse macrophages〔J〕.Microsc Res Tech,2005;68(6):377-84.

36Nosanchuk JD,Rosas AL,Casadevall A.The antibody response to fungal melanin in mice〔J〕.J Immunol,1998;160(12):6026-31.

37Rosas AL,MacGill RS,Nosanchuk JD,etal.Activation of the alternative complement pathway by fungal melanins〔J〕.Clin Diagn Lab Immunol,2002;9(1):144-8.

〔2014-03-16修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)