川崎病免疫功能和炎癥因子檢測(cè)及臨床意義

沈方方，章愛(ài)蓮，朱 雯，滕懿群

(嘉興市第二醫(yī)院，浙江 嘉興 314501)

川崎病免疫功能和炎癥因子檢測(cè)及臨床意義

沈方方，章愛(ài)蓮，朱 雯，滕懿群

(嘉興市第二醫(yī)院，浙江 嘉興 314501)

目的 分析川崎病免疫功能及炎癥因子，探討細(xì)胞免疫、體液免疫及炎癥因子在川崎病中的機(jī)制及臨床價(jià)值。方法 對(duì)56例川崎病患兒及50例健康對(duì)照組兒童測(cè)定免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4水平，用流式細(xì)胞儀免疫熒光法檢測(cè)CD3+T細(xì)胞百分比(CD3+%)、CD4+T細(xì)胞百分比(CD4+%)、CD8+T細(xì)胞百分比(CD8+%)、CD4+/CD8+、CD19+T細(xì)胞百分比(CD19+%)、自然殺傷細(xì)胞百分比(NK%)。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果 56例川崎病與50例健康對(duì)照組比較，CD8+%明顯降低，CD4+/CD8+比值倒置、CD19+%明顯升高，NK%降低，IgG升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為5.31、6.12、4.65、5.51、2.13，均P<0.01)。18例患兒急性期TNF-α、IL-6、IL-10較恢復(fù)期明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.59、2.60、2.53，均P<0.05)。急性期TNF-α、IL-6、IL-10在合并有冠脈損害組較無(wú)冠脈損害組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.13、2.77、6.11，均P<0.05)。結(jié)論 川崎病急性期存在細(xì)胞及體液免疫功能的紊亂，炎癥因子參與了川崎病的發(fā)病機(jī)制。尤其是冠脈損害的KD患兒炎癥因子顯著升高。

川崎??；淋巴細(xì)胞亞群；炎癥因子；腫瘤壞死因子α

川崎病(Kawasaki disease，KD)又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是一種急性、自限性的全身血管炎性疾病，1967年由日本Tomisaku Kawasaki首次報(bào)道。一般認(rèn)為它是一種自身免疫性疾病[1]。但是對(duì)川崎病患者細(xì)胞免疫和體液免疫功能異常的研究還沒(méi)有一致的結(jié)論[2-3]。冠狀動(dòng)脈病變是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥，該病已逐漸取代風(fēng)濕熱成為我國(guó)小兒后天性心臟病的主要原因之一。明確該病的病因?qū)τ贙D的診斷、特異性治療及預(yù)防至關(guān)重要。KD的病因及發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清晰?？赡芘c以下因素有關(guān)，包括感染、遺傳易感、病毒以及細(xì)菌超抗原致病學(xué)說(shuō)等。關(guān)于KD發(fā)病機(jī)制的研究，目前主要集中于發(fā)病急性期的免疫系統(tǒng)高度激活和(或)免疫功能紊亂導(dǎo)致的血管炎損害。但關(guān)于淋巴細(xì)胞亞群、免疫球蛋白及炎癥因子等在KD急性期改變的研究結(jié)論仍不一致[4-5]。本研究通過(guò)檢測(cè)免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、IgA、補(bǔ)體C3、C4，T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)及炎癥因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)在KD急性期的變化，進(jìn)一步探討免疫細(xì)胞、免疫球蛋白及免疫炎癥分子在KD發(fā)病機(jī)制中的作用，為臨床及時(shí)診斷、合理治療KD及預(yù)防冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)并發(fā)癥提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

KD及冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張的診斷參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》。收集2012年1月至2014年12月在嘉興市第二醫(yī)院確診為KD的臨床資料56例為KD組，同期門診健康體檢者50例為對(duì)照。兩組病例均簽署知情同意書，且通過(guò)院倫理委員會(huì)同意該項(xiàng)研究。KD患兒中男性患兒為35例，女性患兒21例，男女比例為1.67：1；年齡在4個(gè)月～13.5歲，平均年齡為4.2±1.6歲。無(wú)冠脈損害(non-CAL)組48例，合并冠脈損害(CAL)組8例。

1.2 研究方法

采集56例KD患兒及健康對(duì)照組50例，入院次日(所有均未開始使用IVIG及阿司匹林治療)靜脈血測(cè)定淋巴細(xì)胞亞群：流式細(xì)胞儀為BD(Becton and Dickinson Company)的FACS CantoII，采用四色熒光標(biāo)記技術(shù)。取新鮮全血50μL與試劑混勻后，4℃下避光孵育20min，然后加入溶血素2mL，再室溫避光10min，待溶解紅細(xì)胞后加緩沖劑離心5min洗滌2次，最后棄上清液，上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)，用Diva軟件分析。外周血測(cè)定免疫球蛋白。

炎癥因子的測(cè)定：分別采集KD患兒18例(另2例治療過(guò)程中轉(zhuǎn)上級(jí)醫(yī)院)IVIG治療前，治療后1周(恢復(fù)期)及正常健康兒童20例為對(duì)照組靜脈血2mL，分離血清-80℃冰箱待用。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定TNF-α、IL-6、IL-10，試劑盒購(gòu)于上海巧伊生物有限公司，美國(guó)thermo scientific全自動(dòng)酶標(biāo)儀分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有資料處理用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，采用2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞亞群比較

KD患兒CD8+細(xì)胞比例明顯降低，CD4+/CD8+比值倒置，CD19+比例明顯升高，NK比例降低，與對(duì)照組比較均有顯著性差異(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 免疫球蛋白及補(bǔ)體比較

KD患兒IgG、C3較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.3 炎癥因子測(cè)定

TNF-α、IL-6、IL-10濃度在KD急性期、恢復(fù)期較對(duì)照組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；IL-6在KD恢復(fù)期較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 KD急性期、恢復(fù)期與對(duì)照組TNF-α、IL-6、IL-10濃度比較(pg/mL)

Table 3 Comparison of TNF-α, IL-6 and IL-10 between KD acute phase, KD recovery phase and control group(pg/mL)

2.4 冠脈損害與無(wú)冠脈損害炎癥因子濃度比較

TNF-α、IL-6、IL-10濃度在合并有CAL患兒較non-CAL均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 CAL組與non-CAL組 TNF-α、IL-6、IL-10濃度比較(pg/mL)

Table 4 Comparison of TNF-α, IL-6 and IL-10 concentr￣ations between CAL group and non-CAL group(pg/mL)

3 討論

3.1 淋巴細(xì)胞在川崎病發(fā)病機(jī)制中的作用

KD的發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，目前研究主要集中于機(jī)體免疫失調(diào)以及由此導(dǎo)致的多系統(tǒng)炎癥性損傷[6-7]。T細(xì)胞異?；罨荎D免疫系統(tǒng)激活導(dǎo)致血管免疫損傷的始動(dòng)環(huán)節(jié)和關(guān)鍵步驟。T淋巴細(xì)胞活化是體內(nèi)特異性免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)，在KD急性期和亞急性期，異?；罨腡細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，如IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α等，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞又可能成為新抗原，刺激B細(xì)胞分泌自身抗體，從而使內(nèi)皮細(xì)胞損害加重。淋巴細(xì)胞及其亞群在機(jī)體維持正常的免疫功能中有重要作用。CD4+細(xì)胞可以促進(jìn)體液和細(xì)胞免疫，CD8+細(xì)胞則抑制其反應(yīng)，正常情況下，CD4+/CD8+比值維持動(dòng)態(tài)平衡，以保持機(jī)體免疫功能穩(wěn)定，如果T細(xì)胞總數(shù)或CD4+/CD8+比值發(fā)生改變，則引起細(xì)胞免疫功能失調(diào)，發(fā)生一系列的病理變化。因此CD4+與CD8+T細(xì)胞的平衡在抑制腫瘤、抗感染和自身免疫病中起著重要作用。B細(xì)胞通過(guò)識(shí)別抗原后分泌免疫球蛋白進(jìn)而介導(dǎo)體液免疫。CD19抗原是B淋巴細(xì)胞表面的特異性抗原，CD19抗原表達(dá)的量能夠反映總B細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞對(duì)T、B細(xì)胞有協(xié)調(diào)作用，同時(shí)還能抑制B細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)抗體的產(chǎn)生。

本研究發(fā)現(xiàn)KD患兒CD8+細(xì)胞比例明顯降低，CD4+/CD8+比值倒置，CD19+比例明顯升高，NK比例降低，與對(duì)照組比較均有顯著性差異。提示KD急性期免疫失調(diào)，CD8+抑制細(xì)胞功能相對(duì)低下，從而導(dǎo)致CD4、CD8比例失衡，NK細(xì)胞比例降低，對(duì)B淋巴細(xì)胞的抑制作用減弱，B細(xì)胞功能亢進(jìn)，IgG升高，從而參與全身多系統(tǒng)損傷。與丁艷等[4]研究結(jié)果相符。

淋巴細(xì)胞亞群及免疫球蛋白在KD無(wú)冠脈損害組及合并有冠脈損害組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但筆者發(fā)現(xiàn)合并有冠脈損害組IgG水平明顯降低或明顯升高，提示合并有冠脈損害者其免疫系統(tǒng)更加紊亂。但本研究病例數(shù)較少，仍需進(jìn)一步大樣本研究。

3.2 炎癥因子在川崎病發(fā)病機(jī)制中的作用

多種炎癥因子參與KD的發(fā)生發(fā)展[6]。IL-6主要由活化的單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞等分泌，為一種促炎細(xì)胞因子，它可促進(jìn)B細(xì)胞分化Ig的分泌和再次免疫應(yīng)答，促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，協(xié)同Ig增強(qiáng)CTL中穿孔素基因表達(dá)，并增加T細(xì)胞IL-2產(chǎn)生和IL-2R表達(dá)。IL-10是具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它是T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答引起單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞異?；罨?，激活B細(xì)胞后釋放出來(lái)的一種炎性反應(yīng)抑制因子。受損血管內(nèi)皮在其刺激下，誘導(dǎo)血液中活化的淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞及血小板向受損血管表面聚集，引起血管壁更深的免疫損傷。TNF-α：KD急性期血漿TNF-α水平顯著增高，作為一種主要的促炎性反應(yīng)因子，高水平的TNF-α直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)甚至內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和壞死，使血管屏障作用嚴(yán)重破壞[8]。臨床研究已經(jīng)證實(shí)KD急性期存在TNF-α、白細(xì)胞介素等致炎因子的升高，而且升高的程度與冠狀動(dòng)脈瘤及以后冠狀動(dòng)脈狹窄的形成有關(guān)[9]。Hui-Yuen等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了TNF-α是冠狀動(dòng)脈損害形成的必要條件。

本研究發(fā)現(xiàn)KD患兒急性期TNF-α、IL-6、IL-10較恢復(fù)期及健康對(duì)照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。急性期TNF-α、IL-6、IL-10在合并有冠脈損害組較無(wú)冠脈損害組均明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往研究相一致[5]。提示炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10在川崎病的發(fā)生發(fā)展中，尤其是CAL中有重要作用。因此，在川崎病的患兒中早期檢測(cè)上訴炎癥因子，為早期診斷及治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

KD患兒存在免疫紊亂，多種炎癥因子參與KD的發(fā)展，而作為最活躍的致炎因子和炎癥因子，TNF-α受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。Hui-Yuen等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TNF-α在全身性的急性炎癥反應(yīng)后局限至冠狀動(dòng)脈，TNF-α可使冠狀動(dòng)脈淋巴細(xì)胞募集，導(dǎo)致彈力纖維降解，血管壁受損，導(dǎo)致川崎病特征性CAL。由此推斷針對(duì)TNF-α的抗TNF-α治療可以減輕炎癥反應(yīng)和保護(hù)冠狀動(dòng)脈損傷。Son等[10]及Ohashi等[11]學(xué)者發(fā)現(xiàn)在靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)和甲潑尼龍抵抗的川崎病病例中使用抗TNF-α，如英夫利昔單抗有明顯臨床療效且是安全的。因此，應(yīng)用抗TNF-α治療為IVIG無(wú)反映型川崎病的治療提供了新的前景。

[1]Yeung R S.Kawasaki disease: update on pathogenesis[J].Curr Opin Rheumatol, 2010, 22(5):551-560.

[2]Suzuki H, Suenaga T, Takeuchi T,etal. Marker of T-cell activation is elevated in refractory Kawasaki disease[J].Pediatr Int,2010,52(5):785-789.

[3]Franco A, Shimizu C, Tremoulet A H,etal. Memory T-cells and characterization of peripheral T-cell clones in acute Kawasaki disease[J].Autoimmunity,2010,43(4):317-324.

[4]丁艷,尹薇,熊越華,等.川崎病患兒免疫功能的檢測(cè)及臨床價(jià)值[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2012,16(9):588-592.

[5]韓云坤,孫冰,李麗紅,等.川崎病T細(xì)胞免疫及細(xì)胞因子變化的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011,15(9):1533-1536.

[6]Giordani L, Quaranta M G, Marchesi A,etal.Increased frequency of immunoglobulin (Ig)A-secreting cells following Toll-like receptor (TLR)-9 engagement in patients with Kawasaki disease[J].Clin Exp Immunol,2011, 163(3):346-353.

[7]Ikeda K, Yamaguchi K, Tanaka T,etal.Unique activation status of peripheral blood mononuclear cells at acute phase of Kawasaki disease[J].Clin Exp Immunol, 2010,160(2):246-255.

[8]閆輝,杜軍保.抗腫瘤壞死因子α治療川崎病的研究進(jìn)展[J].中華兒科雜志,2015,53(1):73-75.

[9]Zhang H, Park Y, Wu J,etal. Role of TNF-alpha in vascular dysfunction[J].Clin Sci,2009, 116(3):219-230.

[10]Son M B, Gauvreau K, Burns J C,etal. Infliximab for intravenous immunoglobulin resistance in Kawasaki disease: a retrospective study[J].J Pediatr, 2011,158(4):644-649.

[11]Ohashi R, Fukazawa R, Watanabe M,etal. Etanercept suppresses arteritis in a murine model of Kawasaki disease: a comparative study involving different biological agents[J].Int J Vasc Med,2013,2013:543141.

[專業(yè)責(zé)任編輯：肖延風(fēng)]

Immune function and inflammatory factor examination and their clinical significances in Kawasaki disease

SHEN Fang-fang, ZHANG Ai-lian, ZHU Wen, TENG Yi-qun

(JiaxingSecondHospital,ZhejiangJiaxing314501,China)

Objective To analyze the immune function and inflammatory factors in Kawasaki disease (KD) and explore the pathological mechanism and clinical value of cellular immunity, humoral immunity and inflammatory factors in KD. Methods The serum IgG, IgM, IgA and C3, C4 levels were detected in 56 children with DK and 50 healthy controls. Flow cytometry was used to analyze the proportion of CD3+T (CD3+%), CD4+T (CD4+%), CD8+T (CD8+%), CD4+/CD8+, CD19+T (CD19+%) and NK (NK%). ELISA was used to detect TNF-α, IL-6 and IL-10. Independentt-testwas adopted to analyze data. Results Compared with 50 healthy controls, CD8+% decreased significantly, the ratio of CD4/CD8 inverted, CD19+% increased obviously, NK% declined and IgG rose in 56 cases of KD with statistical significance (tvalue was 5.31, 6.12, 4.65, 5.51 and 2.13, respectively, allP<0.01). In the acute phase, the levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 were significantly higher than those in the recovery phase (tvalue was 2.59, 2.60 and 2.53, respectively, allP<0.05). In the coronary arterial lesion (CAL) subgroup, the levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 were higher than those in the non-CAL subgroup, and the differences were significant (tvalue was 4.13, 2.77 and 6.11, respectively, allP<0.05). Conclusion The cellular immunity and humoral immunity disturbances occur in acute phase of KD, and inflammatory factors are important in the pathogenesis of the KD. KD cases with CAL have especially higher level of inflammatory factors.

Kawasaki disease (KD); lymphocyte subset; inflammatory factors; TNF-α

2015-02-16

嘉興市科技局資助項(xiàng)目(2012AY1071-12)

沈方方(1984-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事兒童風(fēng)濕免疫疾病診療工作。

滕懿群，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.029

R725

A

1673-5293(2015)06-1201-03