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    豬細(xì)小病毒體外培養(yǎng)研究進(jìn)展

    2015-01-25 02:37:28
    中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘 2015年3期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)小病毒感染

    馮 靜 楊 青

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

    豬細(xì)小病毒體外培養(yǎng)研究進(jìn)展

    馮 靜 楊 青*

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

    豬細(xì)小病毒是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一。細(xì)胞培養(yǎng)法是體外分離純化病原最基本的方法。本文介紹了病毒細(xì)胞模型的建立、細(xì)胞模型在病毒診斷中的應(yīng)用、病毒在細(xì)胞培養(yǎng)模型上培養(yǎng)條件的優(yōu)化等,并分析了病毒與細(xì)胞模型相互作用、抗病毒藥物在細(xì)胞模型上的研究進(jìn)展。

    豬細(xì)小病毒 細(xì)胞模型 病毒診斷 抗病毒

    豬細(xì)小病毒(PPV)是造成母豬繁殖障礙的主要因素之一,嚴(yán)重影響母豬的繁殖能力。豬細(xì)小病毒感染宿主后,早期引起胚胎死亡,產(chǎn)仔數(shù)少或?qū)遗洳辉校恢衅诋a(chǎn)木乃伊胎,后期產(chǎn)仔正常,但仔豬攜帶PPV病毒。細(xì)小病毒只感染豬,大小豬都易感,但僅初產(chǎn)豬表現(xiàn)癥狀。目前成世界流行趨勢(shì),給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

    PPV于1967年由Cartwright等在研究豬繁殖障礙性疾病時(shí)分離并首次發(fā)現(xiàn)其致病性[7],在我國(guó)1983年首次分離到。研究者通過(guò)系統(tǒng)或局部等人工感染PPV的方式構(gòu)建了許多動(dòng)物模型,并對(duì)PPV致病性及其感染所致的組織病變等進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)PPV可在多數(shù)動(dòng)物組織和細(xì)胞(原代和傳代細(xì)胞)中增殖,能引起較明顯的組織和細(xì)胞病變,常作為模式病毒用于病毒感染機(jī)制和藥物的抗病毒作用研究。

    動(dòng)物模型可以觀察PPV對(duì)機(jī)體的侵害,造成的病理變化部位,也不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備,操作簡(jiǎn)單,但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異大,且價(jià)格昂貴,還需準(zhǔn)備畜舍,實(shí)驗(yàn)中受環(huán)境因素影響大,不可控因素多。相對(duì)于動(dòng)物模型,構(gòu)建細(xì)胞模型能有效地彌補(bǔ)動(dòng)物模型的不足。由于細(xì)胞的生理特性的一致性,對(duì)病毒的易感性不存在差異,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好;而且細(xì)胞培養(yǎng)方便、經(jīng)濟(jì)、周期短,可以嚴(yán)格的執(zhí)行無(wú)菌操作;另外,細(xì)胞培養(yǎng)能顯示病毒的生長(zhǎng)特征,采用空斑技術(shù)能對(duì)病毒進(jìn)行克隆化。對(duì)病毒分子生物學(xué)特性研究,發(fā)病機(jī)制的研究、疫苗研制和抗病毒藥物篩選都離不開(kāi)體外細(xì)胞培養(yǎng)模型。

    1 病毒體外培養(yǎng)的條件研究

    PPV對(duì)宿主細(xì)胞有一定的選擇性,一般在豬原代細(xì)胞上如豬腎、豬睪丸細(xì)胞及傳代細(xì)胞(如 PK-15、ST和IBRS2等)和人的某些傳代細(xì)胞(如 Hela,KB,Hep-2和Lul32等)上生長(zhǎng)繁殖。Oraveerakul(1992)等比較了NADL-8、NADL-2、KBSH和 Kresse 4株P(guān)PV病毒株在不同細(xì)胞系中的復(fù)制情況,除了使用常用的來(lái)源于豬睪丸和豬腎的細(xì)胞系,研究中還使用了來(lái)自牛胎肺、牛皮膚、牛胎兒皮膚、牛腎、犬腎、綠猴腎、牛胎兒睪丸、狼皮膚、豬輸卵管、綠猴腎、幼倉(cāng)鼠腎、羊胎兒睪丸和人上皮癌細(xì)胞等細(xì)胞系,不同的病毒株在同一細(xì)胞上或者同一病毒株在不同細(xì)胞系上生長(zhǎng)復(fù)制情況都不同。而且研究發(fā)現(xiàn)PPV病毒還能在牛、犬和狼的一些細(xì)胞系上生長(zhǎng)復(fù)制。

    PPV感染細(xì)胞一般有2種途徑,一種是在細(xì)胞傳代時(shí)同時(shí)加入病毒液,由于PPV的復(fù)制依賴(lài)細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸合成體系來(lái)完成其病毒粒子的復(fù)制,通常采用同步接毒方式繁殖PPV病毒。這種接毒方式可使易感細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)間縮短,也可縮短細(xì)胞盲傳周期。另一種是待細(xì)胞長(zhǎng)到70%~80%時(shí),棄掉培養(yǎng)基,加入病毒稀釋液,待病毒與細(xì)胞作用一段時(shí)間后再加入細(xì)胞維持液,大多數(shù)病毒采用此種方式接毒。

    病毒的體外培養(yǎng)受多種因素的影響,當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)環(huán)境如溫度和氣體環(huán)境、培養(yǎng)基以及血清類(lèi)型和濃度都決定著細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況,從而影響病毒的培養(yǎng)。魏戰(zhàn)勇(2005)等將3種豬細(xì)小病毒毒株包括南京毒株1(NJ-1)、NJ-2和7909毒株接種于PK-15細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)3個(gè)毒株的增殖規(guī)律基本相似,在感染后12 h后就可檢測(cè)到熒光信號(hào),隨后逐漸增高,在感染48 h時(shí)幾乎所有細(xì)胞都被感染,在感染60 h時(shí)其TCID50均達(dá)最高;在84 h時(shí)病毒引起細(xì)胞大面積崩解,由此可見(jiàn)這3中PPV病毒株在PK-15中收獲較佳的時(shí)間是接種后60 h。該研究進(jìn)一步測(cè)定發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中PPV病毒粒子的半壽期為7 h[6]。唐滿(mǎn)華(2013)等摸索了豬細(xì)小病毒M2株在ST細(xì)胞中培養(yǎng)條件并進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PPV M2株采用同步接種法相對(duì)于單層接種法更具優(yōu)勢(shì)。研究比較發(fā)現(xiàn):在合適的細(xì)胞密度下,在培養(yǎng)基添加含不同血清及血清濃度采用可導(dǎo)致CPE出現(xiàn)的時(shí)間不同,而且毒力也不一樣[4]。Wei(2009)等研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮(Nitric oxide,NO)對(duì)豬細(xì)小病毒的體外增殖有一定的影響,用底物S-硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)和L-精氛酸(L-Arg)誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO可使PPV感染細(xì)胞的作用受影響,其抑制效果與NO底物的濃度呈正相關(guān),而且在一定濃度下SNAP抑制PPV的復(fù)制強(qiáng)于L-Arg;相關(guān)結(jié)果也表明NO的抗病毒作用主要發(fā)生在病毒感染的初始階段[11]。

    2 細(xì)胞模型在病毒診斷的應(yīng)用

    利用組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)病毒進(jìn)行分離鑒定是一種常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法,通過(guò)病毒感染易感細(xì)胞、細(xì)胞病變并結(jié)合一些分子生物學(xué)檢查手段能有效地分離和純化病毒。豬細(xì)小病毒只感染豬,僅初產(chǎn)豬表現(xiàn)癥狀,根據(jù)豬繁殖障礙臨床癥狀診斷時(shí)要與偽狂犬病、豬瘟、乙型腦炎和豬繁殖與呼吸綜合征等病區(qū)分,需要分離病毒進(jìn)行鑒別診斷。病毒分離有動(dòng)物接種,雞胚培養(yǎng)和組織或細(xì)胞培養(yǎng)法。動(dòng)物接種如嗜神經(jīng)性病毒(狂犬病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和帶狀皰疹病毒等)可接種于小鼠腦內(nèi),痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。雞胚對(duì)多種病毒敏感,根據(jù)不同種類(lèi)病毒,將病毒接種于雞胚的不同部位。Zhang(2010)等在木乃伊和流產(chǎn)胎兒器官中分離到一株病毒,這株病毒能凝集豚鼠,兔和雞的紅細(xì)胞,經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)證實(shí)為豬細(xì)小病毒(PPV)。進(jìn)一步將該病毒株通過(guò)接種于豬原代腎細(xì)胞和傳代ST細(xì)胞能引起明顯的細(xì)胞病變,并通過(guò)ELISA、免疫熒光分析、電鏡觀察以及測(cè)序結(jié)果確認(rèn)是PPV BQ株[12]。

    3 病毒與細(xì)胞宿主之間作用關(guān)系

    非特異性免疫是抵御病毒感染的第一道防線(xiàn),其通過(guò)信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等)和某些非免疫細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞等)經(jīng)刺激而合成、分泌的一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。病毒感染細(xì)胞過(guò)程中,引起細(xì)胞非特異性免疫反應(yīng),調(diào)控免疫應(yīng)答。

    3.1 干擾素

    細(xì)胞因子中包括干擾素(IFN),干擾素有2類(lèi),分別是I型干擾素(病毒誘導(dǎo)型)和Ⅱ型干擾素(免疫調(diào)節(jié)型)。干擾素是一種廣譜抗病毒劑,主要通過(guò)細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白。Wen Lin(2013)等使用熒光定量PCR和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)PPV感染ST細(xì)胞后是否誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素(IFN-α和IFN-β),以及是否阻斷dsRNA誘導(dǎo)IFN-β啟動(dòng)子的活化。研究顯示 PPV感染ST后不誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素且PPV的NS2蛋白阻斷dsRNA誘導(dǎo)IFN-β啟動(dòng)子的活化[11]。這里的實(shí)驗(yàn)結(jié)果使我們對(duì)細(xì)小病毒的發(fā)病機(jī)制理解產(chǎn)生重大影響,也為我們今后研制一類(lèi)新的抗病毒和抗炎藥物提供參考。李厚偉(2011)等研究發(fā)現(xiàn)PPV感染PK-15細(xì)胞可引起的病毒DNA量的變化,在感染12 h后病毒開(kāi)始大量迅速增殖,48 h達(dá)到最高峰,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與魏站勇的結(jié)果相同[6];同時(shí)使許多細(xì)胞因子(如IFN p、IFN 7、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-I、MHC-lI、MXl、iNOS、2-5AS、RNase L和IRF 3)的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加,其中Mxl基因在24 h轉(zhuǎn)錄量達(dá)到8 423倍[2]。

    3.2 白細(xì)胞介素

    PPV在感染胎兒死亡后可見(jiàn)多種組織和器官有廣泛的細(xì)胞壞死、炎癥和核內(nèi)包涵體。白介素是參與細(xì)胞免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子。病毒接種于細(xì)胞后會(huì)引起細(xì)胞病變,為了解豬細(xì)小病毒(PPV)感染Marc-145細(xì)胞后引起細(xì)胞炎性反應(yīng),黨玉麗等(2011)、劉石等(2011)和張彥桃等(2011)運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了豬細(xì)小病毒(PPV)感染Marc-145細(xì)胞后引起的病毒DNA含量的變化及白介素的分泌水平。結(jié)果表明白介素IL-6和IL-13的表達(dá)量在l、3和24 h明顯增加,48 h時(shí)下降至低于對(duì)照水平;而IL-18的表達(dá)量在1 h無(wú)明顯變化、在3~24 h增加,而48 h有下降趨勢(shì)[1,3,5]。說(shuō)明Marc-145細(xì)胞感染豬細(xì)小病毒后可引起IL-6、IL-13和IL-18的增加,細(xì)胞內(nèi)白介素積極參與抵抗病毒的侵染。

    4 抗病毒藥物研究

    尋找有效的抗病毒藥物是目前很熱門(mén)的研究方向,據(jù)報(bào)道甘草酸二銨能有效治療幾種病毒(如人的免疫缺陷病毒、甲型和乙型肝炎病毒、冠狀病毒和皰疹病毒)。Li(2014)等用豬睪丸(ST)細(xì)胞為模型,研究了甘草酸二銨對(duì)PPV的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)甘草酸二胺提前處理要感染ST細(xì)胞的PPV病毒時(shí)對(duì)PPV病毒有強(qiáng)的抑制作用,且呈劑量依賴(lài)性。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果還通過(guò)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。脫氧膽酸鹽是一種陰離子去除劑,此實(shí)驗(yàn)中被用作對(duì)照組,以排除甘草酸二胺充當(dāng)洗滌劑抑制PPV感染的可能性。研究清楚地表明,甘草酸二胺在體外有直接抗PPV效果[9]。Li的研究為豬細(xì)小病的治療開(kāi)辟了新的研究方向。

    5 總結(jié)和展望

    體外模型是病毒研究中不可缺少的部分,無(wú)論是在病毒結(jié)構(gòu)研究,致病機(jī)理,病情診斷,病毒分離純化等都起著重要作用。迄今建立的PPV感染細(xì)胞模型主要方便了病毒的培養(yǎng),克隆純化。但是,細(xì)胞模型與病毒入侵機(jī)體還存在一定差距,畢竟機(jī)體的防御機(jī)制與單獨(dú)的細(xì)胞防御存在差異。細(xì)胞模型還受環(huán)境,培養(yǎng)基的影響,最適培養(yǎng)條件有利病毒培養(yǎng)??共《舅幬锏难芯靠臻g很大,今后的研究中應(yīng)研究更多的藥物為防治PPV做出完善。

    [1] 劉石,哈斯通拉嘎,王瑞寧,等.PPV感染Marc-145細(xì)胞后對(duì)其分泌IL-13轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,(3):710-713.

    [2] 李厚偉,魏戰(zhàn)勇,尹海燕,等.豬細(xì)小病毒感染PK-15細(xì)胞抗病毒相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄變化的分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(1):48-55.

    [3] 張彥桃,梁秀麗,劉芳,等.豬細(xì)小病毒感染Marc-145細(xì)胞后對(duì)其分泌白細(xì)胞介素6轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,40(6):138-141.

    [4] 唐滿(mǎn)華,陳瑞愛(ài),何玲,等.豬細(xì)小病毒M2株在ST細(xì)胞中培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2013,(10):56-60.

    [5] 黨玉麗,哈斯通拉嘎,耿靜微,等.豬細(xì)小病毒感染Marc-145細(xì)胞后對(duì)其分泌白細(xì)胞介素18轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,45(5):568-570,584.

    [6] 魏戰(zhàn)勇,王學(xué)兵,陳紅英,等.利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)豬細(xì)小病毒在PK-15細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,43(4):398-401.

    [7] Cartwright SF,Huck RA.Virus isolation is associated with herd infertility,abortion and stillbirth in pigs [J].Vet Rec,1967,(81):196-197.

    [8] Lin W,Qiu Z,Liu Q,et al.Interferon induction and suppression in swine testicle cells by porcine parvovirus and its proteins[J].Vet Microbiol,2013,163(1-2):157-161.

    [9] Li P,Zou H,Ren Y,et al.Antiviral effect of diammonium glycyrrhizinate on cell infection by porcine parvovirus[J].Curr Microbiol,2014,69(1):82-87.

    [10] Oraveerakul K,Choi C S,Molitor T W.Restriction of porcine parvovirus replication in nonpermissive cells[J].J Virol,1992,66(2):715-722.

    [11] Wei Z Y,Wang X B,Ning X D,et al.Nitric oxide inhibits the replication cycle of porcine parvovirus in vitro[J].Arch Virol.2009,154(6):999-1003.

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    國(guó)家自然科學(xué)基金(31272630)和教育部博士點(diǎn)基金-新教師類(lèi)(20114320120006)。

    馮靜(1988-),女,碩士研究生,主要研究方向動(dòng)物生殖醫(yī)學(xué)。

    楊青(1976-),女。

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