MiRNA與血小板活性的研究進(jìn)展：一個(gè)新的評(píng)估抗血小板治療效果的潛在生物標(biāo)志物

林澤明，劉新通

當(dāng)今心腦血管疾病已成為人類非自然死亡的首要因素?？寡“逅幬锉粡V泛地應(yīng)用于心腦血管缺血性疾病的二級(jí)預(yù)防。盡管抗血小板治療方案的有效性已被證實(shí)，但患者對(duì)抗血小板藥物的反應(yīng)性不盡相同，心腦血管意外在二級(jí)預(yù)防中的再發(fā)占有一定比例。因此，在抗血小板的藥物治療中，有效地評(píng)估并平衡血栓形成與出血的風(fēng)險(xiǎn)尤為重要。目前臨床上實(shí)施的抗血小板治療方案中亟需一個(gè)恰當(dāng)?shù)闹虚g指標(biāo)，以及時(shí)地指導(dǎo)治療劑量和治療時(shí)間的調(diào)整，使治療效益最大化。

自1993年發(fā)現(xiàn)首個(gè)微RNA（microRNA，miRNA）[1]至今，關(guān)于miRNA與疾病關(guān)系的研究進(jìn)行得如火如荼，為許多難治病的診療提供了新的方法。血小板活性在心腦血管疾病中起著十分重要的作用。若能進(jìn)一步揭示miRNA與血小板活性的關(guān)系，相關(guān)疾病的防治定能得到長足的發(fā)展。

1 miRNA的概述

miRNA是一種普遍存在于生物體內(nèi)高度保守的非編碼小RNA分子（約22個(gè)核苷酸），以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合mRNA，參與調(diào)控mRNA及基因表達(dá)過程中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。作用機(jī)制主要為：切割mRNA長鏈；縮短mRNA多聚腺苷尾以降低其穩(wěn)定性；降低mRNA在核糖體內(nèi)翻譯蛋白的效率[2]。由此看出，miRNA在調(diào)控基因表達(dá)方面主要起抑制作用。近年，發(fā)現(xiàn)大量的miRNA，目前miRNA數(shù)據(jù)庫（http：//mirbase.org）已收錄了1881種人類miRNA。

miRNA是生物體進(jìn)行正常生命活動(dòng)的一個(gè)重要因素。miRNA的異?？蓪?dǎo)致疾病的發(fā)生；疾病的發(fā)生在一定程度上也體現(xiàn)在miRNA的異常表達(dá)上。首個(gè)被發(fā)現(xiàn)與miRNA相關(guān)的疾病是慢性淋巴細(xì)胞白血病[3]。隨后，在許多疾病發(fā)生的過程中都找到了相應(yīng)的特異性表達(dá)的miRNA[4-5]。目前，已逐漸揭開miRNA與許多疾病的關(guān)系，收錄相關(guān)研究結(jié)果的數(shù)據(jù)庫miR2Disease（http：//www.mir2disease.org）也得以建立。

2 MiRNA在血小板及血漿含量豐富且十分穩(wěn)定

血小板是一種由骨髓巨核細(xì)胞生成的盤狀的、無核的細(xì)胞碎片，它對(duì)維持血流穩(wěn)定及調(diào)控血栓形成有著重要的作用[6-7]。盡管人類血小板中缺少DNA，卻含有大量不同種類的miRNA[6]。Landry等[6]通過微陣列芯片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了大量的血小板miRNA（共219種）。隨著miRNA檢測(cè)技術(shù)（如深度測(cè)序法）的發(fā)展，更多的血小板miRNA逐漸為人們所知。Osman等[8]檢測(cè)了281種血小板miRNA并列出了其中含量最豐富的20種（表1）。血小板激活時(shí)所釋放到血漿的微粒中也包含了大量的miRNA[9]，其中miR-223尤為豐富[8]。

miRNA不僅種類和含量十分豐富，它們?cè)谘獫{、血清中也十分穩(wěn)定。Chen等[10]從不同人群提取血清樣本，經(jīng)過各種嚴(yán)苛的處理（包括煮沸、反復(fù)冷凍、室溫長時(shí)間放置、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、RNase、DNase）后使用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miRNA，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)處理的血清檢測(cè)結(jié)果差異無顯著性，且血漿miRNA在健康中國人種的個(gè)體差異性并不顯著。

3 miRNA參與血小板的形成

miRNA在干細(xì)胞分化及骨髓各系細(xì)胞生成和成熟的過程中的重要性[11-12]，以及某些miRNA在血小板生成過程中的作用被逐漸被揭開。miR-155能結(jié)合并抑制與骨髓細(xì)胞分化相關(guān)的mRNAs從而阻礙造血干細(xì)胞分化[11]；miR-28能靶向結(jié)合促血小板生成素受體，其表達(dá)抑制CD34+細(xì)胞來源的巨核細(xì)胞的最終分化，且在骨髓增生疾病患者的血小板中過度表達(dá)[13]；miR-150表達(dá)上調(diào)能促使巨核-血紅細(xì)胞前體細(xì)胞向巨核細(xì)胞系而非紅細(xì)胞系方向分化[12]。有研究者認(rèn)為，miR-146a同樣與巨核細(xì)胞系祖細(xì)胞的形成有所關(guān)聯(lián)，但具體作用仍存在爭(zhēng)議[14]。表2列出部分miRNA與血小板生成的關(guān)系。在血細(xì)胞生成的過程中，大部分miRNA主要起抑制作用[11，13，15]，但仍有許多與血小板相關(guān)的miRNA的作用機(jī)制有待被進(jìn)一步解析。

4 miRNA表達(dá)與血小板活性密切相關(guān)

miRNA參與調(diào)節(jié)血小板mRNAs、蛋白合成及激活，其表達(dá)與血小板活性有著密切的關(guān)系[6，17-18]。Gidlf等[19]通過RNA測(cè)序法，發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死患者與健康對(duì)照人群中表達(dá)具有顯著差異性的9種miRNA。其中8種在病變后表達(dá)下調(diào)；當(dāng)中miR-22、miR-185、miR-320b和miR-423-5p含量在血小板上層浮液中增加，但在血栓抽吸后減少，表明miRNA在血栓形成前后的表達(dá)有所差異。Osman等[8]則通過對(duì)比754種miRNA在血小板靜息及激活（凝血酶刺激1 h后）時(shí)的含量，發(fā)現(xiàn)了miR-15a、miR-339-3p、miR-365、miR-495、miR-98和miR-361-3p在血小板不同狀態(tài)下（激活與否）的含量差異具有顯著性（P＜0.001）。其中miR-15a和miR-339-3p在血小板激活狀態(tài)表達(dá)下調(diào)（分別降低2.5倍和1.4倍），其余4種則上調(diào)（miR-365：2倍；miR-495：1.9倍；miR-98：3倍；miR-361-3p：6.5倍）。該研究表明miRNA能反映血小板的激活狀態(tài)。Nagalla等[18]將受試者根據(jù)其血小板對(duì)腎上腺素的反應(yīng)性高低分成兩組，發(fā)現(xiàn)74種miRNA在兩組間的表達(dá)具有差異性；miR-200b：PRKAR2B、miR-495：KLHL5和miR-107：CLOCK之間的負(fù)相關(guān)性在隨后的體外試驗(yàn)中被進(jìn)一步得到確認(rèn)。

表1 血小板中含量最豐富的20種miRNA（從高到低排序）[8]*

此外，許多不同miRNA與血小板激活路徑相關(guān)。miRNA在調(diào)節(jié)P2Y12mRNA的表達(dá)上有著重要作用[6]；而miR-223可作為評(píng)估P2Y12受體抑制程度的潛在生物標(biāo)志物[20]；血小板miR-96則在調(diào)節(jié)囊泡相關(guān)膜蛋白8（VAMP8）中具有重要作用[17]。Leonard等[21]發(fā)現(xiàn)miR-376c在巨核細(xì)胞系中具有調(diào)控翻譯磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白的mRNA的作用，且miR-376c在不同人種中的表達(dá)差異造成了黑色人種血小板通過PAR4受體路徑激活的活性高于白色人種。

以上研究表明，許多miRNA在血小板激活前后的表達(dá)有著明顯差異，部分miRNA特異性參與調(diào)控血小板激活路徑的某個(gè)環(huán)節(jié)，論證了miRNA與血小板活性具有相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)中被檢測(cè)的血小板miRNA在種類及作用機(jī)制上不盡相同，提示這種相關(guān)性是體現(xiàn)在血小板激活的不同路徑的各個(gè)進(jìn)程中。

5 miRNA作為潛在的評(píng)估抗血小板藥物效力的生物標(biāo)志物

盡管現(xiàn)在已有一些方法被用來評(píng)估抗血小板治療中血小板活性，尚無一種是被認(rèn)為具有良好臨床應(yīng)用價(jià)值的金標(biāo)準(zhǔn)[22]?，F(xiàn)今評(píng)估血小板活性的方法大部分是基于血小板激活的某一條路徑提出的，如P2Y12路徑或COX-1活性。然而血小板激活不是一個(gè)單一的過程，而是通過多通道（且其中許多是相互平行的）來實(shí)現(xiàn)的[23]。因此，一種能夠良好評(píng)估抗血小板藥物對(duì)血小板活性作用的方法必須盡可能地覆蓋較多的血小板激活路徑。

miRNA與血小板的生成、mRNAs調(diào)控、蛋白合成和激活的各個(gè)過程息息相關(guān)[6，17]。血小板miRNA是否有可能作為一種潛在的評(píng)估抗血小板治療方案效果的生物標(biāo)志物呢？Willeit等[24]對(duì)9名健康志愿者（男性，＜40歲）進(jìn)行連續(xù)4周的抗血小板干預(yù)（wk0：空白；wk1：10 mg普拉格雷；wk2：10 mg普拉格雷+75 mg阿司匹林；wk3：10 mg普拉格雷+300 mg阿司匹林），以96孔板血小板凝集測(cè)定和血栓素A的形成（作為血栓素B的替代測(cè)量）來評(píng)估血小板功能，結(jié)果表明隨著聯(lián)用阿司匹林劑量的加大，血小板抑制現(xiàn)象更為明顯。相應(yīng)的，通過TaqMan custom plating service特制的方法在不同階段（day0/7/14/21）測(cè)定92種miRNA的含量（使用U6做參照），其中8種miRNA發(fā)生顯著變化，提示循環(huán)中的血小板miRNA能反映血小板激活的程度，血漿miRNA可在一定程度上評(píng)估抗血小板治療的效果。Shi等[20]篩選了33例慢性冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的患者［（60.91±7.73）歲，接受負(fù)荷劑量300 mg阿司匹林+300 mg氯吡格雷24 h或100 mg阿司匹林+75 mg氯吡格雷5 d］，根據(jù)其對(duì)氯吡格雷的反應(yīng)，以血小板活性參數(shù)（通過血管擴(kuò)張刺激磷蛋白磷酸化流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定）分為正常反應(yīng)組（血小板活性參數(shù)＜56.5%，n=17）和低反應(yīng)組（血小板活性參數(shù)＞56.5%，n=16），并測(cè)定兩組患者血清miR-223和miR-96含量。結(jié)果表明，雙抗治療方案中，血小板miR-223而非miR-96與血小板活性參數(shù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（Spearman r=-0.403，P=0.020），從而證明了人體內(nèi)存在能反映對(duì)抗血小板藥物治療反應(yīng)性的特異miRNA。

然而Christian Stratz等[25]在5名健康志愿者中，分5個(gè)不同階段抽取血液樣本（day0/1/3/9：空白；day10：口服單劑量阿司匹林500 mg 24 h后），隨后對(duì)不同階段樣本中血小板含量最豐富的20種miRNA[8]進(jìn)行分析，結(jié)果表明單劑量阿司匹林抗血小板并不影響血小板miRNA表達(dá)。與Willeit[24]和Shi等[20]的研究結(jié)果不同，他認(rèn)為miRNA的表達(dá)與抗血小板治療并無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。但該實(shí)驗(yàn)存在一定不足，如樣本量少和單劑量阿司匹林無法代表抗血小板治療。

近年來，在miRNA與血小板活性關(guān)系的大量研究中找到許多特異表達(dá)的miRNA，并揭示了miRNA在血小板激活的各個(gè)進(jìn)程中的作用機(jī)制，且miRNA可作為抗血小板治療方案中評(píng)估血小板活性的潛在生物標(biāo)志物的可能性。然而，將miRNA應(yīng)用于臨床樣本評(píng)估抗血小板治療方案效果的研究數(shù)據(jù)比較缺乏，且在miRNA對(duì)抗血小板藥物的反應(yīng)性方面仍未完全達(dá)至一致。

現(xiàn)況而言，需要更多的相關(guān)研究進(jìn)一步補(bǔ)充臨床樣本中miRNA對(duì)抗血小板藥物反應(yīng)性的數(shù)據(jù)。此外，除了著重于抗血小板過程中miRNA與血小板活性的定性研究，如何定量地評(píng)估兩者的關(guān)系并繪制具有臨床應(yīng)用價(jià)值的相關(guān)曲線顯得尤為重要。

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【點(diǎn)睛】

與現(xiàn)有評(píng)估抗血小板治療效果的方法相比，微RNA具有潛在的更好的臨床應(yīng)用價(jià)值。