不同消毒方法對變形鏈球菌在牙本質片上黏附的影響

苗 燕 王宏峰 郝玉慶.鄭州市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，河南鄭州 45005；.四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室，四川成都 6004

不同消毒方法對變形鏈球菌在牙本質片上黏附的影響

苗 燕1王宏峰1郝玉慶2
1.鄭州市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，河南鄭州 450052；2.四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室，四川成都 610041

目的比較3種消毒方法對變形鏈球菌（S.mutans）在人牙本質片上黏附的影響，為牙體標本消毒提供參考。方法制備人牙本質片60個，隨機均分為3組，每組20個，采用不同的方法消毒。第1組：高壓蒸汽滅菌30 min；第2組：10%福爾馬林溶液浸泡1周；第3組：3%過氧乙酸溶液浸泡1周。將不同消毒方法的牙本質片與S.mutans進行體外黏附實驗，采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察牙本質片表面形態(tài)變化及S.mutans黏附量多少，并采用菌落形成單位計數法（CFU）計數S.mutans在不同消毒方法的牙本質表面的黏附量，用SPSS 13.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析。 結果 不同消毒方法的牙本質片在電子顯微鏡下表面形態(tài)無明顯變化，SEM顯示S.mutans在三組牙本質片上黏附變化比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=3.21，P＞0.05），CFU顯示S.mutans培養(yǎng)后3組黏附差異無統(tǒng)計學意義（F=3.29，P＞0.05）。結論3種消毒方法對體外研究細菌黏附于牙本質片影響甚微，目前高壓蒸汽滅菌法簡單、可靠、易于操作，應作為消毒方法的首選。

變形鏈球菌；黏附；消毒；牙本質片

齲病是發(fā)生于牙體硬組織，多因素影響下以細菌感染為主的慢性感染性疾病，齲病的始動因子是細菌在牙面黏附、定植，分泌酸性物質導致無機物脫礦及有機物崩解[1]。變形鏈球菌（Streptococci mutans，S.mutans）是致齲菌中的優(yōu)勢菌，與齲病的關系最為密切[2]。在口腔醫(yī)學科研及實驗教學等模擬口腔的體外黏附實驗中，常利用S.mutans與人或牛的離體牙及羥基磷灰石片等來研究細菌黏附力的大小。在仿生模擬操作中，離體牙的形態(tài)、質地及解剖形態(tài)是其他模擬材料所無法替代的[3]。但實驗中的離體牙來源于口腔，自身帶有大量的病原微生物，因此在實驗前對其消毒就很有必要[4]。因為這不僅可以保障實驗結果的真實可信穩(wěn)定可靠，而且對于操作者的安全也至關重要。但目前普遍的醫(yī)學工作者及臨床實習學生對離體牙消毒知識知之甚少[5]。目前離體牙的消毒主要是高壓蒸汽滅菌法、福爾馬林、戊二醛及過氧乙酸等化學液體消毒法等，但牙片的不同消毒方法對細菌的黏附有無影響目前報道較少。本實驗主要通過對S.mutans在不同消毒方法的牙本質片上黏附能力進行研究，以期為牙體標本消毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株、培養(yǎng)基及設備

S.mutans ATCC25175（血清型C），由口腔疾病研究國家重點實驗室（四川大學）提供。腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基（Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，England）；比濁儀（Becton Dickinson and Company，USA）；掃描電鏡（SEM）（Hitachi S-2460 N，Tokyo，Japan）；Melag-24型高壓蒸汽滅菌器（Melag，德國）；10%福爾馬林消毒液（湖北興銀河化工有限公司）；3%過氧乙酸（源樂，江西鍵寶醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人牙本質片的制備、分組及消毒 收集四川大學華西口腔醫(yī)院2008年3～4月因正畸需要而拔除的上頜第一前磨牙，取牙體完整無齲壞且根尖孔完全閉合的30顆牙齒，去盡牙齒表面的血污及牙周軟組織，生理鹽水反復沖洗后自然晾干。操作者戴醫(yī)用橡膠手套用慢速手機在持續(xù)噴水的狀態(tài)下于釉牙骨質界處截斷牙根，保留牙冠。將牙冠包埋并固定于其特制的底座中，在精密切削機上用特制的金鋼砂片在注水的條件下以500 r/min的低速削去牙冠釉質層，再按牙體長軸方向將近表層的牙本質切削成5 mm×5 mm×0.5 mm的牙本質薄片，選取60片形態(tài)較好，切面平整的牙本質片隨機分成3組，每組20片，分別采用不同的方法進行消毒。第1組：采用高壓蒸汽滅菌法，121℃滅菌，時間為30 min；第2組：10%福爾馬林溶液浸泡1周；第3組：3%過氧乙酸溶液浸泡1周。第2組和第3組消毒后的離體牙用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）反復蕩洗去除殘留消毒液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液準備 復蘇S.mutans菌株，接種于BHI血瓊脂平板上，37℃，80%N2、10%CO2、10%H2培養(yǎng)S.mutans 24 h，涂片鏡檢為純培養(yǎng)后，再接種于液體BHI液體培養(yǎng)基，生長時間同上，經形態(tài)學和生化試驗鑒定為純培養(yǎng)物，收集菌細胞，用BHI液體培養(yǎng)基調節(jié)菌液濃度為1×108cfu/mL備用。

1.2.3 細菌黏附實驗 將3組不同消毒方法的牙本質片各20個分別置于1 mL預先配制的菌液中，并加入8 mL的BHI培養(yǎng)基，37℃上述環(huán)境培養(yǎng)S.mutans 1 h后，每組分別取出10個，用無菌PBS液清洗牙本質片表面非附著菌塊，然后進行掃描電子顯微鏡標本制作。3組各剩下的10個牙本質用無菌PBS液清洗非附著細菌后置于5 mL生理鹽水的塑料離心管中，在超聲水浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）中以100 r/min振蕩2 min，洗滌液進行10倍系列稀釋為1×104cfu/mL后用微量取樣槍選擇能準確計數的最佳稀釋度樣液10 μL滴于BHI血瓊脂平板表面，均勻涂布開后厭氧培養(yǎng)24 h進行菌落形成單位計數，每個牙本質片涂布3個平板，取其平均值為菌落形成單位計數，并根據稀釋倍數換算成單位面積牙本質片上的菌落形成單位。

1.2.4 掃描電鏡標本制作 牙本質片室溫干燥，2.5%戊二醛固定2 h，梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每個梯度脫水10 min，液態(tài)CO臨界點干燥，鍍金，SEM下觀察S.mutans在牙本質片上的黏附差異。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包對實驗結果進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 牙本質表面形態(tài)和細菌黏附情況

SEM觀察見三組牙本質表面平整，形態(tài)清晰無破壞，牙本質小管直徑相近。在牙本質表面或牙本質小管內壁黏附有S.mutans。見圖1。3種不同消毒方法的牙本質片掃描電鏡下隨機各選取10塊10 μm×10 μm面積進行統(tǒng)計學分析顯示，結果顯示三組S.mutans黏附量比較差異無統(tǒng)計學意義（F=3.21，P＞0.05）。見表1。

2.2 三組細菌在牙本質片上黏附后培養(yǎng)定量測定

結果顯示：S.mutans在3種不同消毒方法的牙本質片上黏附差異無統(tǒng)計學意義 （F=3.29，P＞0.05）。見表1。

3 討論

S.mutans是目前公認的口腔致齲菌，致齲機制主要是通過其菌毛表面分布的大量大分子類物質，如葡萄糖基轉移酶（GTF）、脂磷壁酸（LTA）、表面蛋白等，黏附定植于牙面形成牙菌斑，在牙菌斑內發(fā)揮致齲作用，使牙齒脫礦，形成齲損。除非通過口腔衛(wèi)生措施將黏附的牙菌斑徹底清除，否則它將長期聚集于牙面并導致齲病和（或）牙周疾病。因此S.mutans在齲病的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用[6]，所以本實驗選擇S.mutans作為實驗用菌。

目前在模擬口腔的黏附實驗中，常用的底物多選擇羥基磷灰石和離體牙，雖然羥基磷灰石粉或片形態(tài)均一，易于消毒，但在質地、形態(tài)及仿生效果方面均不及離體牙。但離體牙來源于臨床患者口腔，拔除過程中常帶有大量的病原微生物，研究表明在離體牙的牙髓，根管及根尖可能存在大量的血源性病原體如：人類免疫缺陷病毒（HIV），乙肝病毒（HBV），丙肝病毒（HCV）及一些細菌性病原體[7]，在離體牙收集及將其磨切成牙本質片的操作過程中，往往是在無冷卻液的環(huán)境下進行，因此病原微生物可通過受損的黏膜皮膚或以水汽霧的形式等污染操作者，因此只有對離體牙進行有效的消毒才能及時去除感染源，切斷傳播途徑，才能保證操作者的安全[8-9]。牙片消毒的方法很多，最常用的是高壓蒸汽滅菌法，其他還有化學熱力滅菌，微波輻射滅菌[10-11]，液體消毒有2%堿性戊二醛溶液、3%過氧化氫溶液、過氧乙酸溶液、5.25%次氯酸鈉溶液，醋及煮沸消毒法，氣體消毒有環(huán)氧乙烷等，但牙片經不同消毒方法處理后S.mutans在上面的黏附有無差異目前鮮有報道。

在本實驗中采用常見的3種消毒方法：高壓蒸汽滅菌法、福爾馬林溶液及過氧乙酸溶液對牙本質片進行不同濃度不同時間的消毒，然后通過S.mutans體外黏附實驗觀察細菌在牙本質片上黏附變化。實驗結果顯示黏附牙片無論在掃描電鏡下觀察還是菌落計數法3種消毒方法的牙本質片上黏附的S.mutans差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在本實驗中影響細菌黏附差異主要存在于兩方面：細菌自身因素和消毒后的牙本質表面特性。相同的S.mutans黏附量就取決于消毒后的牙本質組成成分、硬度及表面粗糙度等[12]。為了最大限度地降低實驗誤差，在本實驗中所有的牙本質片都是經筆者親自磨切及拋光，所以黏附差異就決定于消毒后的牙本質成分及硬度的變化。實驗結果顯示細菌黏附量沒有明顯變化說明不同消毒方法對牙本質成分及硬度的影響變化不明顯。

消毒是指殺死病原微生物、但不一定能殺死細菌芽孢的方法。滅菌是指把物體上所有的微生物（包括細菌芽孢在內）全部殺死的方法，只有有效的消毒才能切斷疾病感染源和傳播途。在離體牙滅菌常采用的化學藥物消毒方法中，甲醛是一種無色有毒氣體，福爾馬林是甲醛在室溫下的水溶液，研究發(fā)現離體牙浸泡于10%的福爾馬林溶液7 d可有效達到滅菌的目的[13]，雖然福爾馬林是一種有效的滅菌劑，但同時它也具有細胞毒性和遺傳毒性，操作不慎可引起皮膚和眼睛的灼傷和腐蝕，經鼻腔吸入后可刺激上呼吸道，被國際癌癥研究機構認作是一種潛在的致癌物。長期接觸可引起鼻咽癌和髓系白血病發(fā)病概率的增加，因此實驗需要在通風櫥內進行，但這既不安全也不方便實驗的操作[14-15]。過氧乙酸溶液系廣譜、速效、高效滅菌劑，本品是一種強的氧化劑，可以殺滅一切微生物，對病毒、細菌、真菌及芽孢均能迅速殺滅，可廣泛應用于各種器具及環(huán)境消毒。0.2%溶液接觸物體10 min基本可達到滅菌目的。Hope等[9]發(fā)現離體牙浸泡于Gigasept PA（活性成分：過氧乙酸）中7 d可完全滅菌，是一種安全有效可替代福爾馬林作為離體牙消毒的方法，但Gigasept PA主要用于醫(yī)療器械的消毒，不易獲得。Tijare等[4]認為醋作為家庭用品，容易得到，易于操作，也可達到消毒離體牙的目的，也可取代福爾馬林用于離體牙的消毒。但其他的消毒液如次氯酸鈉、過氧化氫、戊二醛等都不能達到百分百滅菌的效果。環(huán)氧乙烷低溫滅菌常實用于貴重、精密、怕熱怕濕物品的滅菌[16]，但研究發(fā)現[17-18]如果單純依賴環(huán)氧乙烷消毒離體牙，無論在30℃或60℃都可以檢測到孢子的存在，所以在消毒之前必須采用其他辦法消除牙齒上來自于血液中的病原菌。過量接觸環(huán)氧乙烷會引起溶血、過敏反應、細胞突變等，離體牙上殘留的環(huán)氧乙烷會對實驗操作者具有很大的危害。γ輻射消毒離體牙無高溫高壓，無氣體及化學物質的加入，消毒后對牙齒的納米力學性能方面沒有影響，但能否達到徹底殺滅病原微生物還有待進一步研究。

采用溶液浸泡消毒，對溶液的濃度及浸泡時間都要有嚴格的要求，本實驗采用的溶液濃度低，浸泡時間短，不影響實驗觀察效果，但若過長時間的浸泡就有可能會引起牙齒理化性質的改變，況且浸泡消毒后牙本質片上殘留的消毒液去除也比較麻煩，如果去除不徹底就會殺滅實驗用菌，對細菌的黏附結果產生影響。高壓蒸汽滅菌是目前認為最為有效可靠、安全且易于操作的滅菌方法，這需要121℃，至少15 min就可達到滅菌目的，無論是實驗研究或是臨床離體牙消毒操作都易于進行，應為首選，值得推廣[19]。但對于銀汞充填的牙齒應避免高壓蒸汽滅菌，因為在高壓排氣時汞蒸汽可釋放于空氣中，而引起污染，另外要避免體外實驗中離體牙反復的高壓蒸汽消毒，因為這可能影響牙齒的機械性能，導致牙齒變脆而易折斷[20]。

在體外大量模擬口腔的相關實驗中，如何選擇一種安全方便易于操作而又不影響離體牙自身特性的消毒方法，還需要我們做進一步深入的研究。

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Influence of different sterilization on adhension of streptococci mutans to dentin slices

MIAO Yan1WANG Hongfeng1HAO Yuqing2
1.Department of Operative and Endodontics,Zhengzhou Stomatological Hospital,He'nan Province,Zhengzhou 450052, China;2.State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Sichuan Province,Chengdu 610041,China

ObjectiveTo compare the influence of 3 different sterilization methods on adherence of S.mutans to dentin slices.Methods 60 dentin slices were randomly divided into three groups with 20 specimens in each group,they were given 3 different sterilization methods.The first group of detin slices was disinfected by autoclaving for 30 min;the second group was immersed in 10%formalin solution for 1 week;and the third group was immersed in 3%peracetic acid for 1 week.The quantification of attached S.mutans on the surfaces of different dentin was assayed by means of scanning electron microscope (SEM)and clone forming unit (CFU)method in vitro.Results There was no obvious change in morphology among the three groups of dentin slices under the electron microscope.The quantification of attached S.mutans was no statistically significant difference among the three groups under SEM(F=3.21,P＞0.05),and there was no statistically significant difference from CFU after bacterial culturer(F=3.29,P＞0.05).Conclusion Little effect is observed in the test of bacterial adhesion to dentin slices of different sterilization methods.So far,autoclaving is seen as the simple and reliable sterilization method.

S.mutans;Adhesion;Disinfect;Dentin slices

R187

A

1673-7210（2015）03（c）-0114-04

2014-12-15本文編輯：蘇 暢）

苗燕（1977.2-），女，河南內鄉(xiāng)人，碩士研究生；研究方向：齲病病因及其防治。