基因工程在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死中的應(yīng)用

基因工程在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死中的應(yīng)用

王曼李樹仁

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省人民醫(yī)院，河北石家莊050051)

關(guān)鍵詞〔〕基因工程；充質(zhì)干細(xì)胞；心肌梗死

中圖分類號(hào)〔〕R54〔

通訊作者：李樹仁(1964-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病介入及心力衰竭研究。

第一作者：王曼(1987-)，女，在讀碩士，主要從事心血管病學(xué)研究。

隨著溶栓和急診冠脈介入的廣泛開展，急性心肌梗死(AMI)的死亡率明顯降低。但是心肌梗死后心室重構(gòu)以及缺血性心肌病的發(fā)生嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后。要使心肌細(xì)胞再生乃至衰竭的心臟恢復(fù)功能仍是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。研究提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可參與受損心肌的重建，可以提高左室射血分?jǐn)?shù)，降低左心室收縮末期和舒張末期容積、減少梗死面積并改善左室重構(gòu)〔1〕。但是BMSCs在梗死心肌中的長(zhǎng)期存活仍未能解決。心肌梗死后微環(huán)境的改變限制了干細(xì)胞的修復(fù)能力，人們正在利用BMSCs基因工程的方法來解決這一問題。基因工程是將外源性基因?qū)肽康募?xì)胞中，使得該細(xì)胞具備過表達(dá)或靜默表達(dá)某種基因的能力。本文闡述基因工程在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死中的應(yīng)用。

1基因?qū)胂到y(tǒng)

基因?qū)胂到y(tǒng)是基因治療的核心技術(shù)，有物理、化學(xué)、生物三類方法，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)，按基因表達(dá)時(shí)限可分為瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和永久表達(dá)系統(tǒng)。應(yīng)根據(jù)需要借助不同的方法。物理法包括電穿孔法、基因槍粒子轟擊法和顯微注射法等。物理法雖操作簡(jiǎn)便，但效率低?；瘜W(xué)法包括磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子多聚物(多聚賴氨酸，聚乙烯亞胺，樹突狀聚合物)、殼聚糖載體聚合物和無機(jī)納米粒子載體等。生物法主要指病毒載體，包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體等。

2MSCs治療心肌梗死的機(jī)制

MSCs存在于多種成體組織內(nèi)，骨髓是MSCs的主要來源。MSCs可分化為包括骨、軟骨、肌肉、脂肪、肝臟、腎臟、內(nèi)皮、神經(jīng)元、心肌等在內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞譜系。自體和異體的MSC都被證明能夠參與組織再生。MSCs移植改善梗死后心臟功能的機(jī)制主要包括以下兩點(diǎn)：①M(fèi)SCs可分泌多種因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖與血管再生建立側(cè)支循環(huán)，抑制梗死區(qū)擴(kuò)大與心肌細(xì)胞凋亡〔2〕；②MSCs能表達(dá)肌鈣蛋白-1和connexin-43分子等心臟特異性標(biāo)記物，能夠分化成為心肌細(xì)胞，并與宿主心肌細(xì)胞形成耦聯(lián)，參與宿主心臟的同步收縮。目前更傾向于MSCs的分泌功能。MSCs通過旁分泌和自分泌途徑分泌大量的功能性細(xì)胞因子，包含有局部的免疫抑制、對(duì)纖維化過程的抑制以及對(duì)血管生成的支持作用等。

3修飾BMSCs的基因

BMSCs易于被外源基因轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行基因修飾可以使BMSCs具有更好的促血管再生、抗細(xì)胞凋亡、抗炎、修復(fù)心功能的作用。

3.1細(xì)胞因子相關(guān)基因單純細(xì)胞移植有一定的局限性，為此將細(xì)胞移植與基因治療聯(lián)合起來。關(guān)于細(xì)胞因子的基因研究最多，通過細(xì)胞因子修飾的BMSCs可抬高細(xì)胞移植后的存活，改善細(xì)胞生存環(huán)境，在心肌梗死后心功能改善方面有廣泛的應(yīng)用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF) 是目前發(fā)現(xiàn)的促血管生成作用的因子之一，將低氧環(huán)境誘導(dǎo)下經(jīng)VEGF修飾的MSCs進(jìn)行移植，與未修飾組比，VEGF表達(dá)進(jìn)一步增加，促進(jìn)血管增生，明顯減小大鼠心肌梗死面積，增強(qiáng)BMSCs對(duì)梗死微環(huán)境的耐受，利于移植細(xì)胞存活，促進(jìn)組織修復(fù)，但對(duì)心功能改善不明顯〔3〕。血管生長(zhǎng)素-1(Ang-1)也是一個(gè)促進(jìn)血管生成的因子，用腺病毒將Ang-1基因?qū)隑MSCs，將替代治療和血管生成結(jié)合起來，促進(jìn)血管生長(zhǎng)，延緩心肌重塑，提高心功能〔4〕。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)及誘發(fā)血管生成的多功能細(xì)胞因子，也是一種特異的促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有抑制細(xì)胞凋亡與組織重構(gòu)、修復(fù)內(nèi)皮損傷促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂作用。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)移植前的BMSCs進(jìn)行預(yù)處理，使BMSCs過表達(dá)HGF，使移植的BMSCs在心肌梗死區(qū)HGF表達(dá)增加，改善局部微環(huán)境，減輕炎癥反應(yīng)，利于移植細(xì)胞存活，其機(jī)制與促進(jìn)旁分泌機(jī)制有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)心肌梗死后2 w心肌注射BMSCs最有利〔5〕。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF或FGF)-2是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的基本成員，具有促細(xì)胞分裂，促進(jìn)血管形成，參與損傷修復(fù)等多種生物學(xué)活性，對(duì)BMSCs進(jìn)行該基因修飾可激活細(xì)胞分裂素(絲裂原)活化蛋白激酶及蛋白激酶C，調(diào)高BCL-2的表達(dá)，提高BMSCs的移植存活率，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞，促進(jìn)梗死區(qū)毛細(xì)血管新生，減小心肌梗死面積改善心功能〔6〕。

胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1在細(xì)胞的分化、增殖、個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的促進(jìn)作用。有學(xué)者將IGF-1導(dǎo)入BMSC中使BMSCs更耐受缺氧環(huán)境，移植成活率高，促進(jìn)毛細(xì)血管生長(zhǎng)，減小梗死面積，抑制心肌增厚，激活PI3K/Akt信號(hào)途徑，減少細(xì)胞凋亡，通過基質(zhì)衍生因子1α/趨化因子受體4軸(SDF-1α/CXCR4)促進(jìn)細(xì)胞向梗死部位遷移〔7〕。也有學(xué)者采用逆轉(zhuǎn)錄病毒使BMSCs過表達(dá)CXCR4的方法，經(jīng)靜脈途徑注射入心肌梗死大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMSCs的定向遷移明顯增強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)胞成活率，改善了左室重構(gòu)，取得很好的療效〔8〕。

轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞內(nèi)一類重要的調(diào)控蛋白，其特異地結(jié)合基因組DNA的順式作用元件以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過程，GATA轉(zhuǎn)錄因子基因家族具有與特定DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域，結(jié)扎左前降支造成心肌梗死后立即在梗死邊緣區(qū)注射GATA-4過表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子(IGF-1，VEGF)可促進(jìn)血管生成和細(xì)胞存活，使細(xì)胞發(fā)揮更大的作用〔9〕。

炎癥在冠心病發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用，白介素18(IL-18)是一個(gè)重要的多效能炎癥細(xì)胞因子，IL-18結(jié)合蛋白(IL18BP)可拮抗IL-18的活性，過表達(dá)IL-18BP 的BMSCs可以促進(jìn)VEGF分泌，減少細(xì)胞死亡，減小梗死面積，提高心功能〔10〕。趨化因子在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，它們結(jié)合到趨化因子受體而起作用，研究發(fā)現(xiàn)通過對(duì)BMSCs進(jìn)行趨化因子受體CCR修飾，心肌內(nèi)注射可以減少心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)BMSCs向缺血區(qū)遷移，增加毛細(xì)血管密度，保護(hù)心功能〔11〕。腫瘤壞死因子(TNF)是一種真正的多效因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，心肌梗死時(shí)有炎癥介導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生，用重組腺相關(guān)病毒(rAAV)使BMSCs 過表達(dá)TNF受體(TNFR)發(fā)現(xiàn)可以提高心梗后左室功能，改善BMSCs生存，提高TNF-α在心肌及血清中的表達(dá)水平，提高TNFR蛋白水平在心肌梗死區(qū)的表達(dá)，通過提高細(xì)胞存活率進(jìn)而提高細(xì)胞移植的效率〔12〕。細(xì)胞因子種類繁多，參與人體多種重要的生理功能，還有許多因子尚處于體外研究階段，如何探討更合適的基因進(jìn)行修飾，進(jìn)一步改善梗死心肌局部的血液循環(huán)、提高移植后干細(xì)胞的存活，更好地改善心肌梗死及梗死后心功能是我們的研究方向。

3.2信號(hào)通路相關(guān)基因PI3K-Akt信號(hào)途徑是一條經(jīng)典的信號(hào)途徑，在細(xì)胞存活和抗凋亡中起重要作用。Akt又稱PKB，即蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，居PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路核心部位，Akt能磷酸化一系列蛋白成分，通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡，用腺病毒攜帶Akt修飾BMSCs可強(qiáng)化其修復(fù)豬心肌梗死后治療效果〔13〕。

Wnt信號(hào)通路在復(fù)制和分化中起重要作用，Wnt是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。Wnt11通過激活Wnt11非經(jīng)典信號(hào)通路，在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用，Wnt11過表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞移植能有效改善心功能〔14〕。糖原合酶激酶(GSK)3是生物體內(nèi)許多信號(hào)通路的參與者，是Wnt信號(hào)通路的上游作用物，過表達(dá)糖原合成酶激酶(GSK)-3β的間充質(zhì)干細(xì)胞通過促進(jìn)干細(xì)胞生存，促進(jìn)干細(xì)胞向心肌分化，動(dòng)員心臟祖細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)毛細(xì)血管密度顯著減小了心肌梗死面積，改善心肌梗死后心功能。研究還發(fā)現(xiàn)促生存作用及毛細(xì)血管密度增加主要是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A起作用，但去除它后仍可有心肌梗死面積減小及心功能改善。由此可見GSK-3β修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞是通過多種機(jī)制協(xié)同起作用提高間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效率〔15〕。

分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(Sfrp 2)是介導(dǎo)心肌存活和修復(fù)的重要干細(xì)胞分泌型蛋白，可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合wnt蛋白，從而抑制Wnt信號(hào)，其過量表達(dá)可以促使BMSCs體外增殖，增加毛細(xì)血管密度，縮小梗死面積，保護(hù)心功能，說明其自身具備保護(hù)缺氧受損的心肌細(xì)胞的功能〔16〕。

Notch 信號(hào)是細(xì)胞與細(xì)胞之間直接作用的主要信號(hào)通路之一，在細(xì)胞分化、血管生成以及機(jī)體發(fā)育過程中發(fā)揮極其重要的作用，在心血管系統(tǒng)它的影響包括血管重構(gòu)、血管穩(wěn)定性以及心臟發(fā)育，Notch1是Notch的受體，它修飾BMSCs后能幫助BNSCs更好地進(jìn)行心肌梗死后心肌修復(fù)及心功能的恢復(fù)〔17〕。

3.3其他基因經(jīng)基因修飾后，BMSCs相應(yīng)的蛋白表達(dá)增加，干細(xì)胞的適應(yīng)性增強(qiáng)，其修復(fù)能力加強(qiáng)。HSP20屬于熱休克蛋白(HSP)家族，是一個(gè)抗凋亡及抗氧化有關(guān)的酶，在缺血缺氧環(huán)境中對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，心肌梗死部位移植經(jīng)HSP20修飾的BMSCs能激活A(yù)kt，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)分泌VEGF，F(xiàn)GF-2和 IGF-1，進(jìn)而促進(jìn)血管密度，有益于治療心肌梗死〔18〕。

血紅素氧合酶(HO)是血紅素代謝途徑的起始酶和限速酶，HO-1又稱HSP32，是一種呈誘導(dǎo)性表達(dá)的酶，多種有害刺激均可誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，，是細(xì)胞應(yīng)激時(shí)重要的保護(hù)機(jī)制之一。HO-1修飾BMSCs 對(duì)移植到心肌梗死部位通過PI3K-Akt信號(hào)途徑促進(jìn)VEGF分泌，抑制干細(xì)胞凋亡，能增強(qiáng)其在缺氧及惡劣環(huán)境中的生存能力，最終改善了心肌梗死的預(yù)后〔19〕。

Bcl-2是具有明顯抑制凋亡作用的基因，用陽離子脂質(zhì)體法抗凋亡基因修飾BMSCs后，延長(zhǎng)BMSCs 存活，有助于提高其移植治療心肌梗死的效果〔20〕。存活素(survivin) 是IAP家族中分子量最小成員，在胚胎和各類腫瘤中均表達(dá)，具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和抗凋亡功能，用慢病毒載體使BMSCs高表達(dá)survivin，心肌梗死后移植與對(duì)照組比VEGF分泌及毛細(xì)血管密度增加，心肌梗死面積小，抑制膠原沉積，改善遠(yuǎn)期預(yù)后〔21〕。E1A激活基因阻遏子(CREG) 是一種分泌型糖蛋白，CREG過表達(dá)明顯抑制BMSCs凋亡，主要是通過抑制線粒體凋亡途徑，使caspase-3減少，促進(jìn)Akt磷酸化，減少p53表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)VEGF分泌，移植后可降低心肌梗死后心肌損害〔22〕。

3.4基因聯(lián)合單基因修飾BMSCs雖取得較好的療效。但由于心肌梗死心肌修復(fù)涉及多種機(jī)制，單種基因很難滿足治療需求，許多學(xué)者開始多基因修飾BMSCs的探索。如將Ang-1和Akt聯(lián)合修飾BMSCs移植治療心肌梗死，以滿足血管生成和抗凋亡需求，達(dá)到了預(yù)期的結(jié)果，大鼠心功能得到了進(jìn)一步的改善并顯示出長(zhǎng)期的治療效果〔23〕。同樣HGF及VEGF聯(lián)合，放大BMSCs的內(nèi)分泌效應(yīng)，更好地改善心臟狀況〔24〕。采用Csx/Nkx2.5 and GATA-4兩種轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合修飾，提高BMSCs向心肌細(xì)胞分化效率，增強(qiáng)毛細(xì)血管密度，改善心肌梗死后心功能〔25〕。所有結(jié)果均表明，多基因聯(lián)合可起到一定的治療效果疊加。但目前還沒有公認(rèn)的最佳基因改造方案，尋找更合適的基因聯(lián)合修飾BMSCs為提供了又一研究方向。

心肌梗死后最終引起心功能不全是患者死亡的主要原因。現(xiàn)行的治療方法不能從根本上修復(fù)壞死的心肌組織。MSCs是人們研究最深入的干細(xì)胞種類之一，特別是在修復(fù)病患及損傷組織、器官方面。自體和異體的MSCs都被證明能夠參與組織再生。這類細(xì)胞易于采集、分離和體外擴(kuò)增，避免了許多遺傳和倫理的問題，除具有多向分化潛能，還具有抑制同種異體免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用。該細(xì)胞易于接受基因修飾，不僅可作為組織工程的種子細(xì)胞，而且也可作為基因治療的良好工具。非病毒載體與病毒載體相比較無傳染性，沒有載體容量限制，材料來源廣泛，化學(xué)結(jié)構(gòu)可控制，易于大量制備，在表達(dá)質(zhì)粒、反義寡核苷酸或反義表達(dá)質(zhì)粒真核細(xì)胞的靶向轉(zhuǎn)移中有著病毒載體不可替代的作用。然而，非病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，目的基因只能實(shí)現(xiàn)瞬間表達(dá)，其運(yùn)送系統(tǒng)的顆粒較大，容易引發(fā)免疫反應(yīng)和被機(jī)體所清除。目前對(duì)BMSCs的基因修飾研究主要為單一基因的動(dòng)物試驗(yàn)階段，然而體內(nèi)微環(huán)境是多種因子共同作用的結(jié)果，今后研究的方向是如何安全地將多種基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)?；蚬こ淘贛SCs治療心肌梗死中有廣泛的應(yīng)用前景。隨著研究的深入，會(huì)有更多的基因靶點(diǎn)和基因工程技術(shù)應(yīng)用于心肌梗死的干細(xì)胞治療領(lǐng)域。

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〔2013-06-16修回〕

(編輯安冉冉)