DNA條形碼及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用

徐武杰,汪 雁,鄒節(jié)新,3 ,朱春潮,3,周憲民,3

DNA條形碼及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用

徐武杰1,汪 雁2,3,鄒節(jié)新1,3,朱春潮1,3,周憲民1,3

寄生蟲作為與人類健康密切相關(guān)的特定生物類群，其分類是寄生蟲學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。DNA條形碼(DNA barcoding)即通過使用一段標準DNA片段進行快速、準確的物種鑒定。它是繼RFLP、PCR-RFLP、SSR-PCR、ISSR等之后，在計算機及互聯(lián)網(wǎng)得到廣泛應(yīng)用基礎(chǔ)上，新發(fā)展起來的一項分子標記技術(shù)。因其具有在動物分類中可克服表型可塑性(Phenotypic plasticity)和遺傳可變性(Genetic variability)的影響，以及不受性別和發(fā)育階段限制等突出特點，而成為當(dāng)前分類學(xué)研究的熱點。本文闡述了DNA條形碼的概念形成及發(fā)展、基本方法及尚存在的部分爭議，介紹了該技術(shù)在寄生蟲學(xué)原蟲、蠕蟲和節(jié)肢動物分類鑒定中的應(yīng)用概況，同時對DNA條形碼相關(guān)技術(shù)的發(fā)展以及在寄生蟲學(xué)研究中的應(yīng)用前景進行了展望。

DNA條形碼；寄生蟲；分類

寄生蟲分類的基礎(chǔ)源于卡爾·林奈(Carolus Linnaeus，1707- 1778)1735年在其著作《自然系統(tǒng)》(Systema Naturae)提出的“雙名法”，并在達爾文的共同祖先原則上逐步建立起來的生物分類體系。寄生蟲的分類通常采用以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合宿主、生活史與地理分布等方面特點的經(jīng)典分類法，但隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，人類對物種的定義、分類及其系統(tǒng)發(fā)育問題認識的不斷深入，經(jīng)典分類法本身所固有的一些局限性也逐漸顯露出來，其中突出的表現(xiàn)為物種的表型可塑性(Phenotypic plasticity)和遺傳可變性(Genetic variability)對準確分類的影響[1]。此外，物種的多樣性、個體完整性、發(fā)育階段限制性及對鑒定專家的依賴性均嚴重制約了經(jīng)典分類法在寄生蟲學(xué)研究中的應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展，RFLP、PCR-RFLP、SSR-PCR、ISSR、SNP等一系列分子遺傳標記技術(shù)已應(yīng)用于物種分類鑒定中，但由于沒有形成統(tǒng)一的分子鐘及關(guān)于屬種等分類階元之間遺傳距離或遺傳差異的普遍標準，極大限制了這些分子遺傳標記技術(shù)在物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)生分析中的廣泛應(yīng)用。當(dāng)前依托互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)交流的便利性，以原有的分子遺傳標記技術(shù)為基礎(chǔ)，產(chǎn)生的DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)，已逐漸成為DNA分類學(xué)的研究熱點。

1 DNA條形碼的概念形成及發(fā)展

DNA 條形碼(DNA barcoding)是指一段較短的、能夠高效鑒定物種的DNA標準序列[1]。DNA barcoding技術(shù)是指對一個標準化、較短的DNA序列片段的變異進行分析的一種分子分類技術(shù)，具有原理簡單、操作便捷、準確率高、可重復(fù)性強、利于標準化等優(yōu)點，是物種鑒定、發(fā)現(xiàn)隱存種和研究生物遺傳多樣性、生物系統(tǒng)進化、分類和生物保護等的有力工具[2-3]。

Paul Hebert等[1]于2003年對脊椎動物和無脊椎動物共11門13 320個物種的線粒體細胞色素C氧化酶亞基基因(COⅠ)序列比較分析，發(fā)現(xiàn)除腔腸動物外，98%的物種的平均遺傳距離在種內(nèi)為0% ～2%，種間差異則可達到11.3%，受商品條形碼技術(shù)(Barcode techniques)的啟發(fā)，據(jù)此提出可以用單一的小片段基因作為物種的DNA條形碼(DNA Barcoding)為全球生物編碼。2003年3月和9月在美國冷泉港分別召開題為“Taxonomy and DNA”和“Taxonomy, DNA and the Barcode of Life”會議，會議系統(tǒng)地提出基于DNA序列片段鑒定生物物種的標準及其實施框架，正式發(fā)起了國際生命條形碼計劃(International Barcode of Life, iBOL, http: //www. barcodeoflife. org)[2]。2004年華盛頓Smithsonian國家自然歷史博物館成立生命條形碼聯(lián)盟(consortium for the barcode of life, CBOL, http: //moc. barcodeoflife. net/)， 成立了專門組織以發(fā)展DNA條形碼鑒定生物物種的全球標準。隨后，在2005年至2011年先后召開了四次國際DNA條形碼會議，極大推進DNA條形碼研究在全球范圍展開。2013年10月，iBOL中國委員會承辦的“第五屆國際生命條形碼大會”在中國云南舉行，會議圍繞“全球變化下的生命條形碼：挑戰(zhàn)與機遇”主題，就DNA條形碼研究的最新進展成果進行了深入探討和交流，并發(fā)布《昆明宣言》呼吁加強全球范圍在生命條形碼領(lǐng)域的進一步合作(http: //www.cas.cn/hy/xshd/201311/t20131104_3967353.shtml)。截止2014年8月22日，國際生命條形碼計劃收錄樣本4 463 670份，涵蓋動物、植物、真菌和原生生物，尤以節(jié)肢動物門(3 329 106)、脊索動物門(417 094)和被子植物門(275 030)樣本居多。其中條形碼樣本3 309 531份，包含213 059種物種(http: //www. barcodinglife. org)。

在國內(nèi)，早在2008年初中國科學(xué)院即與iBOL共同簽訂合作備忘錄，并成立了由中國科學(xué)院和高等院校組成的iBOL中國委員會，2010年，在iBOL中國委員會的推動下，以國家自然科學(xué)基金委員會重大項目形式，選擇了部分重要生物類群(兩棲爬行動物、魚類、榕小蜂)開展DNA條形碼研究[4]。此外，國內(nèi)學(xué)者對其他生物類群如：韓建萍等對中藥材；劉沐桑等對8種病原真菌；馬明義等對32種鳥類等等多種生物類群的DNA條形碼進行了研究與嘗試[5-7]。我們在中國知網(wǎng)(http: //epub. cnki. net)以“DNA條形碼”為關(guān)鍵詞，對2009到2013年五年間發(fā)表的相關(guān)文獻進行搜索，結(jié)果文獻數(shù)量分別103、161、229、338、426篇；在科學(xué)基金共享服務(wù)網(wǎng)(http: //npd. nsfc. gov. cn)以“DNA條形碼”為項目主題詞，搜索2009至2013年度近五年批準資助國家自然科學(xué)基金項目數(shù)量分別為219、308、371、391、402項。上述數(shù)據(jù)表明，DNA條形碼研究已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，但截止2014年8月22日，搜索BOLD數(shù)據(jù)庫(http: //www. barcodinglife. org)僅發(fā)現(xiàn)4條淡水蟹類DNA條形碼標準基因數(shù)據(jù)，因此亟待開展相關(guān)研究。

2 DNA條形碼研究的基本內(nèi)容

DNA條形碼研究大致由3部分內(nèi)容組成：樣品收集部分，包括動物標本的采集、相關(guān)采集數(shù)據(jù)的整理并由此評價選擇實驗標本樣品規(guī)模等；分子實驗部分，包括DNA提取、引物設(shè)計與合成、PCR擴增、測序等；數(shù)據(jù)分析部分，包括序列拼接與校對、處理與分析以及最終實現(xiàn)物種鑒定[8]。

研究方法中樣品收集與分子實驗部分均有非常多的經(jīng)驗可供參照，但在數(shù)據(jù)分析方面針對不同的生物類群相關(guān)的爭論及討論較多。如對絕大多數(shù)動物DNA條形碼標準序列采用遺傳距離法分析時，一般都采用K-2-P遺傳距離(或聯(lián)合使用K-2-P遺傳距離和P遺傳距離)，分別計算不同分類階元(種、屬)的遺傳距離并統(tǒng)計出最大值、最小值和平均值，然后繪制遺傳距離分布直方圖，根據(jù)種、屬間的遺傳距離分布規(guī)律推算出DNA條形碼間隙(barcoding gap)閾值[9]。Hebert等[10]根據(jù)鳥類的DNA條形碼研究提出barcoding gap的“10×規(guī)則”，即種間的平均遺傳距離約為種內(nèi)的10倍。進化樹分析也是DNA條形碼數(shù)據(jù)分析的基本方法，常用的有NJ樹、BI樹、ML樹和MP樹等，其基本原理是根據(jù)所建進化樹的聚類關(guān)系確定樣品的物種： 同種個體往往聚為一支，而不同種個體則形成不同的集合[11]。但需要注意的是所建進化樹反映的僅僅是樣本個體間的聚類，而非各物種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的全面反映。BLAST、BLAT、FASTA等相似性分析方法也常常用于DNA條形碼數(shù)據(jù)分析，其中BLAST比對法最為普遍，其采用局部比對或者近乎精確的短字符串匹配算法，評估查詢序列與參考序列的數(shù)據(jù)相似度，鑒定標準是查詢序列與參考物種目標序列相似度至少高于80%[12]。此外，近年來采用CAOS(Characteristic Attribute Organization System)、BLOG(Barcoding with LOGic Formulas)等基于診斷法的分析，以及回歸樹法CART(Classification And Regression Trees)、隨機森林法RF(Random Forest)等統(tǒng)計分類法分析也逐漸應(yīng)用于DNA條形碼研究[13-14]。

總之，各種DNA條形碼分析方法各有其特點，在各類生物數(shù)據(jù)庫GenBank(http//www．ncbi．nlm．nih．gov/genbank)、BOLD(http: //www. barcodelife. org)、ABBI(All Birds Barcoding Initiative, http: //www. barcodingbirds. org/)、FISH-BOL(Fish Barcod of Life, http: //www. fishbol.org/)、All Leps(http: //www. lepbarcoding. org/)、TBI(Tephritid Barcode Initiative)、MBI(Mosquito Barcode Initiative)中，至今并未存在一種完全通用于所有物種的單一分析方法及軟件。分類數(shù)據(jù)急劇增長的背景下，DNA條形碼分析方法正向多樣化和整合分析的方向發(fā)展，其中生物信息學(xué)方法將起到愈來愈重要的作用[8]。

3 DNA條形碼存在的爭議

自Hebert提出“DNA條形碼”概念以來，得到了許多生物學(xué)家的支持并在相關(guān)研究中取得較大進展，條形碼技術(shù)已發(fā)展成為一種公認的快速高效生物物種鑒定的方法。但與此同時自身存在的若干問題在業(yè)內(nèi)也多有不同意見，當(dāng)前對DNA條形碼的爭議主要集中在以下幾個方面：

3．1 有研究證據(jù)表明標準條形碼的選擇有可能造成部分生物多樣性的忽視 如對真核微生物的研究表明：標準條形碼序列的選取存在廣泛性和精確性的矛盾：若選取容易在所有種群擴增的基因片段，則該片段需具備高度的保守性，則會造成種群真實數(shù)量的低估；若選取更精確的描述種群數(shù)量的基因片段，則很難在所有種群中擴增[15]。而實際上，參考數(shù)據(jù)庫中每個物種的代表樣本包含的是物種所有群體多樣性的主要組成部分[2]，因此，DNA條形碼往往在鑒定復(fù)雜且近期分化的種群上失敗，可能忽視了該種群的部分生物多樣性[16]。

3．2 條形碼間隙的爭議 “Barcoding Gap”，作為條形碼技術(shù)的關(guān)鍵問題，是指選擇的標記序列在種內(nèi)和種間變異的范圍和距離[17]。若達到序列差異的標準閾值(即種間遺傳距離超過種內(nèi)遺傳距離的十倍，二者存在明顯的間隙。)基本可以將未鑒定的個體準確確定到它所在種的水平[10]。但實際上，這種方法可能出現(xiàn)假陽性和假陰性的錯誤[18]：一個種的遠緣種群若長期與同種或不同種的生物種群之間產(chǎn)生基因交流，就可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果；反之，若不同生物學(xué)物種之間序列差異相對較小，則出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，Rudolf Meier等通過量化12459種后生動物的43 137條基因庫序列種間距離，認為條形碼間隙應(yīng)使用最小種間間距，而不是被錯誤放大的平均種間間距[19]。

3．3 線粒體遺傳的固有風(fēng)險 由于線粒體DNA是母系遺傳，其多樣性與母代的遺傳結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，使用線粒體基因位點存在高估樣本分化的可能性，導(dǎo)致種群的結(jié)論不準確[2]。再者，物種的線粒體遺傳會被其細胞內(nèi)感染的共生生物的影響。如果種群被一種或多種共生生物感染，其線粒體多態(tài)性因這些共生生物通過自然選擇而改變，因此線粒體DNA不能單獨適用于歷史密切相關(guān)或近期分化的物種[20]。此外，Benoit Nabholz等[21]通過對物種及其生活史特性、分類，分析線粒體的多樣性，表明線粒體多樣性本質(zhì)上很難預(yù)測，不能完全準確反映物種的多樣性。

起初提出DNA條形碼概念，生物學(xué)家是希望能找到一個基因或者一段DNA序列就可以區(qū)別地球上所有的物種。但實際上，同一DNA條形碼片段在不同類群中的使用效果不同，目前尚未獲得統(tǒng)一的DNA條形碼作為標準片段，如植物更適合選擇mat K和 rbc L，而真菌多選擇核基因的ITS[22]。因此，對可能的DNA條形碼片段進行選擇和評價在當(dāng)前依然有研究的必要。但是，COⅠ基因片段已證明適用于大部分動物物種鑒定[23]。

4 DNA條形碼技術(shù)在動物分類及寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用概況

4．1 用于原蟲的分類鑒定 原蟲為單細胞真核動物，屬于原生動物界。迄今為止，DNA條形碼已運用于葉足蟲、鞭毛蟲、孢子蟲、纖毛蟲等原蟲的種屬鑒定中[24-26]。

Ttypanosome(錐蟲)是寄生在魚類、哺乳類以及人血液、組織、細胞內(nèi)的鞭毛蟲。由于Ttypanosome部分種類在形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分，致病性上卻相差很大，因此準確鑒定Ttypanosome的種類相當(dāng)必要。Noyes等[27]總結(jié)以往的資料，推測澳洲袋鼠攜帶的trypanosomes與Ttypanosomalewisi(一種世界廣布的鼠類錐蟲)相關(guān)。而Patrick B．Hamilton等[25]運用DNA條形碼數(shù)據(jù)，基于18S rRNA基因和磷酸甘油醛脫氫酶基因(gGAPDH)的系統(tǒng)發(fā)育樹，證實澳洲袋鼠攜帶的trypanosomes與T．cruzi(克氏錐蟲)的關(guān)系更為密切，而不是T．lewisi。

Eimeriatenella隸屬于球蟲目(coccidian)艾美耳屬(Eimeris)，是單細胞寄生性原蟲，可引起嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的雞球蟲病，遍及世界各地。準確鑒定艾美耳球蟲，了解其細胞和分子生物學(xué)特性，對防治雞球蟲病有及其重要的意義。Joseph D．Ogedengbe等[26]通過對其實驗室艾美球蟲屬樣本進行基于COⅠ序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，證實COⅠ可作為球蟲目(coccidian)艾美耳屬(Eimeris)物種鑒定很好的標記物，成為球蟲亞綱合適的DNA條形碼靶位。同時可與18S rDNA序列的聯(lián)合運用，使用系統(tǒng)發(fā)生數(shù)據(jù)協(xié)助區(qū)分coccidian(球蟲亞綱)至Apicomplexa(頂復(fù)亞門)中并系類群。

4．2 用于蠕蟲的分類鑒定 蠕蟲為多細胞無脊椎動物，因借肌肉的收縮而作蠕動狀運動。在吸蟲、絳蟲、線蟲等蟲種鑒定中均有DNA條形碼的運用[28-30]。

不同的血吸蟲種株對中間宿主、終宿主的相容性，致病以及藥物的敏感性等方面均存在差異，故血吸蟲種株的分類研究對其流行病學(xué)研究、疾病的控制等方面均具有重要意義。Scott P.Lawton等[28]對Hungary(匈牙利)采集的10條Schistosomaturkestanicum雄性成蟲DNA提取和PCR擴增，DNA序列比對和系統(tǒng)發(fā)育重建，細胞色素氧化酶1(COⅠ)和核核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)(ITS)比對，結(jié)果顯示S．turkestanicum與亞洲血吸蟲株具有明顯差異，屬于匈牙利特有株。

Echinococcus(棘球絳蟲)是一種全球分布的寄生蟲，可引起一種嚴重的人獸共患病——包蟲病(Echinococcosis)。張高天等[29]通過對細粒棘球絳蟲(E.granulosus)、多房棘球絳蟲(E.multilocularis)和石渠棘球絳蟲(E．shiquicus)DNA提取，目的片段的擴增，產(chǎn)物檢測純化擴增，遺傳距離的計算和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示平均種間遺離是種內(nèi)遺傳距離的12到18倍，證明了DNA條形碼技術(shù)是棘球絳蟲種屬鑒別行之有效的技術(shù)。

Filaria(絲蟲)是由節(jié)肢動物傳播的一類寄生蟲線蟲。不同絲蟲種群的傳播媒介、致病性等均有所不同。Emanuele Ferri等[30]通過比較傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法和DNA條型碼技術(shù)在區(qū)分絲蟲種類上適用性和有效性，用不同參數(shù)比較形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定的相關(guān)性，證明使用COⅠ和一定水平的核苷酸的差異可以劃分種群范圍，此外DNA條型碼技術(shù)也可以用來推斷潛在的的隱存種。

Trichuristrichiura(毛首鞭形線蟲)簡稱鞭蟲，為人體和動物腸道常見的寄生線蟲。診斷鞭蟲感染依靠其特征性蟲卵——呈紡錘形且兩端各有一透明塞狀突起。隨著生物種群的不斷進化和發(fā)展，尤其對那些相似種或近緣種，寄生蟲的形態(tài)學(xué)鑒定越來越顯出它的局限性，如鞭蟲的形態(tài)會受宿主種類的影響。Lisa Guardone 等[31]鑒于不同種的鞭蟲卵形態(tài)相似，形態(tài)學(xué)診斷難以達到種的水平，通過鞭蟲成蟲和卵DNA的提取、PCR、測序和數(shù)據(jù)分析，證明COⅠ基因位點的種間差異很大，可作為合適的DNA條形碼，在分辨近緣物種上具有重要價值。

4．3 用于節(jié)肢動物的分類鑒定 節(jié)肢動物門是動物界中最大的一門，分布廣泛，占動物種類2/3以上。昆蟲綱、蛛形綱、甲殼綱中序列測定的成功運用，證明了DNA條形碼在節(jié)肢動物鑒定中的有效性及重要性[32-34]。

蚊隸屬于雙翅目、蚊科，是瘧疾、絲蟲病和流行性乙型腦炎等多種疾病的傳播媒介。蚊的外部形態(tài)鑒定相對困難，尤其是作為疾病監(jiān)測指標的野外采集樣本。面對這個難題，王剛等[32]通過對中國八個省份的已使用形態(tài)方法鑒定的三個亞科15屬122種或亞種的蚊樣本分析檢測，進行了樣本COⅠ序列分析和NJ樹分析，首次提供了中國蚊子的COⅠ條形碼，進一步證實了DNA條形碼鑒定物種的有效性。

葉螨類隸屬于蜱螨亞綱葉螨科，是農(nóng)作物、林木和花卉等的重要有害植物寄生蟲。為了了解和推斷葉螨的進化過程和生態(tài)多樣性，準確的進行種的劃分和識別極為重要。鑒于葉瞞科物種有限的形態(tài)學(xué)特征，且這些特征具有高度的相似性，傳統(tǒng)形態(tài)鑒定相對困難，李國慶等[33]通過葉螨DNA提取、擴增、測序及相關(guān)分析，探討了基于線粒體COⅠ作為分子條形碼解決中國葉滿科物種鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育問題的可行性，結(jié)果顯示種間差異大于種內(nèi)差異，屬間差異大于種間差異，證實COⅠ基因序列可以用于葉瞞物種的系統(tǒng)發(fā)育分析。

甲殼綱作為節(jié)肢動物最多樣化的群體之一，其中部分類群是寄生蟲的中間宿主或終宿主。鑒于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類上的不足，F(xiàn)ilipe O. Costa等[34]通過對150份來自不同種的甲殼動物樣本進行DNA提取、擴增、測序以及數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示種間核苷酸序列差異是種內(nèi)個體間差異的19到48倍，證明COⅠ條形碼區(qū)域的序列變異對鑒別甲殼動物種類非常有效，條形碼技術(shù)適用于甲殼動物的分類鑒定。

此外，Martha Betson等[35]使用DNA條碼技術(shù)和微衛(wèi)星DNA對Unguja Zanzibar蛔蟲進行分子流行病學(xué)調(diào)查，Jorge Azpurua等[36]通過使用DNA測序技術(shù)來確定巴拿馬 Barro Colorado Island白蛉的生物多樣性以及可能的系統(tǒng)發(fā)生。DNA條形碼技術(shù)在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用已不僅僅局限于蟲種的分類鑒定，它已滲透到寄生蟲學(xué)相關(guān)的各個方面。

5 展 望

伴隨各類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的建立及技術(shù)的進步，尤其是第二代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)的出現(xiàn)，產(chǎn)生了利用高通量測序技術(shù)獲得條形碼基因擴增子序列的方法，即對混合樣本擴增DNA條形碼序列后進行高通量測序，在對高通量測序數(shù)據(jù)集的后續(xù)生物信息學(xué)分析中引入分子操作分類單元(molecular operational taxonomic units: MOTU)， 從混合樣品中自動識別出多個物種，稱為DNA metabarcoding 技術(shù)，目前該技術(shù)已用于微生物和動物的相關(guān)研究中[37,38]。DNA metabarcoding技術(shù)為寄生蟲及宿主的同步研究提供了一個前所未有的便捷工具。并且，應(yīng)用PCR-free metabarcoding技術(shù)可評估混合樣品中每個物種線粒體DNA的數(shù)量[38]，這為病原學(xué)調(diào)查提供了一種檢測病原體感染度的新方法。

此外，微型條形碼(DNA minibarcoding)，是指利用長度僅為100-200 bp的部分標準條形碼基因序列進行鑒定物種。微型條形碼技術(shù)的發(fā)展，對博物館、標本館等保存的陳舊樣本利用具重大意義。國際上，Lee 等[39]從已有75年歷史的標本中擴增出微型條形碼研究印度喜馬拉雅山脈小翅蛾的分類地位，在國內(nèi)程鵬等[40]將DNA微型條形碼應(yīng)用于53個魚類樣品中證明其具有高準確性。

目前，我國的DNA條形碼研究正通過國家自然科學(xué)基金重大項目及國家科技支撐計劃項目[4]等形式，逐步以統(tǒng)一體系、規(guī)范領(lǐng)導(dǎo)的模式加入到國際生命條形碼計劃中，成為全球性研究的一個重要組成部分，但另一方面，對諸如寄生蟲等病原生物或醫(yī)學(xué)媒介生物等獨特生物類群的DNA條形碼研究，依然呈零散研究為主態(tài)勢，缺乏系統(tǒng)性的引導(dǎo)，亟待在國家層面有重點、有系統(tǒng)地推進病原生物DNA條形碼研究。

[1]Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proc R Soc Lond B, 2003, 270: 313-321. DOI: 10.1098/rspb.2002.2218

[2]Frezal L, Leblois R. Four years of DNA barcoding: Current advances and prospects[J]. Infect Genet Evolut 2008, 8: 727-736. DOI: 10.1016/j.meegid.2008.05.005

[3]Pecnikar ZF, Buzan EV. 20 years since the introduction of DNA barcoding: from theory to application[J]. J Appl Genetics, 2014, 55(1): 43-52. DOI: 10.1007/s13353-013-0180-y

[4]Chen L, Hu JJ, Chen Y, et al. The national natural science fund committee major projects "animal DNA barcode gene and cryptic diversity research" through review[J]. Chin Bullet Life Sci, 2011, 23(3): 231-233. (in Chinese) 陳領(lǐng), 胡景杰, 陳越, 等. 國家自然科學(xué)基金委員會重大項目“動物DNA 條形碼基因和隱存多樣性的研究”通過評審論證[J]. 生命科學(xué), 2011, 23(3): 231-233.

[5]Han YM, Shong JY, Yao H, et al. Comparison of DNA barcoders in identifying medicinal materials[J]. China J Chin Materia Medica, 2012, (8): 1056-1061. (in Chinese) 韓建萍, 宋經(jīng)元, 姚輝, 等. 中藥材DNA 條形碼鑒定的基因序列比較[J]. 中國中藥雜志, 2012, (8): 1056-1061.

[6]Liu MS, Mei H, Lv GX, et al. Construction of medical fungi DNA barcoding and evaluation of its value in applying[J]. Chin J Lepr Skin Dis, 2012, 28(5): 311-313. (in Chinese) 劉沐桑, 梅繯, 呂桂霞, 等. 8種病原真菌DNA條形碼的構(gòu)建和應(yīng)用評價[J]. 中國麻風(fēng)皮膚病雜志, 2012, 28(5): 311-313.

[7]Ma MY, Yan Y, Wang YW, et al. A study of DNA barcoding on 32 species of bird in China[J]. Sichuan J Zool, 2012, 31(5): 729-733. DOI: 10.3969 /j.issn.1000-7083.2012.05.008 (in Chinese) 馬明義, 閆穎, 王譯偉, 等. 我國32 種鳥類DNA 條形碼分析[J]. 四川動物, 2012, 31(5): 729-733.

[8]Li J, Liu XT, Guo WH, et al. Progress of analytic methods in animal DNA barcoding[J]. Sichuan J Zool, 2013, 32(6): 950-954. DOI: 10.3969 /j.issn.1000-7083.2013.06.030 (in Chinese) 李晶, 劉雪濤, 郭華威, 等. 動物DNA條形碼之分析方法研究進展[J]. 四川動物, 2013, (32)6: 950-954.

[9]Zemlak TS, Ward RD, Connell AD, et al. DNA barcoding reveals overlooked marine fishes[J]. Mol Ecol Resour, 2009, 9(s1): 237-242. DOI: 10.1111/j.1755-0998.2009.02649.x

[10]Hebert PD, Stoeckle MY, Zemlak TS, et al. Identification of birds through DNA Barcodes[J]. PLoS Biol, 2004, 2(10): 1657-1663. DOI: 10.1371/journal.pbio.0020312.g003

[11]Ma H, Ma C, Ma L. Molecular identification of genus Scylla (Decapoda: Portunidae) based on DNA barcoding and polymerase chain reaction[J]. Biochem Syst Ecol, 2012, 41: 41-47. DOI: 10.1016/j.bse. 2011. 12.016

[12]Velzen RV, Weitschek E, Felici G, et al. DNA barcoding of recently diverged Species: relative performance of matching methods[J]. PLoS ONE, 2012, 7(1): 1-12. DOI: 10.1371/journal.pone.0030490.t001

[13]Bertolazzi P, Felici G, Weitschek E. Learning to classify species with barcodes[J]. BMC Bioinformatics, 2009, 10(s14): S7. DOI: 10.1186/1471-2105-10-S14-S7

[14]Weitschek E, Velzen RV, Felici G, et al. BLOG 2. 0: a software system for character-based species classification with DNA barcode sequences. What it does, how to use it[J]. Mol Ecol Resour, 2013, 13(6): 1043-1046.DOI:10.1111/1755-0998.12073.

[15]Piganeau G, Walker AE, Grimsley N, et al. How and why DNA barcodes underestimate the diversity of microbial eukaryotes[J]. PLoS ONE, 2011, 6(2): 1-6. DOI: 10.1371/journal.pone.0016342.t001

[16]Maia VH, Mata CS, Franco LO, et al. DNA barcoding bromeliaceae: achievements and pitfalls[J]. PLoS ONE, 2012, 7(1): 1-6. DOI: 10.1371/journal.pone.0029877.g001

[17]Meyer CP, Paulay G. DNA Barcoding: Error rates based on comprehensive sampling[J]. PLoS Biol, 2005, 3(12): 1-10. DOI: 10.1371/journal.pbio.0030422

[18]Wiemers M, Fiedler K. Does the DNA barcoding gap exist? - a case study in blue butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae)[J]. Front Zool, 2007, 4(8): 1-16. DOI: 10.1186/1742-9994-4-8

[19]Meier R, Zhang G, Ali F. The use of mean instead of smallest interspecific distances exaggerates the size of the "Barcoding Gap" and leads to misidentification[J]. Syst Biol, 2008, 57(5): 809-813. DOI: 10.1080/10635150802406343

[20]Hurst GD, Jiggins FM. Problems with mitochondrial DNA as a marker in population, phylogeographic and phylogenetic studies: the effects of inherited symbionts[J]. Proc R Soc B, 2005, 272: 1525-1534. DOI: 10.1098/rspb.2005.3056

[21]Nabholz B, Mauffrey JF, Bazin E, et al. Determination of mitochondrial genetic diversity in mammals[J]. Genetics, 2008, 178: 351-361. DOI: 10.1534/genetics.107.073346

[22]Chase MW, Fay MF. Barcoding of plants and fungi[J]. Science, 2009, 325: 682-683. DOI: 10.1126/science.1176906

[23]Liu SY, Chan CL, Lin O, et al. DNA barcoding of shark meats identify species composition and CITES-listed species from the markets in Taiwan[J]. PLoS ONE, 2013, 8(11): 1-8. DOI: 10.1371/journal.pone.0079373.t001

[24]Kosakyan A, Gomaa F, Mitchell EA, et al. Using DNA-barcoding for sorting out protist species complexes: A case study of the Nebela tincta-collaris-bohemica group (Amoebozoa; Arcellinida, Hyalospheniidae)[J]. Europ J Protistol, 2013, 49: 222-237. DOI: 10.1016/j.ejop.2012.08.006

[25]Hamilton PB, Stevens JR. Resolving relationships between Australian trypanosomes using DNA barcoding data[J]. Trends Parasitol, 2011, 27(3): 99. DOI: 10.1016/j.pt.2010.11.009

[26]Ogedengbe JD, Hanner RH, Barta JR. DNA barcoding identifiesEimeriaspecies and contributes to the phylogenetics of coccidian parasites (Eimeriorina, Apicomplexa, Alveolata)[J]. Int J Parasitol, 2011, 41: 843-850. DOI: 10.1016/j.ijpara.2011.03.007

[27]Thompson RC, Lymbery AJ, Smith A. Parasites, emerging disease and wildlife conservation[J]. Int J Parasitol, 2010, 40: 1163-1170. DOI: 10.1016/j.ijpara.2010.04.009

[28]Lawton SP, Majoros G. A foreign invader or a reclusive native? DNA barcoding reveals a distinct European lineage of the zoonotic parasiteSchistosomaturkestanicum(syn. Orientobilharzia turkestanicum (Dutt and Srivastava, 1955))[J]. Infect Genet Evolut, 2013, 14: 186-193. DOI: 10.1016/j.meegid.2012.11.013

[29]Zhang GT. Feasible analysis of DNA barcoding on theEchinococcusspecies and a primary research on theEchinococcusinfection rate of plateau pika[D]. Shanghai: East China Normal University, 2012. (in Chinese) 張高天. 棘球絳蟲的DNA條形碼可行性分析及高原鼠兔棘球絳蟲感染率初步研究[D]. 上海: 華東師范大學(xué), 2012.

[30]Ferri E, Barbuto M, Bain O, et al. Integrated taxonomy: traditional approach and DNA barcoding for the identification of filarioid worms and related parasites (Nematoda)[J]. Front Zool, 2009, 6(1): 1-12. DOI: 10.1186/1742-9994-6-1

[31]Guardone L, Deplazes P, Macchioni F, et al. Ribosomal and mitochondrial DNA analysis ofTrichuridaenematodesof carnivores and small mammals[J]. Vet Parasitol, 2013, 197: 364-369. DOI: 10.1016/j.vetpar.2013.06.022

[32]Wang G, Li CX, Guo XX, et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding[J]. PLoS ONE, 2012, 7(10): 1-11. DOI: 10.1371/journal.pone.0047051.g001

[33]Li GQ. DNA barcoding and molecular phylogeny of the spider mites in China (Acari: tetranychidae)[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2010. (in Chinese) 李國慶. 中國葉螨DNA條形碼的研究及其系統(tǒng)發(fā)育分析[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[34]Costa FO, deWaard JR, Boutillier J, et al. Biological identifications through DNA barcodes: the case of the Crustacea[J]. Can J Fish Aquat Sci, 2007, 64: 272-295. DOI: 10.1139/F07-008

[35]Betson M, Halstead FD, Nejsum P, et al. A molecular epidemiological investigation of Ascaris on Unguja, Zanzibar using isoenyzme analysis, DNA barcoding and microsatellite DNA profiling[J]. Transact Royal Soc Trop Med Hyg, 2011, 105: 370-379. DOI: 10.1016/j.trstmh.2011.04.009[36]Azpurua J, Cruz DD, Valderama A, et al. Lutzomyia sand fly diversity and rates of infection byWolbachiaand an ExoticLeishmaniaspecies on Barro Colorado Island, Panama[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2010, 4(3): 1-9. DOI: 10.1371/journal.pntd.0000627.g001

[37]Ji Y, Ashton L, Pedley SM, et al. Reliable verifiable and efficient monitoring of biodiversity via metabarcoding[J]. Ecol Lett, 2013, 16: 1245-1257.DOI: 10.1111/ele.12162.

[38]Zhou X, Li YY, Liu SL, et al. Ultra-deep sequencing enables highfidelity recovery of biodiversity for bulk arthropod samples without PCR amplification[J]. GigaScience, 2013, 2(4): 1-12.DOI: 10.1186/2047-217X-2-4.

[39]Lees DC, Rougerier R, Lukashortc CZ, et al. DNA mini-barcodesin taxonomic assignment: a morphologically unique new homoneurousmoth clade from the Indian Himalayas described in Micropterix (Lepidoptera, Micropterigidae)[J]. Zoologica Scripta, 2010, 39: 642-661. DOI: 10.1111/j.1463-6409.2010.00447.x

[40]Cheng P, Zhang AB, Wang ZS. Mini DNA barcode utilizes in fish classification[J]. J Capital Normal Univ:Nat Sci Ed, 2012, 33(2): 48-52. (in Chinese) 程鵬, 張愛兵, 王忠鎖. 微型DNA條形碼在魚類識別上的應(yīng)用[J]. 首都師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2012, 33(2): 48-52.

DNA barcoding and its applications in parasitology

XU Wu-jie1,WANG Yan2,3,ZOU Jie-xin1,3,ZHU Chun-chao1,3,ZHOU Xian-min1,3

(1.Department of Parasitology, Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China;2.Medical Genetics and Cell Biology Laboratory, Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China; 3.Key Laboratory of Poyang Lake Environment and Resource Utilization Supported by the Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Parasite is a specific organism group closely related to human health, and its taxonomy and classification are important foundation for parasitological research. "DNA barcoding" is a rapid and accurate method for species identification through a standard DNA fragment. It is a new developed molecular marker technology after RFLP, PCR-RFLP, SSR-PCR, ISSR etc., based on the powerful computers and widely using internet. As it overcomes the negative influence of phenotypic plasticity and genetic variability, and is not restricted by gender and development stage, it has become the current hot spot in taxonomical study. In this paper, we reviewed the evolution of DNA barcode concept and technology, basic methodology, and current controversy, and described it's application in identification of protozoa, helminth and Arthropoda, the development of DNA barcode technology, and its application in parasite research.

DNA barcoding; parasite; classification

Zhou Xian-min, Email: zhouxmjxmu@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.016

國家自然科學(xué)基金項目(No. 81260257，81160207，31460156)，江西省自然科學(xué)基金(No. 20132BAB205059)，江西省醫(yī)學(xué)科研項目(No. 20122025)，江西省教育廳項目(No. GJJ12084)聯(lián)合資助

周憲民，Email：zhouxmjxmu@126.com

1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，南昌 330006； 2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與細胞生物學(xué)實驗室，南昌 330006； 3.南昌大學(xué)鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點實驗室，南昌 330047

R38

A

1002-2694(2015)04-0365-06

2014-06-28；

2014-10-24

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81260257, 81160207, and 31460156), the Natural Science Foundation of Jiangxi Province of China (No. 20132BAB205059), the Medical Scientific Research Foundation of Jiangxi Province of China (No. 20122025), and the Educational Department of Jiangxi Province of China (No. GJJ12084)