多重PCR和間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)應用于不同流行地區(qū)的牛結(jié)核病研究

張喜悅，范承祥，杜鵬飛，曹 瑞，呼西旦，王淑娟，范偉興

多重PCR和間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)應用于不同流行地區(qū)的牛結(jié)核病研究

張喜悅1，范承祥2，杜鵬飛1，曹 瑞1，呼西旦3，王淑娟1，范偉興1

目的 在牛結(jié)核病監(jiān)測中聯(lián)合應用菌株的多重PCR鑒定和間隔區(qū)寡核苷酸分型(spoligotyping)，快速鑒定分離菌株并分析不同地區(qū)流行菌株的特點。方法 分別在牛結(jié)核病清凈地區(qū)和流行地區(qū)進行牛型PPD變態(tài)反應試驗，撲殺陽性牛后進行病理檢查，并采集病料分離細菌。獲取分離菌株，進行多重PCR鑒定和spoligotyping分型，分析不同地區(qū)的菌株特征。結(jié)果 結(jié)核病清凈地區(qū)監(jiān)測到16頭牛型PPD陽性牛，撲殺后未見有病變，采集病料分離到4株分枝桿菌，經(jīng)多重PCR鑒定均為非典型分枝桿菌。流行地區(qū)監(jiān)測牛型PPD陽性23頭，撲殺后發(fā)現(xiàn)14頭有病變，采集病料后共有11頭分離到疑似菌，經(jīng)多重PCR鑒定均為牛型分枝桿菌。用spoligotyping分析共分為4個型，其中2個為未見報道的新型，報英國AHVLA牛結(jié)核spoligotyping數(shù)據(jù)庫后獲取通用編號SB1903和SB1904。結(jié)論 分離菌株中的優(yōu)勢菌株為首次報道的SB1903，但也檢出有國際流行菌株SB0140，證實該地區(qū)牛結(jié)核病的流行是以“獨特菌型地域內(nèi)相互傳播為主、輸入性感染為輔”為特征。本次監(jiān)測發(fā)現(xiàn)國內(nèi)有SB0140菌株分布，提示應調(diào)查該型菌是否已經(jīng)傳染至我國人間。

牛結(jié)核；多重PCR；間隔區(qū)寡核苷酸分型

Supported by the National Basic Research Program of China (No. 2012FY111000) and the China Agriculture (Dairy) Research System (No. CARS37) Corresponding author: Fan Wei-xing, Email: fwxsjl@126.com

牛結(jié)核病主要是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的一種人獸共患病。確診牛結(jié)核病的關(guān)鍵是能夠分離到并準確鑒定病原。傳統(tǒng)的牛結(jié)核分枝桿菌鑒定方法主要包括細菌形態(tài)、染色特性和生化鑒定等，這些鑒定方法操作復雜且需時較長。根據(jù)比較基因組學的原理，Wilton等[1]建立了可以鑒定多種分枝桿菌的分枝桿菌多重PCR并在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應用。近年來也出現(xiàn)了一些新的基因分型技術(shù)，可以從分子水平上分析不同地理區(qū)域流行的牛型分枝桿菌的特點、追蹤傳染源，對于了解牛結(jié)核分枝桿菌的生態(tài)分布與傳播，以及時提出預警等，都具有重要的意義。目前國內(nèi)外應用于結(jié)核分枝桿菌復合群基因分型方法主要分為兩類：一類是以限制性片斷長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)為基礎(chǔ)的方法[2]，另一類是以基因組中特定多態(tài)性區(qū)域序列進行PCR擴增為基礎(chǔ)的方法，其中的間隔區(qū)寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing, spoligotyping)分型方法已經(jīng)被廣泛用于牛結(jié)核分枝桿菌的分型，是第一個被認可的分型方法[2-6]。

我國目前的變態(tài)反應陽性牛均要求撲殺，但很多變態(tài)反應陽性牛并不能見到結(jié)核癥狀，且撲殺后沒有明顯的病變。根據(jù)我們前期的研究，牛結(jié)核變態(tài)反應試驗在流行率較低的地區(qū)假陽性相對較多，而在流行率較高的地區(qū)則相對較少[7]。我們在前期工作的基礎(chǔ)之上，分別撲殺在不同流行率地區(qū)檢出的變態(tài)反應陽性牛并進行細菌分離，用多重PCR方法鑒定和spoligotyping方法分型，并評估這兩種方法在不同地區(qū)的應用價值。

1 材料和方法

1.1 試劑和重要儀器 Taq DNA聚合酶(5U/μL)、PCR Master等購自于大連寶生物公司。DNA Marker 、EB(溴化乙錠)等購于Promega公司。Middle brook 7H11培養(yǎng)基，購自美國BD公司。Rnase A、蛋白酶購自大連寶生物公司。Spoligotyping 試劑盒購自O(shè)cimum Biosolution，ECL 發(fā)光檢測試劑購自Amersham International公司，親核素—過氧化物酶連接液購自Boehringer公司。顯影液和定影液均購自柯達公司。Mini-blotter MN45 為荷蘭Isogen Life Science 公司產(chǎn)品。多重PCR引物Mycgen、 TB1 、Mycav、Mycint 4和spoligotyping引物DRa、DRb均由大連寶生物公司合成。多重PCR引物序列參考文獻；DRa序列為5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′，5′末端采用Biotin標記；DRb序列為 5′ -CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。

1.2 標準菌株 結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv、牛分枝桿菌標準株AF2122/97、BCG-Pasteur標準株、禽分枝桿菌標準株、胞內(nèi)分枝桿菌標準株和草分枝桿菌標準株，均由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細菌免疫研究實驗室提供。

1.3 疫區(qū)和非疫區(qū)結(jié)核陽性牛的剖檢 地區(qū)1歷史流行率高于2%的3個結(jié)核陽性牛牛場，共計114頭牛，在檢疫后發(fā)現(xiàn)23頭陽性牛；來源于歷史流行率低于0.5%的地區(qū)2的1個牛場，共計312頭牛，經(jīng)檢疫后發(fā)現(xiàn)16頭陽性牛。將陽性牛剖殺后檢查病變，有病變的采集結(jié)核結(jié)節(jié)，無病變的采集淋巴結(jié)。

1.4 分枝桿菌的培養(yǎng)及染色鑒定 無菌條件下，采集結(jié)核病變，加入適量的滅菌生理鹽水，經(jīng)研磨器勻漿處理后，加入2倍體積的4%硫酸，室溫下處理病料15～20 min。利用生理鹽水再將處理過的病料做10倍稀釋，用移液器分別接種0.2 mL至Middle brook 7H11 培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)6周，將擴大培養(yǎng)好的臨床分離菌株和牛結(jié)核分枝桿菌標準株轉(zhuǎn)移到密閉的含有生理鹽水的試管中，將試管置于水浴鍋，經(jīng)80 ℃ 2 h滅活。用Ziehl-Neelsen(Z-N)方法染色，于顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 分離菌株的分枝桿菌多重PCR鑒定 以滅活的分離菌株作為樣品，以牛分枝桿菌標準株作為陽性對照，用Mycgen、 TB1 、Mycav和Mycint 4對引物進行擴增，擴增出1 030 bp片段表明為分枝桿菌種，擴增出372 bp片段為MTC群(包括人分枝桿菌和牛分枝桿菌等)。如果只擴增出1 030 bp片段而沒有372 bp片段則為非結(jié)核分枝桿菌。

1.6 spoligotyping鑒定分離菌株 采用Kamberbeek J推薦Spoligotyping方法并做適當改進[8]。

1.6.1 PCR擴增直接重復區(qū)(DR區(qū)) 用結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv、牛分枝桿菌標準株AF2122/97和BCG-Pasteur標準株的DNA為陽性對照，以DRa和DRb作為引物。對臨床分離株的DNA進行PCR擴增。反應體系為2×PCR Master Mix 12.5 μL、引物(10 pmol/L) 各2 μL、模板DNA 2 μL、雙蒸水8.5 μL，總體積25 μL。反應程序為96 ℃預變性3 min，96 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s 30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

1.6.2 PCR 產(chǎn)物的雜交與檢測 將25 μL PCR產(chǎn)物加入到175 μL 2×SSPE/0.1% SDS中，100 ℃ 水浴10 min，取出立即放入冰上。用250 mL的2×SSPE/0.1% SDS在60 ℃洗雜交膜5 min，將雜交膜放入miniblotter , 并使狹縫和寡核苷酸的線型模型相垂直。將稀釋的PCR產(chǎn)物填入狹縫，并用防水膠帶將miniblotter密封，放置于60 ℃水浴鍋的水平表面雜交60 min。洗膜并晾干放入保鮮袋中冷卻，加入10 μL親核素-過氧化物酶連接液42 ℃孵育60 min。洗膜后加入ECL液并曝光10 min、顯影5 min，定影5 min，清洗膠片。

2 結(jié) 果

2.1 疫區(qū)和非疫區(qū)結(jié)核陽性牛的剖檢結(jié)果 地區(qū)1的3個歷史結(jié)核陽性牛場的共計23頭陽性牛；其中群1剖殺9頭，有6頭有結(jié)核病變；群2剖殺11頭，7頭發(fā)現(xiàn)結(jié)核病變，群3剖殺3頭，1頭發(fā)現(xiàn)結(jié)核病變；采集結(jié)核病變或淋巴結(jié)至實驗室進行細菌分離。其中部分病變見圖1。地區(qū)2牛場檢出的陽性牛共計16份，剖殺后未發(fā)現(xiàn)病變，采集淋巴結(jié)至實驗室進行細菌分離。

A: Tubercle on lung of PPD positive cattle; B: Pearl-like tubercles on chest wall of PPD positive cattle.

圖1 PPD陽性牛解剖后發(fā)現(xiàn)的結(jié)核病變

Fig.1 Tubercles formed in the chest of the skin test reactor

2.2 細菌分離結(jié)果 將結(jié)節(jié)內(nèi)的干酪樣壞死取出，或者將淋巴結(jié)勻漿后經(jīng)酸處理，接種于Middle brook 7H11培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)6周，培養(yǎng)陽性者可見有不透明的顆粒狀菌落生長，表面皺褶粗糙，呈乳白色結(jié)節(jié)狀，陰性則無菌生長。結(jié)果地區(qū)1的23份病料中，14份病變組織中有9份分離到可疑菌，9份非病變淋巴結(jié)中有2份分離到可疑菌，從病料中分離到細菌的幾率為47.8%(11/23)；地區(qū)2的16份病料中，4份分離到可疑菌，從病料中分離到細菌的幾率為25%(4/16)。

2.3 分枝桿菌多重PCR鑒定結(jié)果 以滅活的分離菌株作為樣品，以牛分枝桿菌標準株作為陽性對照，以草分枝桿菌作為陰性對照進行分枝桿菌多重PCR。反應結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察。結(jié)果陽性、陰性對照均成立，牛結(jié)核疫區(qū)的臨床樣品分離菌株同牛分枝桿菌標準株一樣，引物MYCGEN-F和MYCGEN-R有1 030 bp片段擴增，引物TB1-F和TB1-R有372 bp片段擴增，而非結(jié)核疫區(qū)的陽性牛分離菌株則僅有1 030 bp片段擴增，沒有372 bp片段擴增(見圖2)。證實地區(qū)1的臨床樣品分離菌株屬于MTC群，而地區(qū)2的臨床樣品分離菌株則為非結(jié)核分枝桿菌。

1: DNA Marker; 2:MycobacteriumbovisAF2122/97; 3:Mycobacteriumphlei; 4-7: Pathogens isolated from higher prevalence area were identified asM.tuberculosis-complex (MTC); 8-11: Pathogens isolated from lower prevalence area were identified as nontuberculoaus mycobacteria (NTM).

圖2 污染牛群和非污染牛群結(jié)核陽性牛病料分離菌株的多重PCR鑒定結(jié)果

Fig.2 Multi-PCR identification of mycobacterium isolates from several areas of China

2.4 spoligotyping分型結(jié)果 應用spoligotyping分型技術(shù)對牛分枝桿菌臨床分離株、結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv、牛分枝桿菌標準株AF2122/97和BCG-Pasteur標準株進行鑒定。其中結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv、牛分枝桿菌標準株AF2122/97和BCG-Pasteur標準株的雜交圖譜與國際報道的標準一致。牛分枝桿菌臨床分離株均缺失39～43之間的雜交，符合牛分枝桿菌的特點。

Spoligotyping可將臨床分離的牛分枝桿菌分為4個基因型(見表1)。通過查詢國際牛結(jié)核分枝桿菌spoligotyping數(shù)據(jù)庫(http://www.mbovis.org/ spoligodatabase)，4個型中的2個型國外已有報道，分別為SB0140(世界范圍內(nèi)流行)[9-13]、SB1694(意大利有報道，參見數(shù)據(jù)庫)；另有2個型國際上尚無報道，我們將這2個型的數(shù)據(jù)提交數(shù)據(jù)庫，獲取其統(tǒng)一編號為SB1903和 SB1904。SB1903型菌株Spoligotyping圖譜缺失3、9、16、26、28和39-43號間隔區(qū)，SB1904型菌株Spoligotyping圖譜缺失3、4、9、16、26和39-43號間隔區(qū)，其共同特點是缺失26號間隔區(qū)(牛結(jié)核分枝桿菌均缺失3、9、16、39-43號間隔區(qū))，該特點可能是地區(qū)1流行的牛結(jié)核分枝桿菌菌株特征。

3 討 論

3.1 多重PCR和Spoligotyping在我國牛結(jié)核監(jiān)測中的應用價值 我國應用較多的牛結(jié)核病檢測方法(頸部變態(tài)反應)的特異性較低(88.8%～100%)，國際上已被認可的γ干擾素試驗仍然具有較高的非特異性(3.4%)[14]，用這些方法監(jiān)測牛結(jié)核病會產(chǎn)生很高的非特異反應，因此必須聯(lián)合使用細菌的分離與鑒定方法(特異性100%)才能提高監(jiān)測的準確性。但由于細菌分離鑒定過于繁瑣，常規(guī)的生化試驗如噻吩-2羧酸肼培養(yǎng)基生長試驗、硝酸還原試驗和煙酸試驗等方法復雜，需時較長，且具有生物風險，在我國牛結(jié)核監(jiān)測的實踐中很少有應用。國際上病原鑒定中廣泛應用的多重PCR方法和spoligotyping方法在我國的應用極少，本實驗嘗試聯(lián)合應用這兩種方法鑒定牛結(jié)核分枝桿菌，簡便快速且能進行分子流行病學分析，促進我國牛結(jié)核病監(jiān)測的范圍和準確性提升。

3.2 流行率不同地區(qū)的分離菌株的不同 地區(qū)1(流行率較高地區(qū))一共23頭牛，撲殺后有14頭有病變，共有11頭牛分離出可疑菌，經(jīng)多重PCR鑒定均為牛結(jié)核分枝桿菌；而地區(qū)2(流行率較低地區(qū))撲殺16頭牛，均沒有發(fā)現(xiàn)病變，細菌分離僅有4份病料分離出非特異性分枝桿菌。本實驗在牛結(jié)核流行率較高的地區(qū)，變態(tài)反應陽性牛撲殺后發(fā)現(xiàn)病變的幾率(60.9%)，以及從病料中分離到可疑菌的幾率(47.8%)，高于流行率較低地區(qū)(分別為0%和25%)。這也從側(cè)面證實，在牛結(jié)核清凈地區(qū)的檢疫過程中，會產(chǎn)生較高的假陽性或者是非特異性分枝桿菌感染。這與我們前期的試驗結(jié)果一致且與理論相符，即在流行率較低的地區(qū)進行監(jiān)測，檢測出來的陽性有很大一部分為非特異性反應，按照國標方法撲殺后必須要進行細菌分離與鑒定等工作以增加監(jiān)測的準確性。

3.3 spoligotyping的應用價值 Spoligotyping在我國的應用較少，本次調(diào)查，發(fā)現(xiàn)地區(qū)1流行的主要菌型為SB1903。但其在獨特菌型在地區(qū)1優(yōu)勢流行時，試驗涉及的3個牛場，均分離出了SB0140型菌，證實這株國際上廣為流行的菌株，也分布于該地區(qū)。證實該地區(qū)的菌株分布呈現(xiàn)出“獨特菌型地域內(nèi)相互傳播為主、輸入性感染為輔”的特征。隨著國內(nèi)牛結(jié)核分枝桿菌分離菌株的增多，不同地區(qū)將呈現(xiàn)出其當?shù)氐莫毺匦途攴植肌Ｒ虼?，根?jù)不同地區(qū)不同牛分離菌株的spoligotyping分析結(jié)果，就可以追溯傳染源，并從分子水平上展開預警分析。

3.4 SB0140型牛分枝桿菌的公共衛(wèi)生意義 SB0140型牛分枝桿菌廣泛分布在英國、澳大利亞、新西蘭、加拿大等世界范圍內(nèi)，而且在這些國家的分離菌株中占有很大比例[9]。如Joanne McLernon[10]等對愛爾蘭的386株細菌進行spoligotyping分型，結(jié)果SB0140型約占50%；[11]等對來自于阿根廷、巴西、智利、墨西哥和委內(nèi)瑞拉的1 684株牛結(jié)核分枝桿菌進行spoligotyping分型，結(jié)果SB0140所占比例最大，為24.6%。更值得關(guān)注的是，SB0140 具有重要的公共衛(wèi)生意義。Olabisi Ojo[12]等報道，1998-2006年501位愛爾蘭人患者，有15位(3%)為人感染牛結(jié)核分枝桿菌， 分離的11株細菌中3株(27%)為SB0140型。Timothy C. Rodwell[13]等對美國的106例人感染牛結(jié)核分枝桿菌進行調(diào)查，91%的感染人的牛結(jié)核分枝桿菌spoligotyping分型結(jié)果與感染墨西哥牛的分枝桿菌分型結(jié)果一致，證實加州南部的牛結(jié)核分枝桿菌感染人病例與墨西哥牛相關(guān)，而這106人中有39人(36.8%)的牛結(jié)核分枝桿菌分型結(jié)果為SB0140型。本次在我國也發(fā)現(xiàn)了SB0140型在牛群中的感染，但至于該型菌是否存在于我國人的感染病例中，尚需進一步研究。SB0140型牛結(jié)核分枝桿菌的分離與鑒定，很顯然具有重要的公共衛(wèi)生意義。

[1]Wilton S, Cousins D. Detection and identification of multiple mycobacterial pathogens by DNA amplification in single tube[J]. PCR Methods Appl, 1992, 1(4): 269-273. DOI: 10.1101/gr.1.4.269

[2]Awah-Ndukum J, Kudi AC, Bradley G, et al. Molecular genotyping ofMycobacteriumbovisisolated from cattle tissues in the North West Region of Cameroon[J]. Trop Anim Health Prod, 2013, 45(3): 829-836. DOI: 10.1007/s11250-012-0295-x

[3]Mekibeb A, Fulasa TT, Firdessa R, et al. Prevalence study on bovine tuberculosis and molecular characterization of its causative agents in cattle slaughtered at Addis Ababa municipal abattoir, Central Ethiopia[J]. Trop Anim Health Prod, 2013, 45(3): 763-769. DOI: 10.1007/s11250-012-0287-x

[4]Adesokan HK, Jenkins AO, van Soolingen D, et al.Mycobacteriumbovisinfection in livestock workers in Ibadan, Nigeria: evidence of occupational exposure[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2012, 16(10): 1388-1392. DOI: 10.5588/ijtld.12.0109

[5]Rodriguez-Campos S, Gonzalez S, de Juan L, et al. A database for animal tuberculosis (mycoDB.es) within the context of the Spanish national programme for eradication of bovine tuberculosis[J]. Infect Genet Evol, 2012, 12(4): 877-882. DOI: 10.1016/j.meegid.2011.10.008

[6]Chambers MA, Lyashchenko KP, Greenwald R, et al. Evaluation of a rapid serological test for the determination ofMycobacteriumbovisinfection in badgers (Meles meles) found dead[J]. Clin Vaccine Immunol, 2010, 17(3): 408-411. DOI: 10.1128/CVI.00424-09

[7]Zhang XY, Hu XD, Yang JW. Application of interferon--Y testing and the comparative cervical skin test in herds infected withMycobacteriumbovis[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(1): 53-56. (in Chinese) 張喜悅, 呼西旦, 楊經(jīng)緯, 等. 干擾素試驗及比較皮試在結(jié)核污染牛群的應用研究[J].中國人獸共患病學報,2010, 26 (1)：53-56.

[8]Judith K, Leo S, Arend K, et al. Simultaneous detection and strain differentiation ofMycobacteriumtuberculosisfor diagnosis and epidemiology[J]. J Clin Microbiol, 1997, 35(4): 9077.

[9]Ian B. The story of bovine TB -- The attack of the clones[EB/OL].(2014-04-03)[2014-04-15]http://tacklingbovinetb.tumblr.com/post/47025052679/the-story-of-bovine-tb-the-attack-of-the-clones.

[10]McLernon J, Costello E, Flynn O, et al. Evaluation of mycobacterial interspersed repetitive-unit-variable-number tandem-repeat analysis and spoligotyping for genotyping ofMycobacteriumbovisisolates and a comparison with restriction fragment length polymorphism typing[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(12): 4541-4545. DOI: 10.1128/JCM.01175-10

[11]Zum MJ, Arriaga C, Barandiaran S, et al. Understanding the relationship betweenMycobacteriumbovisspoligotypes from cattle in Latin American countries[J]. Res Vet Sci, 2013, 94(1): 9-21. DOI: 10.1016/j.rvsc.2012.07.012

[12]Ojo O, Sheehan S, Corcoran GD, et al.Mycobacteriumbovisstrains causing smear-positive human tuberculosis, Southwest Ireland[J]. Emerg Infect Dis, 2008, 14(12): 1931-1934. DOI: 10.3201/eid1412.071135

[13]Rodwel TC, Kapasi AJ, Moore M, et al. Tracing the origins ofMycobacteriumbovistuberculosis in humans in the USA to cattle in Mexico using spoligotyping[J]. Int J Infect Dis, 2010, 14: 129-135. DOI: 10.1016/j.ijid.2009.11.037

[14]Veterinary Laboratory Agency. Specificity Trial of the BOVIGAM IFN-Gamma Test in GB Cattle[EB/OL]. (2013-03-01)[2014-04-05]http://archive.defra.gov.uk/foodfarm/farmanimal/diseases/atoz/tb/documents/gifn_specificityreport.pdf.

Application of multiple-PCR and spoligotyping for investigation ofbovine tuberculosis from different epidemic areas

ZHANG Xi-yue1,FAN Cheng-xiang2,DU Peng-fei1,CAO Rui1,HU Xi-dan3,WANG Shu-juan1,FAN Wei-xing1

(1. China Animal Health & Epidemiology Center, Qingdao 266032, China;2.Rizhao Animal Disease Control Center, Rizhao 276800, China；3.Veterinary Research Institute，Animal Science Academy of Xinjiang，Wulumuqi 830000，China)

To characterize theMycobacteriumbovisin the different epidemic areas, we combined the multiple-PCR and spoligotyping to investigate the bacteria isolated in the bovine tuberculosis surveillance. The bovine PPD skin tests were performed in lower-prevalence and higher-prevalence areas in China. The positives were slaughtered and their carcasses were examined for the tubercles. Isolated pathogens were identified by using multiple-PCR and then genotyped by using spoligotyping. No lesion was found from the carcasses of 16 positives in the lower-prevalence area. The 4 strainsMycobacteriawere isolated from the lymph nodes collected from the positives and then identified as nontuberculosisMycobacteriaby using multiple-PCR. The 23 positives were slaughtered and examined in the higher-prevalence area. The lesions were found from 14 cattle and then the pathogens were isolated from the 11 of them. The bacteria were identified asMycobacteriumbovisby using multiple-PCR. Totally, 4 spoligotypes were classified and 2 of them were new types. Number SB1903 and SB1904 were given after the patterns were submitted to the bovine tuberculosis spoligotyping database. It was revealed that the character of "domestic typing SB1903" was predominant but the world-spread typing SB0140 still be insistent in the area. It suggests that the scientists should pay attention on the transmission of the typing SB0140 to human beings as the typing has been found from cattle in China.

bovine tuberculosis; multiple-PCR; spoligotyping

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.010

范偉興，Email:fwxsjl@126.com

1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,青島 266032； 2.山東日照動物疫病預防控制中心，日照 276800； 3.新疆牧科院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830000

R378

A

1002-2694(2015)04-0340-05

2014-02-14；

2014-10-20

科技基礎(chǔ)性工作專項(2012FY111000)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(奶牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目(CARS37)