郭紅玲
長沙市中醫(yī)醫(yī)院(長沙市第八醫(yī)院),湖南 長沙 410001
補腎膏等院內(nèi)膏方微生物限度檢查方法的建立
郭紅玲
長沙市中醫(yī)醫(yī)院(長沙市第八醫(yī)院),湖南 長沙 410001
目的:建立我院膏方微生物限度檢查方法。方法:根據(jù)2010版 《中國藥典》規(guī)定,對我院補肺膏等10個基礎膏方進行微生物限度檢查方法的驗證。結果:補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、糖尿病膏、溫陽培補膏等4種膏方具有一定的抑菌作用,其余6種膏方無抑菌作用。結論:補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、糖尿病膏、溫陽培補膏4種膏方采用培養(yǎng)基稀釋法檢查其微生物限度;補腎膏、三仙滋補膏、益智安神膏、滋陰潤燥膏、兒童健脾開胃膏、培元固衛(wèi)膏6種基礎膏方用常規(guī)平皿法檢查微生物限度。
膏方;微生物限度;方法建立
膏方又稱 “膏滋”或 “煎膏”,是最古老的劑型之一[1],多具有滋補,預防與治療作用,特別是對于亞健康與體弱多病者的調養(yǎng)效果顯著。隨著生活水平的不斷提高,人們對健康意識不斷增強,中醫(yī)藥養(yǎng)生知識的大量普及[2],使膏方在各地區(qū)也越來越得到大眾的認可。
目前,各醫(yī)院制作的膏方無統(tǒng)一質量控制標準,且文獻對膏方質量控制的報道不多,特別是微生物方面的文獻更少[3]。然而,醫(yī)院膏方的制作多采用手工傳統(tǒng)制作方法,容易受操作器具、原輔料及環(huán)境微生物污染,有必要對醫(yī)院制作的基礎膏方建立相應的微生物限度檢驗方法,以確保衛(wèi)生學的安全性。根據(jù)2010版 《中國藥典》附錄的規(guī)定,在藥品進行檢驗前必須進行方法學驗證。故本實驗室根據(jù)2010版 《中國藥典》一部附錄要求,查閱相關文獻[4-7],對我院補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、糖尿病膏等10種基礎膏方進行微生物限度檢測方法摸索,建立了我院基礎膏方微生物限度檢驗方法。
1.1 儀器 立式壓力蒸汽滅菌器 (湖南衡陽金一帆制藥設備實業(yè)有限公司);XPX-150型生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司);MJ-160-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱 (武漢武昌實驗儀器廠);紫外儀 (上海安亭電子儀器廠)。
1.2 材料
1.2.1 菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)22102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌[CMCC(F)9003],均由中國藥品生物制品檢定所提供。
1.2.2 培養(yǎng)基 膽鹽乳糖增菌液(批號:120627)、玫瑰紅鈉瓊脂(批號:120522)、營養(yǎng)瓊脂(批號120423)、營養(yǎng)肉湯(批號:121205)為北京三藥科技開發(fā)公司產(chǎn)品;改良馬丁 (批號:120215)、改良馬丁瓊脂 (批號:121025)為杭州微生物試劑公司產(chǎn)品。
2.1 菌液的制備 按照2010版《中國藥典》一部附錄ⅫⅠ[7]要求制備。
2.2 供試液的制備 取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,用勻漿儀混勻,制成1∶10的供試液。
2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證方法 (平皿法)
2.3.1 試驗組 取“2.1”項下菌液1m l和“2.2”項下1:10供試液1ml,注入同一直徑為90mm的平皿中,立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20ml,平行制備2個平皿。
2.3.2 菌液組 分別取“2.1”中的每一種試驗菌加入培養(yǎng)皿中,注入45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測定菌液菌落數(shù)。將以上制備的培養(yǎng)皿,細菌置于30~35℃培養(yǎng)48小時;霉菌置于25℃培養(yǎng)72h,每日觀察測定菌液菌落數(shù)。
2.3.3 供試品對照組 取“2.2”項下1∶10供試液1m l,注入培養(yǎng)皿中,立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20m l,測定供試品本底菌落數(shù)。
2.3.4 稀釋劑對照組 取“2.1”項下菌液1m l和“2.2”項下稀釋劑1ml,注入培養(yǎng)皿中,立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20ml,測定其菌落數(shù)。
2.4 培養(yǎng)基稀釋法
2.4.1 試驗組 取“2.2”項下1∶10的供試液的供試液2ml,每1m l供試液分別等量注入5個平皿中,每10個皿為一組。取“2.1”項下金黃色葡萄球菌菌液1m l,分別注入上述培養(yǎng)皿中,立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20m l,置于30~35℃培養(yǎng)48h,測定其菌落數(shù)。
2.4.2 菌液組 取“2.1”項下金黃色葡萄球菌試驗菌液1ml加入培養(yǎng)皿中,注入45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測定菌液菌落數(shù)。將以上制備的培養(yǎng)皿,細菌置于30~35℃培養(yǎng)48h,每日觀察測定菌液菌落數(shù)。
2.4.3 供試品對照組 取“2.2”項下1∶10供試液0.2ml,注入培養(yǎng)皿中,立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20m l,測定供試品本底菌落數(shù)。
2.3.4 稀釋劑對照組 取“2.1”項下菌液1ml和“2.2”項下稀釋劑0.2ml,注入培養(yǎng)皿中,立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20ml,測定其菌落數(shù)。
2.5 控制菌檢查方法驗證
2.5.1 供試液制備 同“2.2”項下供試液制備。
2.5.1.1 試驗組 取1∶10供試液10ml與“2.1”項下制備的大腸桿菌陽性菌液1ml注入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,置于35℃,培養(yǎng)18~24h后,取該培養(yǎng)物0.2m l,接種至5mlMUG培養(yǎng)基中,培養(yǎng),分別于5h、24h置366nm紫外光下觀察有熒光反應,沿試管壁加入數(shù)滴靛基質試液,液面呈玫瑰紅色。
2.5.1.2 陰性對照組 取1∶10供試液10ml與“2.1”項下制備的金黃色葡萄球菌陽性菌液1ml注入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,置于35℃,培養(yǎng)18~24h后,取該培養(yǎng)物0.2ml,接種至5m lMUG培養(yǎng)基中,培養(yǎng),分別于5、24h置366nm紫外光下觀察無熒光反應,沿試管壁加入數(shù)滴靛基質試液,液面呈本色,結果為陰性。
2.5.2 大腸菌群檢查方法驗證
2.5.2.1 供試液制備 取1∶10的溫陽培補膏供試液采用逐級稀釋法,稀釋為1∶100,1∶1000的供試液。
2.5.2.2 試驗組 分別取“2.5.2.1”項下1∶10,1∶100,1∶1000的供試液各1ml,分別加入10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中,并分別加入 “2.1”項下制備的大腸桿菌陽性菌液1m l,培養(yǎng)18~24h,觀察結果。
2.5.2.3 陰性對照試驗 取稀釋液1ml加入10ml乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時,觀察結果,結果為陰性。2.5.2.4 供試品檢查 分別取“2.5.2.1”項下1∶10,1∶100,1∶1000的供試液各1ml,分別加入10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中,按2010版 《中國藥典》一部附錄要求操作,觀察結果。
3.1 菌數(shù)回收率的計算
《中國藥典》2010版規(guī)定各試驗菌株的回收率(%)均得大于70%。
3.2 常規(guī)平皿法驗證結果 用常規(guī)平皿法對10種膏方的細菌、霉菌與酵母菌計數(shù)的驗證,結果見表1。由表1可知,補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、糖尿病膏、溫陽培補膏四種基礎膏方用常規(guī)平皿法測定其枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率在70%以下,說明該四種基礎膏方對草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強;改用培養(yǎng)基稀釋法測定,其結果見表2,但白色念珠菌、大腸埃希菌及黑曲霉菌回收率均在70%以上,說明其對這3種菌無抑菌作用,可以用常規(guī)平皿法測定這三種膏方的霉菌與酵母菌。補腎膏、三仙滋補膏、益智安神膏、滋陰潤燥膏、兒童健脾開胃膏、培元固衛(wèi)膏6種基礎膏方用常規(guī)平皿法測定其細菌與霉菌及酵母菌計數(shù)驗證回收率均在70%以上,說明可以用常規(guī)平皿法對補腎膏、三仙滋補膏、益智安神膏、滋陰潤燥膏、培元固衛(wèi)膏、兒童健脾開胃膏進行細菌與霉菌及酵母菌的微生物限度測定。
3.3 培養(yǎng)基稀釋法驗證結果 用培養(yǎng)基稀釋法對補肺膏等4種基礎膏方的霉菌及酵母菌計數(shù)測定法進行驗證。有表2可知,枯草胞桿菌及金黃色葡萄球菌回收率均在70%以上,說明培養(yǎng)基稀釋法可以用于補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏和糖尿病膏的微生物限度測定。
3.4 控制菌檢查方法驗證結果 采用2010版《中國藥典》一部附錄方法對10種膏方的控制菌檢查方法進行驗證,結果均符合要求,結果表明可以采用常規(guī)法,對我院各膏方進行控制菌微生物限度檢查。
中藥膏方是自古以來就有的傳統(tǒng)中藥劑型之一,不僅是單純的補藥,兼有治療和預防,即 “祛病糾偏”的雙重療效,集補、調、療的綜合功效[8、9],在養(yǎng)生、慢性疾病及治未病方面起到良好的療效。隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏的加快,亞健康人群的不斷壯大及養(yǎng)生觀念的不斷加強,冬令膏方在我國越來越受到重視,但關于其質量控制的文獻報道較少,特別是微生物限度測定的更少。因膏方含藥味多,處方量大,在制作過程中可能會受到微生物污染,為了保證其安全,根據(jù)2010版《中國藥典》的要求,對我院自制的10種基礎膏方進行微生物限度測定的方法學驗證,建立了我院基礎膏方微生物限度測定的方法。
通過驗證試驗發(fā)現(xiàn),含有清熱解毒類、化痰止咳類中藥材的膏方,因部分藥材本身具有較強的抑菌作用,其加工制備后仍具有一定的抑菌作用。常規(guī)平皿法不能直接用于該類膏方的微生物限度測定,而選用培養(yǎng)基稀釋法測定。通過驗證,我院基礎膏方的霉菌與酵母菌檢查法基本都可以采用常規(guī)法測定。補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、溫陽培補膏、糖尿病膏等膏方的細菌檢查法需采用培養(yǎng)基稀釋法測定??刂凭鷻z查都可以采用2010版《中國藥典》規(guī)定的常規(guī)法進行。
通過對膏方微生物限度的測定方法的驗證,制定合適的膏方微生物限度測定方法,確保膏方在制作的過程中不被微生物污染,避免膏方在患者服藥的長期貯存中霉變而變質,保證患者用藥的安全性,為膏方質量控制的制定提供一定的基礎。
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R446.5
A
1007-8517(2015)11-0007-03
2015.04.02)
郭紅玲(1985.11),湖南東安人,碩士研究生,主要從事醫(yī)院制劑研究開發(fā)與檢驗。Tel:0731-85259157。