細(xì)菌莢膜多糖的研究進(jìn)展

李天一，王英鋒，張 玫

細(xì)菌莢膜多糖的研究進(jìn)展

李天一1,2，王英鋒1，張 玫2,3

本文對(duì)莢膜多糖進(jìn)行了概述，綜述近年來細(xì)菌莢膜多糖相關(guān)的研究進(jìn)展，并從理化性質(zhì)與生物學(xué)功能的角度出發(fā)，總結(jié)了近年來莢膜多糖提取、分離、純化等方面的研究，重點(diǎn)介紹了與莢膜多糖結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究進(jìn)展。本文為進(jìn)一步研究細(xì)菌致病性、分型機(jī)制提供必要的方法，為疫苗的設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)加強(qiáng)致病菌的防控具有重要意義。

莢膜多糖；提?。环蛛x；純化；理化性質(zhì)

莢膜多糖是細(xì)菌細(xì)胞壁外層的膠狀物質(zhì)，具有抗原性和特異性，可用于細(xì)菌鑒定[1]，是細(xì)菌重要的毒力因子[2]。莢膜多糖是一種分子量大、極性大的物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)解析要比單糖和寡糖更加復(fù)雜。很多細(xì)菌的表面都具有莢膜，例如肺炎鏈球菌，B群鏈球菌，豬鏈球菌等[3]。有報(bào)道認(rèn)為莢膜的存在與細(xì)菌耐藥性呈正相關(guān)，一旦感染則發(fā)病率和死亡率都很高[4]。為進(jìn)一步了解細(xì)菌的致病機(jī)制，設(shè)計(jì)及研制更加有效的疫苗，研究細(xì)菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)日益引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。本文主要針對(duì)莢膜多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)解析的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)菌莢膜多糖的概述

莢膜是某些細(xì)菌表面的特殊結(jié)構(gòu)，是一層位于細(xì)胞壁表面的松散的粘液物質(zhì)，莢膜的成分因菌種不同而異，主要是由糖與糖醛酸組成的聚合物，如豬鏈球菌的莢膜多糖。也有部分細(xì)菌的莢膜多糖含有多肽及脂質(zhì)，如炭疽桿菌[5]。細(xì)菌莢膜具有抗原性，可用于細(xì)菌的鑒定[1]。細(xì)菌鑒定的前提是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行科學(xué)的分型，目前對(duì)于細(xì)菌分型主要有兩大分型系統(tǒng)，即血清型分型系統(tǒng)和基因分型系統(tǒng)。血清型分型系統(tǒng)主要依據(jù)莢膜多糖和脂多糖不同的抗原性對(duì)細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。基因分型系統(tǒng)主要依據(jù)毒力因子，與免疫相關(guān)的因子等因素為主，將具有相同致病機(jī)制的細(xì)菌分為一類[6]。莢膜多糖作為細(xì)菌的毒力因子，其與細(xì)菌的血清型有密切關(guān)系。不同血清型的細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生不同的毒力因子，對(duì)宿主造成不同的影響，而不同的毒力因子是通過不同的基因進(jìn)行編碼的，因此，毒力因子與血清型之間存在著密不可分的關(guān)系。由于莢膜位于細(xì)菌最外部，是細(xì)菌感染宿主時(shí)最先接觸的物質(zhì)，所以多為細(xì)菌主要的毒力因子[2]。莢膜多糖作為毒力因子，在細(xì)菌抵抗免疫系統(tǒng)中吞噬細(xì)胞吞噬過程中擔(dān)任著重要角色[7]。以豬鏈球菌為例，豬鏈球菌2型的莢膜多糖主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N2-乙酰半乳糖胺和唾液酸這5種單糖組成，其糖蛋白是由231個(gè)氨基酸殘基組成，由位于基因組3 846～4 541 bp之間的一段長(zhǎng)696 bp基因序列編碼[8]。莢膜多糖的存在降低了豬鏈球菌被吞噬細(xì)胞吞噬的程度，而無莢膜的突變株容易被吞噬。莢膜的厚度越大越有利于抵抗豬多形核白細(xì)胞的吞噬[9]。實(shí)驗(yàn)表明，由于莢膜多糖的存在，使豬鏈球菌2型能夠抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬，并且使被吞噬的細(xì)菌可以在巨噬細(xì)胞中存活至少3 h[10]。Gottschalk和Segura在2000年提出“特洛伊木馬”模型，即豬鏈球菌黏附在免疫細(xì)胞上，特別是單核細(xì)胞，隨著單核細(xì)胞通過血腦屏障[11]，這就是莢膜多糖發(fā)揮抗吞噬能力的機(jī)制。莢膜多糖作為毒力因子，致病機(jī)理就在于抗吞噬能力，黏附能力和維持細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)部存活的能力。

2 細(xì)菌莢膜多糖的理化特征

從化學(xué)組成上來說，大部分的細(xì)菌莢膜多糖是以2種或以上的單糖(如D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖等)及其他物質(zhì)(如磷酸根，唾液酸等)為重復(fù)單元，聚合形成的大分子物質(zhì)。大多數(shù)細(xì)菌的莢膜多糖為酸性黏多糖，屬于雜多糖類。有文獻(xiàn)報(bào)道b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸鹽[12]。還有一部分細(xì)菌莢膜多糖是有乙?；亩嗵墙M成[13]。A群腦膜炎奈瑟菌莢膜多糖，其主要結(jié)構(gòu)是多聚磷酸乙酰氨基吡喃型甘露糖，乙?；Y(jié)構(gòu)是該菌最重要的免疫原性表位[14]。

從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來說，莢膜多糖通過各種作用力，如分子間氫鍵或者其他非共價(jià)鍵，與細(xì)胞壁之間形成了比較強(qiáng)韌的外膜，黏附在細(xì)菌的表面。莢膜多糖是由重復(fù)的單糖通過糖苷鍵連接形成聚合物，由于單糖種類不同，連接方式不同，多糖結(jié)構(gòu)中是否存在支鏈，有機(jī)或者無機(jī)分子等因素導(dǎo)致莢膜結(jié)構(gòu)解析存在巨大的復(fù)雜性[15]。正是因?yàn)槠浞肿咏M成復(fù)雜性和構(gòu)型多樣性，科研人員以此作為細(xì)菌血清學(xué)分型的基礎(chǔ)，即根據(jù)細(xì)菌莢膜多糖的抗原性的異同對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型。肺炎雙球菌，根據(jù)其莢膜多糖的抗原性，迄今為止，可分為96種血清型，而其中有30多種血清型有致病性。大腸桿菌，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過90種血清型，其中有少數(shù)是具有侵襲感染能力的，而在可以引發(fā)新生兒腦膜炎的這類大腸桿菌具有相同的多糖鏈，只是多糖的不同修飾導(dǎo)致它們之間存在差異[16]。

3 細(xì)菌莢膜多糖的功能

莢膜由于其具有耐干燥，黏附，儲(chǔ)存養(yǎng)分等功能，成為致病性細(xì)菌的一種重要的毒力因子。細(xì)菌莢膜中水分占到95%以上，含有大量水分的莢膜在細(xì)菌的表面，可以避免細(xì)菌脫水死亡，這就使得有莢膜的細(xì)菌更容易在宿主間相互傳播[17]。莢膜多糖還能夠促進(jìn)細(xì)菌與細(xì)菌或者細(xì)胞之間的黏附，從而促進(jìn)生物膜的形成和在不同的生存環(huán)境中的定植[18]。例如，能夠引起齲齒的唾液鏈球菌和變異鏈球菌會(huì)分泌己糖基轉(zhuǎn)移酶，使口腔中的蔗糖轉(zhuǎn)變成果聚糖，這種果聚糖能使細(xì)菌牢牢黏附于牙齒表面，而細(xì)菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生的乳酸在局部積累后，會(huì)使牙齒表面的琺瑯質(zhì)層發(fā)生腐蝕而引起齲齒[19]。某些細(xì)菌的莢膜還是儲(chǔ)存養(yǎng)分的場(chǎng)所，以備細(xì)菌處于營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)可以利用，如黃色桿菌的莢膜。而豬鏈球菌的莢膜除上述作用外，最重要的作用是抗吞噬作用，由于它的存在大大降低了豬鏈球菌被吞噬的程度，而莢膜厚度的增加也會(huì)使豬鏈球菌抗白細(xì)胞殺傷能力[20]。

4 細(xì)菌莢膜多糖的分離純化

莢膜多糖的提取分離一般分以下幾個(gè)步驟：去菌體，粗提總糖，去除蛋白質(zhì)和核酸，分級(jí)分離[21-22]。

4.1 去除菌體和總糖粗提取 在提取多糖之前，首先需要去除菌體。目前，去除菌體提取總糖的方法主要有離心法，酶解法，巴氏滅菌法[23]等。離心法，將滅菌過的培養(yǎng)液通過離心機(jī)離心，然后收集上層清液的方法除去菌體。但是該方法去除菌體的效果差，離心的效果依賴于高效能的離心設(shè)備。對(duì)于含有唾液酸等不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的莢膜多糖，最常用的方法是酶解法，即細(xì)菌培養(yǎng)液離心得到菌體，然后將菌體分散在緩沖液中，再加入不同的酶，酶解菌體，最后再次離心使菌體碎片和莢膜多糖分離，取上層清液[24]。用溶菌酶來裂解菌體，從而可以避免破壞莢膜多糖。酶解法的成本較高，但是專一性強(qiáng)，去除菌體的效果較好。中國(guó)海洋大學(xué)的趙峽課題組通過將菌體分散在甘氨酸緩沖液中，然后加入溶菌酶裂解消化的方法去除豬鏈球菌菌體，從而得到莢膜多糖[25]。巴氏滅菌法，通過對(duì)菌液進(jìn)行加熱滅菌，隨著溫度的提高，多糖的溶解度逐步提高，有利于后續(xù)的離心。巴氏滅菌法便于操作，去除菌體效果較好，過程中要注意溫度，溫度過高會(huì)導(dǎo)致多糖分解。在2013年Gottschalk課題組發(fā)表的文章中，通過此方法，在121 ℃加熱菌液75 min來達(dá)到去除菌體的目的，從而得到14型豬鏈球菌的莢膜多糖[26]。

4.2 去除蛋白質(zhì)和核酸 由于一些細(xì)菌的莢膜多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜且穩(wěn)定性較差，所以在純化過程中要注意方法的選擇。有機(jī)溶劑多級(jí)沉淀法由于其操作簡(jiǎn)單并且對(duì)操作人員的良好性被廣泛使用[27]。有機(jī)試劑引起多糖、蛋白等物質(zhì)沉淀的原因是加入有機(jī)試劑使水溶液的介電常數(shù)降低，從而增加了具有相反電荷的基團(tuán)之間的吸引力，促使分子聚集而沉淀，此類現(xiàn)象類似鹽析。但是利用該法沉淀莢膜多糖的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致核酸和蛋白的沉淀，為避免多糖中混合核酸和蛋白，可以在溶液中加入陽離子，例如CaCl2，NaCl，利用陽離子和帶負(fù)電的基團(tuán)結(jié)合，降低多聚核苷酸鏈之間的排斥作用，從而去除核酸和蛋白，或者通過加入酶，將蛋白質(zhì)去除，得到莢膜多糖的沉淀[28]。

4.3 分級(jí)分離 根據(jù)莢膜多糖的理化性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行分級(jí)分離，莢膜多糖是一種極性很大，分子量之間存在較大差異的物質(zhì)。所以可以通過體積排阻色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，其中凝膠層析技術(shù)運(yùn)用最為成熟，且效果最佳[29]。莢膜多糖除了可以根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離純化，在其組成中有磷酸基或者乙酰基，這些基團(tuán)可以使莢膜多糖具有不同的電荷性質(zhì)和pH值，根據(jù)此類理化性質(zhì)可以采用離子交換技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離純化[30]。進(jìn)一步的純化還可以采用超濾法，這是一種用于分子分離的膜分離技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，無需添加化學(xué)試劑[31]?？梢愿鶕?jù)待分離的物質(zhì)的性質(zhì)選擇不同規(guī)格的超濾膜。

4.3.1 凝膠色譜法 凝膠色譜法是一種簡(jiǎn)單而快速的分離技術(shù)，對(duì)高分子物質(zhì)有較好的分離能力。分離的基本原理是分子篩效應(yīng)。根據(jù)凝膠的種類和性質(zhì)不同，分為交聯(lián)葡聚糖凝膠(sephadex)，瓊脂糖凝膠(sepharose)[32]，丙烯葡聚糖凝膠(sepharcryl)等。根據(jù)多糖的性質(zhì)和分子量范圍選擇適合的凝膠種類和型號(hào)。 Cristina De Castro課題組于2008年發(fā)表的文章中，采用sepharcryl S-500 HR凝膠柱成功地從Rhizobium rubi分離純化出一種新的莢膜多糖[33]。在2010年Gottschalk課題組通過乙醇沉淀法提取2型豬鏈球菌的莢膜多糖，然后通過使用sepharcryl S-400 HR凝膠裝柱，對(duì)粗多糖進(jìn)行分離純化，然后運(yùn)用GC-MS技術(shù)得到2型豬鏈球菌莢膜多糖的單糖組成，結(jié)合質(zhì)譜，核磁共振，以及相關(guān)化學(xué)反應(yīng)，確定了2型豬鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)[28]。該課題組在2013年又得到了14型豬鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)[26]。

4.3.2 離子交換色譜法 離子交換色譜的基本原理是根據(jù)物質(zhì)的酸堿性，極性的不同極性分離。運(yùn)用離子交換色譜技術(shù)分離糖類，可以有效地去除酸堿成分和無機(jī)離子，從而得到糖和糖苷[30]。但是對(duì)于帶有唾液酸的多糖樣品，不宜使用強(qiáng)陰離子交換，唾液酸會(huì)發(fā)生嚴(yán)重脫離[34]。

5 莢膜多糖的結(jié)構(gòu)解析

莢膜多糖由于極性大，分子量高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多以復(fù)合物存在等原因，增加了結(jié)構(gòu)解析的難度。分離純化度高會(huì)增大結(jié)構(gòu)解析的成功率和準(zhǔn)確性。結(jié)構(gòu)解析一般分為以下幾個(gè)步驟，單糖組成分析，分子量確定[35]，糖殘基連接位置和順序、構(gòu)型、分支點(diǎn)結(jié)構(gòu)分析[36]。

單糖組成分析方面，主要技術(shù)有高效液相色譜[37]，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[38]，離子色譜技術(shù)[39]等。由于糖類物質(zhì)沒有紫外吸收，可以通過柱前衍生化使其結(jié)合上有光學(xué)活性的基團(tuán)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)是目前最常用的衍生化試劑，該反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，衍生化效率高，適合復(fù)雜樣品的單糖組成[40]。中國(guó)海洋大學(xué)的趙峽課題組在2014年發(fā)表的文章中，使用PMP做柱前衍生化，成功得到豬鏈球菌4種血清型的單糖組成及其摩爾比例[25]。離子色譜技術(shù)在近些年逐漸被運(yùn)用在糖化學(xué)研究中，2013年Fiona L. Lin課題組通過運(yùn)用離子色譜技術(shù)，準(zhǔn)確的分析出肺炎鏈球菌33C和33D血清型的單糖組成[41]。

糖殘基連接位置和順序方面，當(dāng)前常見的分析手段有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。通過對(duì)多糖依次進(jìn)行甲基化反應(yīng)，水解反應(yīng)，還原反應(yīng)和乙?；磻?yīng)，然后運(yùn)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)糖殘基連接位置和順序進(jìn)行確定。核磁共振技術(shù)為糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析起推動(dòng)作用，通過核磁共振圖譜分析可以推測(cè)出糖類物質(zhì)中碳鏈的連接位置，構(gòu)型等信息[42]，還可以進(jìn)行樣品檢定[43]。Bent O. Petersen課題組在2013年通過核磁共振技術(shù)成功解析了肺炎鏈球菌47A血清型的結(jié)構(gòu)[44]。在2010年Gottschalk課題組運(yùn)用GC-MS技術(shù)得到2型豬鏈球菌莢膜多糖的單糖組成，結(jié)合質(zhì)譜，核磁共振，以及相關(guān)化學(xué)反應(yīng)，確定了2型豬鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)[28]。該課題組在2013年又得到了14型豬鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)[26]。莢膜多糖的結(jié)構(gòu)解析需要諸多分析技術(shù)的結(jié)合，譜圖解析工作難度仍然很大。

6 多糖合成的相關(guān)基因和途徑

莢膜多糖合成的相關(guān)基因主要包含3種，即莢膜多糖合成調(diào)節(jié)基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因和轉(zhuǎn)運(yùn)基因。以肺炎鏈球菌為例，其90個(gè)血清型的莢膜多糖合成的相關(guān)基因簇已經(jīng)被測(cè)序并分析。除去3型和37型以外，其余的血清型的莢膜多糖合成的相關(guān)基因簇均位于染色體上dexB和aliA之間的一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位，具有位于上游位置高度保守的4個(gè)合成調(diào)節(jié)基因(cpsABCD)，基因簇內(nèi)包含多種糖基轉(zhuǎn)移酶，多糖合成酶，乙?；D(zhuǎn)移酶和翻轉(zhuǎn)酶等[15]。糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)作為多糖生物合成的主要酶之一。多糖結(jié)構(gòu)的多樣性取決于催化反應(yīng)中的GT。GT催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，即催化一個(gè)糖基供體上的糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)受體上。糖基供體為糖核苷酸，而糖基受體可以是單糖、寡糖、多糖、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[45]。根據(jù)糖基供體和生成的糖苷鍵的立體構(gòu)型，GT分為保留型和反轉(zhuǎn)型[46]。由于GT的不同作用的結(jié)果，使多糖結(jié)構(gòu)從組成到構(gòu)型都存在巨大的多樣性。從基因研究角度，表明細(xì)菌多糖的生物合成途徑分為3種，wzy-依賴途徑，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體-依賴途徑和合酶-依賴途徑[47]。以生物合成分為3個(gè)步驟，起始-延伸-連接終止。以上3種合成途徑主要根據(jù)延伸步驟進(jìn)行劃分?；蛘{(diào)控酶進(jìn)行多糖的生物合成。從多糖的多樣性，到多糖的合成調(diào)控，現(xiàn)階段仍暗含著尚不明確的步驟，有待進(jìn)一步的研究。

7 展 望

莢膜多糖作為細(xì)菌的主要毒力因子，在研制疫苗方面有重要作用。肺炎鏈球菌23型多糖疫苗于1983年在美國(guó)批準(zhǔn)并開始使用，在使用的過程中問題也隨之發(fā)生，該疫苗對(duì)成年人的效果較好，但是對(duì)嬰幼兒效果不好[48]。這使人們對(duì)莢膜多糖制備的疫苗有了新的思考。細(xì)菌莢膜多糖作為主要的毒力因子，研究人員對(duì)其結(jié)構(gòu)組成，功能及基因已越來越重視[49]。高效地分離純化莢膜多糖對(duì)其結(jié)構(gòu)解析至關(guān)重要，不斷改進(jìn)原有分離技術(shù)和開發(fā)新型分離技術(shù)要齊頭并進(jìn)，從而得到純化度更高的多糖樣品，增加結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性。隨著對(duì)莢膜多糖研究的深入，進(jìn)一步解析莢膜多糖結(jié)構(gòu)以及合成基因與調(diào)節(jié)機(jī)制等方面[50]，會(huì)對(duì)莢膜多糖在疫苗研制和疾病治療中的作用有更加清晰的認(rèn)識(shí)。在此基礎(chǔ)上，通過生物工程手段對(duì)細(xì)菌進(jìn)行改造，使細(xì)菌的莢膜多糖向著有利于人類生存和應(yīng)用的方向發(fā)展。

[1]Lu CP. Veterinary microbiology[M]. 4th ed. Beijing: China Agriculture Press, 2007: 15-16. (in Chinese) 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 4版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2007:15-16.

[2]Wu LZ, Wang JL, Xiao YQ, et al. Research progress on virulence factor ofStreptococcussuistype 2[J]. Progr Vet Med, 2012, 33(6): 118-122. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5038.2012.06.029 (in Chinese) 吳立志, 王金良, 肖躍強(qiáng)，等. 豬鏈球菌2型毒力因子研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(6): 118-122. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5038.2012.06.029

[3]Lesinski GB, Westerink MA. Vaccines against polysaccharide antigens[J]. Curr Drug Targets Infect Disord, 2001, 1 (3): 325-334. DOI: 10.2174/1568005014605964

[4]Brzychczy-Wloch M, Gosiewski T, Bodaszewska M, et al. Genetic characterization and diversity ofStreptococcusagalactiaeisolates with macrolide resistance[J]. J Med Microbiol, 2010, 59(Pt 7): 780-786. DOI: 10.1099/jmm.0.018176-0

[5]Wu DR. Carbohydrate chemistry[M]. Beijing: Higher Education Press, 1987: 535-539. (in Chinese) 吳東儒.糖類的生物化學(xué)[M].北京:高等教育出版社, 1987, 535-539.

[6]Chen HM, Xiao GS, Wen XT. Research advance in virulence factors and serotypes ofActinobacilluspleuropneumoniae[J]. Chin J Vet Drug, 2006, 40(4): 35-40. DOI: 10.3969/j.issn.1002-1280.2006.04.010 (in Chinese) 陳華美,肖國(guó)生,文心田.豬胸膜肺炎放線桿菌的血清型分型及毒力因子研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志, 2006, 40(4): 35-40. DOI: 10.3969/j.issn.1002-1280.2006.04.010

[7]Fan HJ, Lu CP, Tang JQ. Cloning, expression and animal experiment of the immunopotential fragment of mrp gene fromStreptococcussuistype 2[J]. Acta Microbiol Sinica, 2004, 44(1): 54-57. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2004.01.011 (in Chinese) 范紅結(jié), 陸承平, 唐家琪. 豬鏈球菌mrp基因免疫功能片段的克隆、表達(dá)和動(dòng)物試驗(yàn)[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2004, 44(1): 54-57. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2004.01.011

[8]Xu SF, He KW, Lu CP. Cloning and expression of the partial fragment of gene encoding for the virulence factor ofstreptococcussuistype 2[J]. Chin J Zoonoses, 2004, 20(11): 943-946.(in Chinese) 徐淑菲,何孔旺,陸承平.豬鏈球菌2型毒力因子部分片段的克隆與表達(dá)[J].中國(guó)人獸共患病雜志, 2004, 20(11): 943-946.

[9]Li ML, Huang JQ, Ma RC, et al. Virulence factor of theStreptococcusSuistype 2[J]. J Shaoguan Univ Nat Sci, 2006, 27(3): 70-74. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5348.2006.03.021 (in Chinese) 李茂林,黃健強(qiáng),馬榮超,等.2型豬鏈球菌毒力因子[J].韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào),2006, 27(3): 70-74. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5348.2006.03.021

[10]Brazeau C, Gottschalk M, Vincelette S, et al.Invitrophagocytosis and survival ofStreptococcussuiscapsular type 2 inside murine macrophages[J]. Microbiology, 1996, 142(Pt 5): 1231-1237. DOI:10.1099/13500872-142-5-1231

[11]Wei ZG. Study on the epidemiology ofStreptococcussuisand the mechanism of their biofilm formation[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University Prevention Veterinary medicine, 2010. (in Chinese) 魏子貢.豬鏈球菌流行病學(xué)及其生物被膜形成機(jī)理研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué), 2010.

[12]Wieruszeski JM, Talaga P, Lippens G. Development of a high-resolution magic-angle spinning nuclear magnetic resonance identity assay of the capsular polysaccharide fromHaemophilusinfluenzatype b present in cetavlon precipitate[J]. Anal Biochem, 2005, 338(1): 20-25. DOI: 10.1016/j.ab.2004.10.038

[13]Jang H, Yoon YK, Kim JA, et al. Optimization of Vi capsular polysaccharide production during growth ofSalmonellaentericaserotype Typhi Ty2ina bioreactor[J]. J Biotechnol, 2008, 135(1): 71-77. DOI:10.1016/j.jbiotec.2008.02.017

[14]Liu FL, Wu B, Du L, et al. Preparation characterization and immunogenicity in mice for conjugate vaccine ofNeisseriameningococcalserogroup A polysaccharide tetanus toxoid[J]. Prog Microbiol Immunol, 2005, 33(2): 14-20. DOI: 10.13309/j.cnki.pmi.2005.02.004 (in Chinese) 劉方蕾, 吳兵, 杜琳,等. A群奈瑟氏腦膜炎球菌莢膜多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗的制備及其免疫原性研究[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2005, 33(2): 14-20. DOI: 10.13309/j.cnki.pmi.2005.02.004

[15]Wang KC, Lu CP, Fan WX. Bacterial capsular polysaccharide[J]. Acta Microbiol Sinica, 2011, 51(12): 1578-1584. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2011.12.012 (in Chinese) 王楷宬, 陸承平, 范偉興. 細(xì)菌莢膜多糖[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(12): 1578-1584. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2011.12.012

[16]Egan W, Schneerson R, Werner KE, et al. Structural studies and chemistry of bacterial capsular polysaccharides investigations of phosphodiester-linked capsular polysaccharides isolated fromHaemophilusinfluenzatypes a, b, c and fiNMR spectroscopic identification and chemical modification of end groups and the nature of base-catalyzed hydrolytic depolymerization[J]. J Am Chem Soc, 1982, 104(10): 2898-2910. DOI: 10.1021/ja00374a033

[17]Taylor CM, Roberts IS. Capsular polysaccharides and their role in virulence[J]. Contrib Microbiol, 2005, 12: 55-66. DOI: 10.1159/000081689

[18]Costerton JW, Cheng KJ, Geesey GG, et al. Bacterial biofilms in nature and disease[J]. Annu Rev Microbiol, 1987, 41: 435-464. DOI: 10.1146/annurev.mi.41.100187.002251

[19]Kolenbrander PE. Coaggregation of human oral bacteria: potential role in the accretion of dental plaque[J]. J Appl Bacteriol, 1993, 74(Suppl): 79S-86S. DOI: 10.1111/j.1365-2672.1993.tb04344.x

[20]Li S, Song J, Huang H, et al. Identification ofin-vivoinduced genes ofStreptococcussuisserotype 2 specially expressed in infected human[J]. Microb Pathog, 2013, 63: 8-15. DOI:10.1016/j.micpath.2013.05.011

[21]Chen Y. Survey of the research on natural polysaccharide[J]. World Sci Technol, 2000, 2(6): 52-55. (in Chinese) 陳怡. 天然多糖的研究概況[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化, 2000, 2(6): 52-55.

[22]Yang ST, Silva EM. Novel products and new technologies for use of familiar carbohydrate-milk lactose[J]. J Dairy Sci, 1995,78(11):2541-2562. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(95)76884-9

[23]Wu JY, Yang XY, Wang ZC. Isolation, purification and reactiongenicity ofStaphylococcusaureustype 8 capsular polysaccharide[J]. Chin Vet Sci, 2010, 40(12): 1214-1217. (in Chinese) 吳建勇, 楊學(xué)云, 王治才. 金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖的提取純化及其反應(yīng)原性[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2010, 40(12): 1214-1217.

[24]Li W, Ji J, Xu XY, et al. Extraction and antioxidant activityinvitroof capsular polysaccharide fromLactobacillushelveticusMB2-1 in sayram yogurt from Xinjiang[J]. Food Sci, 2012, 33(21): 34-38. (in Chinese) 李偉, 紀(jì)鵑, 徐希研,等. 源自新疆賽里木酸奶的瑞士乳桿菌MB2-1莢膜多糖提取及其抗氧化活性[J].食品科學(xué), 2012, 33(21): 34-38.

[25]Wang KC, Zhao X, Lu CP, et al. Comparison of monosaccharide composition of capsular polysaccharides inStreptococcussuisserotype 1, 2, 14 and 1/2[J]. Acta Microbiol Sinica, 2014, 54(6): 656-662. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2014.06.008 (in Chinese) 王楷宬, 趙峽, 陸承平,等. 豬鏈球菌1、2、14、1/2型莢膜多糖的單糖組成比較[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(6): 656-662. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2014.06.008

[26]Van Calsteren MR, Gagnon F, Calzas C, et al. Structure determination ofStreptococcussuisserotype 14 capsular polysaccharide[J]. Biochem Cell Biol, 2013, 91(2): 49-58. DOI: 10.1139/bcb-2012-0036

[27]Zhao HP. Progress in isolation and purification of bacterial capsular polysaccharide[J]. Prog Microbiol Immunol, 2012, 40(2): 72-78. DOI: 10.13309/j.cnki.pmi.2012.02.014 (in Chinese) 趙海平. 細(xì)菌莢膜多糖的分離純化研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2012,40(2):72-78.DOI:10.13309/j.cnki.pmi.2012.02.014

[28]Van Calsteren MR, Gagnon F, Lacouture S, et al. Structure determination ofStreptococcussuisserotype 2 capsular polysaccharide[J]. Biochem Cell Biol, 2010, 88(3): 513-525. DOI: 10.1139/O09-170

[29]Elliott SD, Tai JY. The type-specific polysaccharides ofStreptococcussuis[J]. J Exp Med, 1978, 178(6): 1699-1704. DOI: 10.1084/jem.148.6.1699

[30]Ji Y, Tian Y, Ahnfelt M, et al. Design and optimization of a chromatographic purification process forStreptococcuspneumoniaeserotype 23F capsular polysaccharide by a design of experiments approach[J]. J Chromatogr A, 2014, 1348: 137-149. DOI:10.1016/j.chroma.2014.04.096

[31]Zhao B, Gao WY, Feng QK, et al. Research on extraction and separation of polysaccharides medicine[J]. Changchun College Tradit Chin Med, 2006, 22(1): 85-86. DOI: 10.13463/j.cnki.cczyy.2006.01.064 (in Chinese) 趙博, 高文義, 馮乾坤,等. 多糖類藥物提取分離研究概況[J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 22(1): 85-86. DOI: 10.13463/j.cnki.cczyy.2006.01.064

[32]Pato TP, Barbosa Ade P, da Silva Junior JG. Purification of capsular polysaccharide fromNeisseriameningitidesserogroup C by liquid chromatography[J]. J Chromatogr B, Analyt Technol Biomed Life Sci, 2006, 832(2): 262-267. DOI: 10.1016/j.jchromb.2006.01.008

[33]De Castro C, Fregolino E, Gargiulo V, et al. A novel capsular polysaccharide fromRhizobiumrubistrain DSM 30149[J]. Carbohydr Res, 2008, 343(9): 1482-1485. DOI: 10.1016/j.carres.2008.04.024

[34]Zhang ZH. Extraction, isolation and preliminary structural characterization of different serotype capsular polysaccharides fromStreptococcussuis[D]. Qingdao:School of medical pharmacology Ocean University of China, 2011. (in Chinese) 張紫恒. 不同血清分型鏈球菌莢膜多糖的提取分離與結(jié)構(gòu)組成初步分析[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院, 2011.

[35]Cintra Fde O, Takagi M. Study of the chemical stability of the capsular polysaccharide produced byHaemophilusinfluenzaetype b[J]. Carbohydr Polym, 2015, 116: 167-172. DOI: 10.1016/j.carbpol.2014.04.004

[36]Zhang WJ. Biochemical technology of glycoconjugate[M]. 2nd ed. Hangzhou: Zhejiang University Press, 1994：128-129. (in Chinese) 張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].2版. 杭州: 浙江大學(xué)出版社, 1994：128-129.

[37]Kwon H, Kim J. Determination of monosaccharides in glycoproteins by reverse-phase high-performance liquid chromatography[J]. Anal Biochem, 1993, 215(2): 243-252. DOI: 10.1006/abio.1993.1582

[38]Snyder DS, Gibson D, Heiss C, et al. Structure of a capsular polysaccharide isolated fromSalmonellaenteritidis[J]. Carbohydr Res, 2006, 341(14): 2388-2397. DOI: 10.1016/j.carres.2006.06.010

[39]Talaga P, Vialle S, Moreau M. Development of a high-performance anion-exchange chromatography with pulsed-amperometric detection based quantification assay for pneumococcal polysaccharides and conjugates[J]. Vaccine, 2002, 20(19/20): 2474-2484. DOI: 10.1016/S0264-410X(02)00183-4

[40]Lv Y, Yang XB, Zhao Y, et al. Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum by HPLC with indirect UV detection[J]. Food Chem, 2009, 112(3): 742-746. DOI: 10.1016/j.foodchem.2008.06.042

[42]Lin FL, Vinogradov E, Deng C, et al. Structure elucidation of capsular polysaccharides fromStreptococcuspneumoniaserotype 33C, 33D and revised structure of serotype 33B[J]. Carbohydr Res, 2014, 383: 97-104. DOI: 10.1016/j.carres.2013.11.006

[43]Jones C, Lemercinier X. Full NMR assignment and revised structure for the capsular polysaccharide fromStreptococcuspneumoniatype 15B[J]. Carbohydr Res, 2005, 340(3): 403-409. DOI:10.1016/j.carres.2004.12.009

[44]Wang X, Ren KM, Chen XH, et al. Application of NMR spectrum in identification of pneumococcal capsular polysaccharides[J]. Prog Microbiol Immunol, 2013, 41(3): 18-23. DOI: 10.13309/j.cnki.pmi.2013.03.011 (in Chinese) 王璽, 任克明, 陳曉航,等. 核磁共振波譜法在肺炎球菌莢膜多糖檢定中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2013, 41 (3): 18-23. DOI: 10.13309/j.cnki.pmi.2013.03.011

[45]Petersen BO, Hindsgaul O, Paulsen BS, et al. Structural elucidation of the capsular polysaccharide fromStreptococcuspneumoniaserotype 47A by NMR spectroscopy[J]. Carbohydr Res, 2014, 386: 62-67. DOI: 10.1016/j.carres.2013.11.013

[46]Li L. Studies on the biosynthesis of bacterial polysaccharides, glycoproteins and enzymes involved in the pathways[D]. Jinan: School of life Science Shandong University, 2010. (in Chinese) 李磊. 細(xì)菌多糖和糖蛋白生物合成途徑及其酶類研究[D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2010.

[47]Lairson LL, Henrissat B, Davies GJ, et al. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms[J]. Annu Rev Biochem, 2008, 77: 521-555. DOI: 10.1146/annurev.biochem.76.061005.092322

[48]Raetz CR, Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins[J]. Annu Rev Biochem, 2002, 71: 635-700. DOI: 10.1146/annurev.biochem.71.110601.135414

[49]Robbins JB, Austrian R, Lee CJ, et al. Considerations for formulating the second-generation pneumococcal capsular polysaccharide vaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups[J]. J Infect Dis, 1983, 148(6): 1136-1159. DOI: 10.1093/infdis/148.6.1136

[50]Jiao AX, Xun DW, Zhao HW, et al. Virulence genes, hemolytic and antibiotic resistance inStreptococcussuisserotype 2 isolated from Anhui Province, China[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 30(12): 1181-1186. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2014.12.002 (in Chinese) 焦安心, 許大文, 趙洪武,等. 豬2型鏈球菌安徽分離株的毒力基因溶血性及耐藥性分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2014, 30(12): 1181-1186. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2014.12.002

[51]Pang D. spd1672 ofStreptococcuspneumoniamodulates the expression of capsular polysaccharides[D]. Chongqing: Department of medical test, Chongqing Medical University, 2010. (in Chinese) 龐丹. 肺炎鏈球菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因spd1672影響細(xì)菌莢膜形成的機(jī)制研究[D]. 重慶: 重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系, 2010.

Research progress on bacterial capsular polysaccharide

LI Tian-yi1,2，WANG Ying-feng1，ZHANG Mei2,3

(1.DepartmentofChemistry,CapitalNormalUniversity,Beijing100048,China; 2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 3.CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou310003,China)

The purpose of this review is to summarize novel research progress on capsular polysaccharide (CPS)， especially the related research progresses on bacterial capsular polysaccharide (CPS) are reviewed. The definition, physicochemical properties and biological functions of CPS were summarized in this review article. Study progresses on extraction, isolation and purification of CPS were discussed, especially those reports and results related to structural analysis. This information can contribute to the further research on the pathogenic and typing mechanism by the investigation of the relationship between CPS structures and pathogenicity and also the survival ability. In addition, the structures of CPS will be the basic data to prompt the design of both general and target vaccines. All of these play important roles on the prevention and control of pathogen infection.

capsular polysaccharide; extraction; isolation; purification; physicochemical

Zhang Mei, Email: zhangmei@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.017

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No. 81471919)和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心青年科研基金 (No. 2014A101)聯(lián)合資助

張玫，Email: zhangmei@icdc.cn

1.首都師范大學(xué)化學(xué)系，北京 10004; 2.傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206; 3.感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003

R378

A

1002-2694(2015)12-1171-06

2015-02-05；

2015-05-14

Supported by the NNSF China (No. 81471919) and the Research Foundation of China CDC (No. 2014A101).