活性氧在免疫應(yīng)答中的作用①

陳 潔 趙明峰 (天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192)

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是一群具有較強氧化能力的分子的總稱［1］。生物體內(nèi)的ROS 包括超氧陰離子(O2·-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(O2)?；钚匝踉诿庖呦到y(tǒng)中主要來源于細胞膜的NADPH 氧化酶復(fù)合體2(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX2)，并在淋巴細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮巨大作用［2］。早在1980 年人們就認識到ROS 在固有免疫中作為主要武器對抗病原體的重要作用，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)其在不同濃度的情況下在獲得性免疫中的重要調(diào)節(jié)作用。

1 ROS 的功能

之前的觀點認為ROS 是一類細胞內(nèi)毒性物質(zhì)，到后來從被證明可以激活胞漿內(nèi)的第二信使鳥苷酸環(huán)化酶(cGMP)開始，ROS 在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮的作用越來越受到人們的重視。O2·-是線粒體產(chǎn)生ROS 的前體，其他形式都是由生物體內(nèi)各種酶催化O2·-而來。其中超氧岐化酶(SOD)可以催化O2·-轉(zhuǎn)化為H2O2。H2O2是ROS 中最穩(wěn)定的形式且擴散能力較強，但是據(jù)資料顯示它的穩(wěn)定會受到細胞內(nèi)的pH 和氧化還原平衡影響［3］。H2O2的強擴散力主要因為它可以自由進出細胞膜，而最近證據(jù)表明:過氧化氫可能通過細胞水通道蛋白優(yōu)先進入特定的細胞［4］。H2O2主要通過氧化多種蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基(-SH)來實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。它具有靶向可逆的氧化半胱氨酸的硫化物(-SH)為次磺酸(-SOH)。帶電的氨基酸可以使正常的半胱氨酸殘基pKa8.5 降低到pKa5 以下，這種低pKa 半胱氨酸可以成為H2O2的氧化目標［5］。這個發(fā)現(xiàn)支持過氧化氫可以作為第二信使［13，14］。

H2O2可以以模仿配體的方式來激活多種受體信號通路。它可以直接激活部分受體或者激活含有蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTKs)的通路。另一個通路是抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPs)的激活。PTP 主要在受體激活通路的信號傳遞中起抑制作用并且抑制PTK 的活化。一些像染色體的張力蛋白(PTEN)和促分裂原活化激酶(MAPK)之類的磷酸酶也可以被H2O2所抑制［5］。

2 免疫應(yīng)答中ROS 的來源

在有氧呼吸過程中，多數(shù)真核細胞都可產(chǎn)生ROS 參與細胞間的轉(zhuǎn)導(dǎo)。線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈是細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的主要部位。在線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的5 個復(fù)合物中，小部分電子由復(fù)合物Ⅰ、復(fù)合物Ⅲ漏出，使分子氧還原生成O2·-。免疫系統(tǒng)中吞噬細胞是最早發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生ROS，隨著檢驗探測技術(shù)的發(fā)展，研究者用胞內(nèi)熒光探針如二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)、二氫乙啶(DHE)、雙氫羅丹明(DHR)等，通過流式細胞分析儀檢測單個細胞合成的ROS 已經(jīng)證明T、B 淋巴細胞也能產(chǎn)生ROS。特別是T 細胞受體TCR 活化后的2～4 min 就有ROS 產(chǎn)生，這提示ROS 是TCR 活化的過程中的潛在作用分子［6］。

淋巴細胞主要通過細胞質(zhì)膜上NADPH 氧化酶復(fù)合體2 產(chǎn)生，而NADPH 氧化酶復(fù)合體2 缺陷的小鼠T 細胞ROS 產(chǎn)生減少并且該小鼠獲得慢性肉芽腫性病(Chronic granulomatous disease，CGD)，充分說明NADPH 氧化酶復(fù)合體2 是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生ROS 的重要來源［7］。

3 活性氧調(diào)控免疫應(yīng)答的作用及機制

3.1 活性氧在先天免疫中的作用 早在1980s 人們就認識到中性粒細胞在病原體入侵機體時可以產(chǎn)生大量的ROS 來消滅病原體。ROS 在先天免疫應(yīng)答中不僅對病原體有直接殺傷作用，還可以通過調(diào)節(jié)NK 細胞活性來參與一系列抗菌活動。

3.1.1 活性氧的抗菌作用 機體遭遇病原體入侵時，中性粒細胞、吞噬細胞“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生大量的ROS。由此產(chǎn)生的ROS 為抵抗病原體的主要武器。缺乏NADPH 氧化酶復(fù)合體2 的患者先天免疫低下而易患各種感染。雖然NADPH 氧化酶復(fù)合體2 主要產(chǎn)生超氧化物，但因為其相對于其他形態(tài)ROS 的不活躍性，因此對超氧化物直接殺傷病原體的能力仍然存在爭議［2］。反而由于其自身的不穩(wěn)定性，超氧化物會轉(zhuǎn)化成其他更穩(wěn)定的形式。在超氧岐化酶的催化下超氧化物歧化成H2O2，而H2O2可以氧化靶蛋白的半胱氨酸殘基或形成二硫化物達到殺傷病原體的目的。H2O2和氯離子Cl-在髓過氧化物酶的作用下產(chǎn)生次氯酸(HOCl)。HOCl 和H2O2可以在局部聚集一定的濃度產(chǎn)生殺菌作用［2］。

然而，最近的研究結(jié)果表明，ROS 不僅直接用于殺死病原體，還動員其他抗菌策略。中性粒細胞是人體最多的免疫細胞，它是人體免疫的第一道防線，甚至細胞死亡后可以形成中性粒細胞胞外網(wǎng)狀陷阱(NETs)。NETs 包括DNA/組蛋白骨干和抗菌素肽。這些網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以阻止病菌的擴散，而且來自中性粒細胞顆粒的抗菌蛋白具有殺菌作用。但是有NADPH 氧化酶復(fù)合體2 缺陷的病人則不能形成這種陷阱說明來源NADPH 氧化酶復(fù)合體2 的ROS在這一殺菌機制中有重要的作用［8］。

3.1.2 活性氧調(diào)節(jié)自然殺傷細胞的活性 不需要與抗原接觸，NK 細胞是先天免疫系統(tǒng)的主要作用細胞能殺傷惡性細胞和已感染的細胞，并且NK 細胞通過大量的細胞毒素對癌癥起到免疫監(jiān)視作用。1980 年的研究揭示了NK 細胞遇到癌細胞早期會促進ROS 的產(chǎn)生并且這對NK 細胞介導(dǎo)的細胞溶解是必需的。來自慢性肉芽腫性病患者的NK 細胞在缺乏NADPH 氧化酶復(fù)合體2 的情況下，仍擁有正常的溶解功能，隨后實驗證明可能來自脂氧合酶途徑［6］。

有數(shù)據(jù)證明單核細胞可以抑制NK 細胞的活化、增殖、IFN-γ 分泌和細胞毒性。而來自慢性肉芽腫性病患者的單核細胞卻不抑制NK 細胞功能，表明NADPH 氧化酶復(fù)合體2 產(chǎn)生的ROS 在此抑制中的主要作用因子［6］。組胺與H2 受體結(jié)合可產(chǎn)生解除單核細胞抑制NK 細胞的作用，而單核細胞自身可以抑制組胺的產(chǎn)生。IL-12 最初可以激活NK 細胞，但延長IL-12 的作用會誘導(dǎo)NK 細胞的凋亡，并降低NK 細胞的細胞毒性和IFN-γ 的分泌。數(shù)據(jù)表明延長IL-12 的刺激作用會導(dǎo)致ROS 的聚集，進而使細胞釋放細胞色素c，而高濃度的ROS 會抑制NK細胞的細胞毒性并且誘導(dǎo)凋亡。

3.2 活性氧在獲得性免疫中作用 ROS 不僅是先天免疫的主要武器，而且從影響抗原提呈細胞的成熟分化到調(diào)節(jié)T、B 細胞的活化、增殖、凋亡來調(diào)節(jié)獲得性免疫。有數(shù)據(jù)顯示提高胸腺細胞內(nèi)的ROS濃度會影響正常T 細胞的發(fā)育而損害哺乳動物的獲得性免疫系統(tǒng)［15］。

3.2.1 活性氧對抗原提呈細胞的作用 樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)是體內(nèi)最主要的抗原提呈細胞，可以啟動一系列免疫反應(yīng)。在體內(nèi)，當(dāng)受到外源病原體的刺激時，DCs 捕獲大量的抗原并且把它們提呈給T 細胞去引發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答。當(dāng)獲得功能性成熟型表型DCs 將下調(diào)他們抗原捕獲能力而上調(diào)抗原提呈能力和協(xié)同刺激分子的表達。H2O2可以上調(diào)DC 的HLA-DQ、DR 分子和協(xié)同刺激分子CD40 和CD86 的表達，同時下調(diào)CD32 和CD1α 來誘導(dǎo)DC 的表型和功能成熟，降低DC 的抗原捕獲能力促進抗原呈遞作用［9］。有實驗用蛋白水解酶阻斷MG-132 預(yù)處理DCs，該物質(zhì)可以阻斷NF-κB 活性，結(jié)果H2O2對處理后的DCs 誘導(dǎo)其CD86 上調(diào)的作用大大減弱。數(shù)據(jù)表明H2O2可以通過NF-κB 機制來誘導(dǎo)DCs 的表型和功能的成熟。同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)過H2O2處理后的DCs 比正常的DCs 更能誘導(dǎo)T 細胞的增殖，該作用可被自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸NAC 所抑制［9，10］。

相反，有結(jié)果也顯示:膀胱癌患者中的ROS 可能下調(diào)DC 呈遞腫瘤抗原給CTL 從而抑制CTL 對膀胱癌T-24 的殺傷能力，并且這種抑制作用隨濃度的降低逐漸減弱。

目前認為正常的機體處于氧化還原的平衡狀態(tài)，機體本身有強大的代償作用。當(dāng)機體產(chǎn)生ROS時同時也會產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)。當(dāng)機體處于急性或慢性炎癥時氧化平衡點可能不同而ROS 會顯示不同的作用。

3.2.2 活性氧對淋巴細胞的作用

3.2.2.1 活性氧激活淋巴細胞 現(xiàn)在已明確ROS特別是H2O2能作為第二信使參與淋巴細胞的活化。ROS 能激活JNK-1 通路從而引起IL-2 的表達，而IL-2 是作為T 淋巴細胞活化的第三信號［6］。早期抑制NADPH 氧化酶復(fù)合體2 來阻斷該來源的ROS 產(chǎn)生會抑制淋巴細胞的活化［20］。

T 細胞在識別抗原和活化過程中需要和APC通過免疫突觸緊密接觸。NADPH 氧化酶復(fù)合體2是APCs 膜的組成成分，并且由脂筏運輸?shù)矫庖咄挥|，在免疫突觸這局部微環(huán)境內(nèi)O2·-歧化的H2O2可以聚集足夠的濃度來氧化半胱氨酸，從而激發(fā)T細胞活化通路［17］。

蛋白酪氨酸激酶(PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)是淋巴細胞活化和失活的兩大對立的含有半胱氨酸的酶系統(tǒng)，也是ROS 的主要作用靶點。在抗原和病原體的刺激下，靜息狀態(tài)下的B 細胞活化生成漿細胞并產(chǎn)生抗體。有實驗證明用過礬酸鈉(PTP 的抑制劑)取代抗原與B 細胞孵育，B 細胞會產(chǎn)生更多的抗體。Igα 和Igβ 尾端都帶有一個含有酪氨酸激活基序(ITAM)。靜息狀態(tài)下ITAM 被活性PTP 抑制而在BCR 的活化中產(chǎn)生的ROS 可以抑制PTP 從而解除對ITAM 的抑制［11］。有3 個PTK(Lyn、Syk 和Btk)和一個PTP(SHP-1)參與BCR 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。雙磷酸化的ITAM 允許帶有SH2 氨基末端的Syk 和BCR 相連，這刺激更多的Syk 激活和產(chǎn)生。SHP-1 則可以抑制Syk 的活性。

更有實驗證明，ROS 可以通過氧化PTP 的半胱氨酸殘基使之失活從而解除PTP 對ITAM 的抑制，ITAM 活化后可以激活Syk，Syk 又可以刺激更多的ROS 產(chǎn)生從而放大刺激BCR 的活化。而在T 細胞內(nèi)，ROS 特別是H2O2抑制PTP 可以促進細胞內(nèi)MAPK 的磷酸化來促進T 細胞的活化［12，14］。

3.2.2.2 活性氧與淋巴細胞分化、增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

實驗表明淋巴細胞的分化和增殖伴隨著ROS 濃度的增加。體外用分裂素刺激B 淋巴細胞實驗中，最初2 h ROS 的濃度僅輕度增加，而24 h 后則增加明顯，伴隨著抗氧化物質(zhì)的明顯增加［19］。

ROS 可以直接或間接作用于多種轉(zhuǎn)錄因子如:p53、jun、Akt 等參與調(diào)控MAPK 和NF-κB 等信號通路來介導(dǎo)淋巴細胞分化、增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。MAPKs對氧化還原特別敏感并且與細胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)。該信號系統(tǒng)主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-JunN 端激酶JNK 和P38MAPK 三條途徑。通常ERK 主要接受生長因子的刺激，活化后激活轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1(AP-1)來介導(dǎo)細胞增殖和分化。而JNK 和P38MAPK 激酶介導(dǎo)細胞凋亡［11］。NF-κB 是最早發(fā)現(xiàn)的與細胞氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB 由P50、P65 和抑制亞基I-κB組成。I-κB 的磷酸化后被蛋白綴合酶降解，NF-κB活化入核從而發(fā)揮其作用。ROS 通過增強蛋白綴合酶的活性來促進I-κB 的降解進而增強NF-κB 的活化。

3.2.2.3 活性氧與淋巴細胞凋亡 ROS 不僅可以促進淋巴細胞的活化和增殖，還可以調(diào)節(jié)淋巴細胞的凋亡。在免疫應(yīng)答晚期，僅小部分的T 細胞轉(zhuǎn)變成記憶細胞而存活，大部分的T 細胞發(fā)生凋亡來維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。淋巴細胞的凋亡可分為活化誘導(dǎo)的細胞凋亡(AICD)，及活化T 細胞的自發(fā)死亡(ACAD)。ROS 主要通過調(diào)控Fas(CD95)的表達來調(diào)節(jié)AICD。當(dāng)T 細胞處于靜息狀態(tài)CD95 處于低水平，當(dāng)T 細胞活化后ROS 通過調(diào)控NF-AT、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子來上調(diào)CD95 的表達［7］。當(dāng)Fas 與相應(yīng)配體FasL(CD95L)結(jié)合后，F(xiàn)as 受體三聚化而活化，激活的受體與FADD 結(jié)合，與Caspase-8 相互作用使后者激活，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，再激活一系列的Caspase-1，3，7 等，促進Fas 蛋白所在細胞的凋亡發(fā)生［11］。

ACAD 又稱受體饑餓性細胞凋亡或者線粒體途徑凋亡。其中Bcl-2 家族是ACAD 的主要作用因子。其中抗細胞凋亡的Bcl-2 家族成員的表達水平對細胞存活起決定性作用［18］。ROS 通過下調(diào)抗細胞凋亡的Bcl-2(BH-3 only)分子來增加線粒體膜的通透性，增加線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔道(MPTP)開放。ROS 可氧化通透性轉(zhuǎn)換蛋白來影響線粒體的陰離子通道。當(dāng)線粒體暴露于H2O2，線粒體膜電位下降，細胞色素C 釋放。而細胞色素C 的釋放又會導(dǎo)致更多的ROS 產(chǎn)生，這樣的正反饋放大過程加速細胞的凋亡。ASK1 是JNK 的上游激酶，生理情況下ASK1 處于相對還原的狀態(tài)。ROS 的增加可以使ASK1 得酶活性恢復(fù)，激活下游的JNK 途徑［4］，并且ROS 可以直接通過抑制GSTp 的磷酸化使其與JNK分離來恢復(fù)JNK 的活性促進細胞的凋亡。

不難發(fā)現(xiàn)ROS 調(diào)節(jié)淋巴細胞作用存在濃度差異，低濃度的增高產(chǎn)生正性信號有助于淋巴細胞的活化、增殖、分化;而高濃度的增高則產(chǎn)生負性信號，促進淋巴細胞的凋亡。

4 結(jié)語

隨著我們對ROS 了解的不斷深入，ROS 從無足輕重的氧化呼吸副產(chǎn)品轉(zhuǎn)變成細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要成分。甚至在機體免疫中也發(fā)揮著不可忽視的作用，在先天免疫中不僅是主要殺傷病原體的武器還可以調(diào)節(jié)自然殺傷細胞的活性;而在獲得性免疫，低濃度的ROS 可以刺激淋巴細胞活化、增殖、分化，促進免疫激活;而在高濃度的ROS 刺激下淋巴細胞趨于凋亡，促進免疫終結(jié)。現(xiàn)有多種疾病如腫瘤、哮喘、血液病、類風(fēng)濕等發(fā)病機制都與免疫有關(guān)。弄清楚ROS 對免疫系統(tǒng)的具體作用機制能為這些免疫相關(guān)的疾病提供新的治療思路。

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