口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)

許　斌，陳　純?。ńK省無錫市中醫(yī)醫(yī)院口腔科，江蘇無錫214000）

口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)

許斌，陳純（江蘇省無錫市中醫(yī)醫(yī)院口腔科，江蘇無錫214000）

近年來對(duì)口腔扁平苔蘚（OLP）的研究越來越多，OLP的組織病理學(xué)表明角質(zhì)形成細(xì)胞和淋巴細(xì)胞與其發(fā)病有著重要關(guān)系，很多學(xué)者開始建立這兩種細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，尋找OLP的發(fā)病機(jī)制，本研究就最近幾年的研究狀況作以簡要概括，并對(duì)OLP的細(xì)胞培養(yǎng)模型提出一些研究設(shè)想．

口腔扁平苔蘚；角質(zhì)形成細(xì)胞；淋巴細(xì)胞；混合培養(yǎng)

0　引言

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是發(fā)生于口腔黏膜的一種慢性炎癥性疾病，其發(fā)病率為0．1%～4%［1］，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，但是有研究表明OLP是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾?。?］，其中以T淋巴細(xì)胞活化為主的細(xì)胞免疫失調(diào)是口腔發(fā)生病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］．但具體機(jī)制仍然不明確，使得OLP缺乏有效的治療方法，為此很多學(xué)者開始體外培養(yǎng)OLP相關(guān)細(xì)胞，模擬機(jī)體局部OLP的發(fā)病環(huán)境，探尋OLP的發(fā)病機(jī)制，尋求有效治療方法．

1　細(xì)胞培養(yǎng)

1．1角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方法目前主要有：組織塊培養(yǎng)法、以3T3細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)法、以膠原為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)法、氣?液交界面培養(yǎng)法、無血清培養(yǎng)法［4］．

張興洪等［5］證實(shí)了胰酶加dispase酶消化、限制性KC?FSM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)是制備和培養(yǎng)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的好方法．有學(xué)者比較了酶化法和直接分離法獲得口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞的效果，結(jié)果顯示酶催化法在獲得角質(zhì)形成細(xì)胞所用的時(shí)間、細(xì)胞的數(shù)量以及細(xì)胞在體外的生存時(shí)間方面要優(yōu)于直接法［6］．

1．2淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞（peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs）純化培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞常用的方法有：尼龍毛吸附法、補(bǔ)體細(xì)胞毒法、免疫磁珠法．前兩種方法得到的T淋巴細(xì)胞純度低且含有自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞，后一種方法得到的T淋巴細(xì)胞純度高但是費(fèi)用昂貴［7］．

李付廣等［8］根據(jù)不同細(xì)胞在特定培養(yǎng)基中的死亡時(shí)間不同而篩選出T淋巴細(xì)胞，該實(shí)驗(yàn)在低劑量IL?2的維持條件下利用細(xì)胞培養(yǎng)淘汰法獲得了初步純化的T淋巴細(xì)胞，該方法經(jīng)濟(jì)、操作簡單．

1．3角質(zhì)形成細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)目前關(guān)于OLP的角質(zhì)形成細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型的建立尚且不多．李琴等［9］成功建立了OLP角質(zhì)形成細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的體外混合培養(yǎng)模型，一定程度上模擬了人體局部OLP的發(fā)病環(huán)境．國外有學(xué)者從OLP患者口腔粘膜切取部分組織，分離得到角質(zhì)形成細(xì)胞后在無血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，從正常人外周血中分離得到單個(gè)核細(xì)胞，懸浮在含有L?谷氨酸和抗生素的RPMI?1640培養(yǎng)基中，再將單個(gè)核細(xì)胞在角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)的TNF?α、GMCSF、IL?1β等細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)更多的細(xì)胞粘附分子，從而增強(qiáng)外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖、遷移［10］．

2　對(duì)OLP細(xì)胞培養(yǎng)的討論

近年來對(duì)于OLP角質(zhì)形成細(xì)胞、淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的研究尚且不多，其中存在一些值得討論的問題．

2．1不同培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響OLP的細(xì)胞培養(yǎng)大部分采用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基．不過最近有學(xué)者分別用RPMI?1640培養(yǎng)基和IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)外周血樹突狀細(xì)胞（dentritic cell，DC），觀察不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞功能的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC在形態(tài)學(xué)、CD14和CD83的表達(dá)以及內(nèi)吞作用方面沒有太大的差異，但是用IMDM培養(yǎng)的DC低表達(dá)CD1a、IL?12，高表達(dá)IL?6、IL?8、IL?10，減少了對(duì)T細(xì)胞增殖的刺激作用，用IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC可能與誘導(dǎo)機(jī)體的免疫耐受有關(guān)［11］．

以上說明用RPMI?1640和IMDM培養(yǎng)細(xì)胞可以使同樣的細(xì)胞表現(xiàn)出不同的功能，目前IMDM有多種型號(hào)，如果采用不同型號(hào)的IMDM培養(yǎng)基在體外混合培養(yǎng)OLP角質(zhì)形成細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，結(jié)果是否會(huì)發(fā)生改變還需要進(jìn)一步地研究．

2．2培養(yǎng)基中離子及其濃度的改變對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響李習(xí)玲等［12］采用無血清無鈣離子的角質(zhì)形成細(xì)胞生長培養(yǎng)基，不加任何細(xì)胞因子和生長因子，僅僅通過改變培養(yǎng)基中的鈣離子濃度，調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的形成和分化，成功的對(duì)小鼠的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行了原代培養(yǎng)．

Takagi等［13］在培養(yǎng)應(yīng)用于臨床再生醫(yī)學(xué)的角質(zhì)形成細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，去掉傳統(tǒng)角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)鐵蛋白和金屬元素硒，對(duì)犬科口腔黏膜上皮細(xì)胞層的形成沒有明顯影響．

2．3PFT?α對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響張興洪等［14］取正常皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，證實(shí)一定劑量的P53抑制劑PFT?α可以減輕阿霉素對(duì)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷．口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)的有關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)只有小而圓的細(xì)胞才具有增殖能力［24］，如果在培養(yǎng)液中加入P53抑制劑PFT?α，會(huì)不會(huì)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生影響需要通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)．

綜上所述，OLP是發(fā)生于口腔黏膜的慢性炎癥，作為一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾?。?5］，OLP的發(fā)生發(fā)展與多種細(xì)胞因子密切相關(guān)．本研究對(duì)與OLP關(guān)系密切的主要細(xì)胞因子做了簡要概括，鑒于OLP與多種細(xì)胞因子有關(guān)，有些學(xué)者開始體外混合培養(yǎng)OLP角質(zhì)形成細(xì)胞與淋巴細(xì)胞，但是目前相關(guān)的研究尚且不多，OLP的發(fā)病機(jī)制以及很多問題都有待進(jìn)一步研究證實(shí)．

［1］Hirota SK，Moreno RA，Dos SC，et al．Analysis of a possible

association between oral lichen planusand drug intake．A controlled

study［J］．Med Oral PatolOral Cir Bucal，2011，16（6）：e750－e756．

［2］唐國瑤，周曾同．口腔黏膜病臨床治療Ⅳ．口腔扁平苔蘚的診斷

及治療進(jìn)展［J］．中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，41（11）：697－699．

［3］Zhong X，Tumang JR，Gao W，et al．PD?L2 expression extends beyond dendritic cells／macrophages to B1 cells enriched for V（H）11／V（H）12 and phosphatidylcholine binding［J］．Eur J Immunol，2007，37（9）：2405－2410．

［4］黃幾平．角質(zhì)形成細(xì)胞的分離培養(yǎng)和臨床應(yīng)用［J］．國外醫(yī)學(xué)：生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè)，2005，28（3）：164－167．

［5］張興洪，劉彥群，魏志平，等．人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的制備及體外培養(yǎng)［J］．徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，31（2）：111－113．

［6］Klingbeil MF，Herson MR，Cristo EB，et al．Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes［J］．Cell Tissue Bank，2009，10（3）：197－204．

［7］顧曉，楊尚琪，唐孝達(dá)．人外周血T淋巴細(xì)胞純化方法的比較［J］．江蘇臨床醫(yī)學(xué)雜志，2001，5（1）：25－27．

［8］李付廣，李沛，靳靜，等．外周血T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及鑒定［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2006，41（4）：605－607．

［9］李琴，杜觀環(huán)，唐國瑤．口腔扁平苔蘚相關(guān)細(xì)胞模型的建立［J］．上?？谇会t(yī)學(xué)，2011，20（1）：16－20．

［10］Yamamoto T，Nakane T，Osaki T．Themechanism ofmononuclear cell infiltration in oral lichen planus：The role of cytokines released from keratinocytes［J］．JClin Immunol，2000，20（4）：294－305．

［11］Chen C，Liu YL，Liang XL，et al．Effect of different culturemediums on the development ofmonocyte?derived dentritic cells［J］．Zhong?guo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2011，19（4）：1010－1014．

［12］李習(xí)玲，連小華，楊力，等．表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分化無血清培養(yǎng)方法的建立［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（13）：1342－1344．

［13］Takagi R，Yamato M，Murakami D，et al．Preparation of keratinocyte culture mediumfor theclinical applications of regenerative medicine［J］．JTissue Eng Regen Med，2011，5（4）：e63－e73．

［14］張興洪，劉彥群，魏志平，等．p53抑制劑PFT?α對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響［J］．中國皮膚性病學(xué)雜志，2011，25（5）：344－345，354．

［15］黃慧，姚本棧，湯惠忠．大鼠口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞體外連續(xù)培養(yǎng)的研究［J］．口腔醫(yī)學(xué)，2007，27（8）：401－403．

R781．5

A

2095?6894（2015）08?117?02

2015－07－24；接受日期：2015－08－06

許斌．碩士．E?mail：xubin188＠126．com