卵巢漿液性腺癌血清miRNA差異表達(dá)及其臨床意義

汪春年，李征，方建晨，王紅衛(wèi)

（寧波市臨床病理診斷中心，浙江 寧波，315031）

卵巢漿液性腺癌血清miRNA差異表達(dá)及其臨床意義

汪春年，李征，方建晨，王紅衛(wèi)

（寧波市臨床病理診斷中心，浙江 寧波，315031）

目的探討卵巢漿液性腺癌血清中差異表達(dá)的miRNA并分析其臨床意義。方法使用基因芯片篩選差異表達(dá)的miRNA，6例卵巢漿液性腺癌患者和6例正常對(duì)照者血清，分別等量混合后作為漿液性腺癌組和正常對(duì)照組。通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，卵巢漿液性腺癌組血清中顯著差異表達(dá)的miRNA有43種，其中上調(diào)的有25種，下調(diào)的有18種。RT-PCR驗(yàn)證了miRNA-22、miRNA-93在卵巢漿液性腺癌患者血清中顯著上調(diào)，而miRNA-99b則顯著下調(diào)，與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論卵巢漿液性腺癌和正常人血清中存在著差異表達(dá)的miRNA，提示miRNA與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

卵巢癌；漿液性腺癌；微小RNA

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，早期不容易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)發(fā)現(xiàn)時(shí)已出現(xiàn)廣泛的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。漿液性腺癌是卵巢癌主要類型之一，目前臨床主要通過檢測(cè)血中CA125水平篩查卵巢癌。近年來研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA，miRNA）作為腫瘤抑癌基因或致癌基因來調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和功能，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和凋亡，以及在腫瘤的血管形成方面起到重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA在人外周血中穩(wěn)定表達(dá)，提示miRNA可能作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷。目前國內(nèi)文獻(xiàn)中，尚未見有關(guān)卵巢漿液性腺癌血清miRNA表達(dá)譜的研究，本文運(yùn)用基因芯片技術(shù)將卵巢漿液性腺癌患者與正常人血清中miRNA進(jìn)行比較，尋找其中差異性表達(dá)的miRNA，探討其在卵巢漿液性腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 選擇2013年1月~2014年8月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院12例卵巢漿液性腺癌患者（FIGO分期為ⅠA和ⅠB期）血清樣本以及12例正常婦女血清樣本，實(shí)驗(yàn)組取樣前未經(jīng)過放療、化療及免疫等其他治療。所有入選人群均知情同意后簽署同意書并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。每位入選者采取5mL靜脈血，在30分鐘內(nèi)通過高速離心分離，將分離得到的上層血清樣本轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，13000 g離心2分鐘，收集上清液。其中6例卵巢癌患者與6例正常對(duì)照的血清分別等量混合，進(jìn)行miRNA基因芯片檢測(cè)；其余各組6例血清樣本分別于-80℃凍存，進(jìn)行RT-PCR的miRNA驗(yàn)證。

1.2miRNA基因芯片檢測(cè)和分析 實(shí)驗(yàn)由聯(lián)川生物公司（http://www.lc-bio.com/）完成。使用LC Sciences基因芯片對(duì)混合血清進(jìn)行了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，利用激光掃描儀 （Gene Pix 4000B,Molecular Device）采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件（Media Cybernetics）進(jìn)行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。差異倍數(shù)大于2倍定義為差異表達(dá)。

1.3實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng) （RT-PCR）驗(yàn)證miRNA通過基于SYBR GreenⅠ的熒光定量PCR。首先，使用Norgen血清/血漿外泌體RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA的采集和純化。然后，來自血清的較小的RNA通過使用miScriptⅡRT Kit（Qiagen）生

成cDNA，使用ABI PRISM 7500 HT型熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。所用引物見表1。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0，所有的結(jié)果均用（）表示，進(jìn)行成組t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1卵巢漿液性腺癌血清miRNA差異表達(dá) 通過基因芯片測(cè)定了兩份混合血清標(biāo)本中miRNA表達(dá)譜，基于差異倍數(shù)大于2倍為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)43種差異表達(dá)的miRNA，其中25種miRNA上調(diào)，18種下調(diào)，見表2）。上調(diào)前5的miRNA分別為miRNA-22、miRNA-93、miRNA-4492、miRNA-2861、miRNA-21，下調(diào)前5的miRNA分別為miRNA-99b、miRNA-let-7a、miRNA-4267、miRNA-122-5p、miRNA-199a。

2.2血清miRNA-22，miRNA-93，miRNA-99b驗(yàn)證 為了進(jìn)一步明確血清miRNA差異表達(dá)結(jié)果的可靠性，通過RT-PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。獨(dú)立的6份漿液性卵巢腺癌（FIGO分期為ⅠA和ⅠB期）和6例正常對(duì)照組進(jìn)行血清miRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果見表3。漿液性卵巢腺癌患者血清中miRNA-22，miRNA-93明顯上調(diào)（P<0.05），而miRNA-99b在漿液性卵巢腺癌血清中顯著下調(diào) （P< 0.05）。這與miRNA基因芯片研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清中miRNA-22、miRNA-93在卵巢癌不同分期（ⅠA和ⅠB期）中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而miRNA-99b在卵巢癌不同分期中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表3 兩組血清miRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01

組別 n miRNA-22 miRNA-93 miRNA-99b正常對(duì)照組 6 1.18±0.66 0.75±0.22 1.03±0.29漿液性腺癌組 6 2.88±1.12**0.90±0.24**0.58±0.32*

表4 不同分期血清miRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

與ⅠA組比較*P<0.05

組別 n miRNA-22 miRNA-93 miRNA-99bⅠA 3 2.04±0.46 0.71±0.17 0.66±0.37ⅠB 3 3.72±0.90*1.10±0.07*0.51±0.31

3 討論

卵巢漿液性腺癌是卵巢癌最常見的病理類型，它的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多步驟、復(fù)雜的過程。卵巢癌的早期診療是影響預(yù)后最重要因素。腫瘤標(biāo)志物、腫瘤基因治療靶點(diǎn)成為新的研究熱點(diǎn)。目前國內(nèi)外關(guān)于miRNA與卵巢癌的研究已經(jīng)展開，并不斷深入。

芯片技術(shù)誕生以來，因其能夠在同一時(shí)間內(nèi)高通量、平行檢測(cè)大量基因的不同表達(dá)水平，所以被大量應(yīng)用于腫瘤研究。通過比較組織基因表達(dá)差異，篩選和發(fā)現(xiàn)候選基因，為腫瘤早期診斷和治療提供生物學(xué)依據(jù)。本研究通過基因芯片檢測(cè)卵巢漿液性腺癌患者血清miRNA差異表達(dá)，結(jié)果顯示，在腫瘤組和對(duì)照組間，一共有43種顯著差異的miRNA，包括miRNA-22、miRNA-93、miRNA-4492、miRNA-2861、miRNA-21、miRNA-99b、miRNA-let-7a、miRNA-4267、miRNA-122-5p、miRNA-199a等，這為今后研究打下來一定的基礎(chǔ)，為miRNA可能成為卵巢漿液性腺癌早期篩查的標(biāo)志物提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過RT-PCR驗(yàn)證卵巢漿液性腺癌患者血清中miRNA-22、miRNA-93、miRNA-99b的差異表達(dá)，證實(shí)了腫瘤血清中miRNA與正常人間存在著差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異表達(dá)的43種miRNA與國內(nèi)外研究報(bào)道基本一致[1-2]。但在某些卵巢癌組織或卵巢癌特定的細(xì)胞株中的研究結(jié)果與本文結(jié)果不甚一致。在以卵巢癌組織為研究對(duì)象中發(fā)現(xiàn)，與正常人類卵巢上皮細(xì)胞相比，miRNA-22在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miRNA-22在晚期卵巢癌細(xì)胞中下調(diào)更明顯[3]。miRNA-22被證明是卵巢癌轉(zhuǎn)移的抑制因素[4]。這與本文在血清中的結(jié)果不一致，可能與標(biāo)本類型不同有關(guān)。梁山輝等[5]報(bào)道，卵巢癌血漿中miR-22水平升高可能參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，miRNA-22與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的卵巢癌細(xì)胞中miRNA-22低表達(dá)，推測(cè)miRNA-22可能具有抑癌基因的作用。徐小麗等[6]報(bào)道，miRNA-22在乳腺癌中通過調(diào)控不同的靶基因，使其具有癌基因和抑癌基因雙重作用，調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。本文結(jié)果顯示，miRNA-22在卵巢癌血清中表達(dá)水平較正常人升高，且進(jìn)一步分析顯示血清中miRNA-22在卵巢癌不同分期中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故推測(cè)miRNA-22在卵巢癌中可能也具有多種不同的功能，預(yù)示著miRNA-22在卵巢漿液性腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，有待以后進(jìn)行大樣本的更深入的研究。

本文結(jié)果顯示，miRNA-99b在不同分期中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miRNA-99家族主要是通過調(diào)節(jié)靶基因SNF2H，從而發(fā)揮其抑癌基因作用[7]。

本文結(jié)果表明，許多miRNA參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，基因表達(dá)譜的差異使得每個(gè)患者具有不同的生物學(xué)特征。由于收集標(biāo)本分級(jí)分期不同等原因，所獲得結(jié)果可能與腫瘤發(fā)生的普遍規(guī)律存在差距，但是通過加大樣本量，或許可以更好的篩選腫瘤差異表達(dá)基因。實(shí)驗(yàn)顯示，眾多miRNA在卵巢漿液性腺癌中出現(xiàn)差異表達(dá)，說明miRNA在卵巢漿液性腺癌發(fā)生發(fā)展中起到了一定的作用。

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寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013A610227）